CN113219095B - 腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱，本发明提供了一种腹可安片剂指纹图谱的构建方法，经大量实验和研究，确定了供试品溶液和对照品溶液的制备方法以及液相色谱测定中色谱条件的最优参数，由此构建出腹可安片剂的指纹图谱，本发明方法具有快速、准确，精密度，重复性和稳定性良好的特点，能快速、准确地鉴定腹可安片剂，为腹可安片剂质量的全面有效控制提供了有力保障。

Description

腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱
技术领域
本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术
指纹图谱是指某些复杂物质(比如中药)，某种生物体或某种组织或细胞的DNA、蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是一种建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性的方法。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，而建立中药指纹图谱就能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
建立中药指纹图谱技术有很多，包括薄层扫描法(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)、X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，同时绝大多数中药成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且已积累了较为丰富的应用经验，因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。
腹可安片剂中含有扭肚藤、救必应、车前草、石榴皮和火炭母等五味中药材。本品为糖衣片，除去糖衣后显褐棕色，味苦、涩。主要功效为清热利湿，收敛止痛，用于急性肠胃炎、消化不良引起的腹痛、腹泻和呕吐。腹可安片剂中扭肚藤及火炭母两味药材在药典中无记载，且扭肚藤为腹可安中含量最多的物质，因此通过指纹图谱技术对其主要成分进行研究有助于认识腹可安中的各成分并制定相应的质量控制标准。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱，本发明方法具有快速、准确，精密度，重复性和稳定性良好的特点，能快速、准确地鉴定腹可安片剂，为腹可安片剂质量的全面有效控制提供了有力保障。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了腹可安片剂指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别将紫丁香苷、异绿原酸b、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸制成浓度为0.06mg/mL的对照品溶液；
(2)腹可安片剂供试溶液的制备：
腹可安片剂去除糖衣层后，研磨成粉末，称取供试品粉末1g，加入50％甲醇30mL超声20min，补足溶剂至50mL，然后置于10000rpm、25℃条件下离心5min，过0.22um微孔滤膜，即得腹可安片剂供试溶液；
(4)指纹图谱的测定：
供试品溶液和对照品溶液分别以10000rpm的转速离心5分钟，然后精密吸取上清液10uL，过0.22um微孔滤膜后注入高效液相色谱仪中，按照高效液相色谱法，利用PDA检测器，对供试品与对照品同时进行检测，得到腹可安片剂的指纹图谱，其中流动相为：A泵：0.1％甲酸水；C泵：乙腈；梯度洗脱程序为：0-10min，C泵5％→10％；A泵95％→90％；10-20min，C泵10％→15％；A泵90％→85％；20-30min，C泵15％→20％；A泵85％→80％；30-60min，C泵20％→25％；A泵80％→75％；60-65min，C泵25％→5％；A泵75％→95％；理论塔板数按紫丁香苷计算不低于80000。
优选地，高效液相色谱仪的耐受压力为20MPa，色谱柱为welch XB-C18。
优选地，检测的波长为254-330nm，柱温为25-35℃，流速为0.5-2.0mL/min。
进一步地，检测的波长为280nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种腹可安片剂指纹图谱的构建方法，经大量实验和研究，确定了供试品溶液和对照品溶液的制备方法以及液相色谱测定中色谱条件的最优参数，由此构建出腹可安片剂的指纹图谱，本发明方法具有快速、准确，精密度，重复性和稳定性良好的特点，能快速、准确地鉴定腹可安片剂。本发明的优点具体表现在：
(1)本发明采用乙腈-0.1％甲酸水溶液洗脱系统，使腹可安中大部分有效成分得到了较好的分离，得到完整的HPLC谱图，确定了指纹图谱的条件；
(2)本发明方法所采用的供试品制备简单，色谱条件易于实现；该方法快速、准确，精密度，重复性和稳定性良好，色谱峰信息丰富且分离度好，所建立的指纹图谱能够有效地表征腹可安片剂的质量；
(3)本发明将腹可安片剂作为一个整体对待，通过该方法可获得腹可安片剂的标准指纹图谱，完善了腹可安片剂的质量评价体系，为腹可安片剂质量的全面、有效提供了理论和实践基础；
(4)本发明注重各个构成指纹图谱特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，继而避免了因测定个别化学成分而判定腹可安片质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
附图说明
图1为采用乙腈-1％磷酸水溶液系统构建得到的腹可安片剂指纹图谱；
图2为25℃柱温下构建得到的腹可安片剂指纹图谱；
图3为30℃柱温下构建得到的腹可安片剂指纹图谱；
图4为35℃柱温下构建得到的腹可安片剂指纹图谱；
图5为实施例3构建得到的腹可安片剂指纹图谱。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1采用液相色谱法建立腹可安片剂的指纹图谱
具体方法如下：
(1)对照品溶液的制备：
紫丁香苷，精密称量3.00mg，用50％的甲醇溶解，制成浓度为0.06mg/mL的对照品溶液；
异绿原酸b，精密称量2.00mg，用50％的甲醇溶解，制成浓度为0.04mg/mL的对照品溶液；
绿原酸，精密称量5.00mg，用甲醇溶解，制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液；
隐绿原酸，精密称量5.00mg，用甲醇溶解，制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液；
新绿原酸，精密称量5.00mg，用甲醇溶解，制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。
(2)腹可安片剂供试溶液的制备：
腹可安片剂去除糖衣层后，研磨成粉末备用，称取供试品粉末1g，置于50mL容量瓶中，加入50％甲醇30mL超声20min，补足溶剂(50％甲醇)至刻度，然后置于10000rpm、25℃条件下离心5min，过0.22um微孔滤膜，即得腹可安片剂供试溶液。
(3)指纹图谱的测定：
将供试品溶液和对照品溶液分别放于离心机中10000rpm离心5分钟，精密吸取上清液10uL，过0.22um微孔滤膜后注入高效液相色谱仪(岛津高效液相色谱仪，耐受压力为20MPa)，按照高效液相色谱法进行测定，利用PDA检测器(photo-diode array，二极管阵列检测器)，对供试品与对照品同时进行检测，得到腹可安片剂的指纹图谱。色谱条件及系统适应性试验如下：
色谱柱：welch XB-C18；
流动相：A泵：0.1％甲酸水；C泵：乙腈；
梯度洗脱程序：
0-10min，C泵5％→10％；A泵95％→90％；
10-20min，C泵10％→15％；A泵90％→85％；
20-30min，C泵15％→20％；A泵85％→80％；
30-60min，C泵20％→25％；A泵80％→75％；
60-65min，C泵25％→5％；A泵75％→95％；
检测波长：280nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
理论塔板数按紫丁香苷计算不低于80000。
实施例2色谱条件的优化
由于腹可安片剂为复方药剂，成分复杂，在确定本发明的色谱条件之前，进行多次优化实验，主要包括：
(1)洗脱系统的选择
除洗脱系统外，其他与实施例1色谱检测的基本步骤相同。考虑到腹可安中含有大量有机酸类，选用乙腈-酸水系统进行研究，比较了乙腈-水溶液系统、乙腈-1％磷酸水溶液系统、乙腈-0.1％甲酸水溶液系统、乙腈-0.5％醋酸水溶液系统的检测结果。结果显示乙腈-1％磷酸水溶液系统的紫丁香苷与绿原酸峰分离度不够(图1)，乙腈-0.5％醋酸水溶液系统存在单峰裂缝情况，乙腈-水溶液系统各成分的分离度相对较小，分离度较差，而乙腈-0.1％甲酸水溶液系统可以使腹可安中大部分有效成分得到了较好的分离并且测得多个标准品峰，完整行较好，因此选用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相的洗脱系统。
(2)柱温考察
除柱温条件外，其他与实施例1色谱检测的基本步骤相同。分别考察不同柱温(25℃、30℃、35℃)对检测图谱的影响。结果表明，柱温为25℃、30℃、35℃时，各个成分的分离度和色谱峰的对称性均较好，考虑到实验室和仪器的控温能力，选择柱温为30℃(图2、3、4)。
(3)检测波长的选择
除检测波长条件外，其他与实施例1色谱检测的基本步骤相同。使用PDA检测器对样品进行190-800nm全波长扫描，并对各波长的色谱图进行分析，提取吸收峰较多的三个波长(254nm、280nm、330nm)下的色谱图进行比较。结果显示280nm检测波长能较全面的反映腹可安片中的化学成分，且各色谱峰分离度较好，基线平稳，因此选择280nm作为腹可安片指纹图谱的采集波长。
实施例3供试品腹可安片剂指纹图谱的构建
(1)材料准备
10批供试品腹可安片剂(批号分别为：20180505、20180604、20180628、20180811、20180707、20181008、20180907、20180921、20181011、20181004)全由广东在田药业有限公司提供；紫丁香苷和异绿原酸b两种对照品购自成都普思生物科技有限公司；绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸对照品购自上海源叶生物科技有限公司。
采用实施例1的方法对不同批次的供试品腹可安片剂进行分析检测，获得指纹图谱。
将上述获得的腹可安片指纹图谱从仪器中导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中，选择不同批次腹可安片剂色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成腹可安片剂的对照指纹图谱；通过中药指纹图谱相似度评价系统软件导出指纹图谱相似度；计算各共有峰相对于3号峰的相对保留时间、相对峰面积。
如图5所示，所得指纹图谱中共有11个特征共有峰，其中2号峰为新绿原酸，3号峰为紫丁香苷，4号峰为绿原酸，5号峰为隐绿原酸，9号峰为异绿原酸b。
各号峰的相对保留时间为：
1号峰：0.36、2号峰：0.76、4号峰：1.03、5号峰：1.11、6号峰：1.15、7号峰：1.30、8号峰：1.98、9号峰：2.01、10号峰：2.08、11号峰：2.27。
各号峰的相对峰面积为：1号峰：1.47、2号峰：0.47、4号峰：0.95、5号峰：0.48、6号峰：0.46、7号峰：0.24、8号峰：0.76、9号峰：0.58、10号峰：0.43、11号峰：0.79。
以对照指纹图谱为参照计算相似度，如表1所示，10批腹可安片剂的指纹图谱相似度均在0.94以上，因此暂定腹可安片指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
表1腹可安片剂供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度
Figure BDA0003053607570000061
实施例4方法学考察
(1)精密度
取腹可安供试液，进样6针，每次进样量为10uL，以3号峰(紫丁香苷对照峰)作为参照，计算其余10个峰的相对保留时间和相对峰面积，得到11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果相对峰面积的RSD为0.1％-1.2％，相对保留时间的RSD为0.03％-0.25％，表明精密度良好。
(2)重复性
取1批腹可安片剂，制6份供试品，分别进样，以3号峰(紫丁香苷对照峰)作为参照，计算其余10个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果相对峰面积的RSD值为0.9％-3.02％，相对保留时间的RSD为0.006％-0.04％，表明方法重复性好。
(3)稳定性
取同一个腹可安供试品，分别在0h、2h、4h、8h、12h和24h进行检测，以3号峰(紫丁香苷对照峰)作为参照，计算其余10个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，得出11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果相对峰面积RSD为0.6％-2.8％，相对保留时间的RSD为0.03％-0.16％，表明方法的稳定性好。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.腹可安片剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对照品溶液的制备：
分别将紫丁香苷、异绿原酸b、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸制成浓度为0.06mg/mL的对照品溶液；
(2)腹可安片剂供试溶液的制备：
腹可安片剂去除糖衣层后，研磨成粉末，称取供试品粉末1g，加入50％甲醇30mL超声20min，补足溶剂至50mL，然后置于10000rpm、25℃条件下离心5min，过0.22 μ m 微孔滤膜，即得腹可安片剂供试溶液；
(4)指纹图谱的测定：
供试品溶液和对照品溶液分别以10000rpm的转速离心5分钟，然后精密吸取上清液10μ L ，过0.22 μ m 微孔滤膜后注入高效液相色谱仪中，按照高效液相色谱法，利用PDA检测器，对供试品与对照品同时进行检测，得到腹可安片剂的指纹图谱，其中流动相为：A泵：0.1％甲酸水；C泵：乙腈；梯度洗脱程序为：0-10min，C泵5％→10％；A泵95％→90％；10-20min，C泵10％→15％；A泵90％→85％；20-30min，C泵15％→20％；A泵85％→80％；30-60min，C泵20％→25％；A泵80％→75％；60-65min，C泵25％→5％；A泵75％→95％；理论塔板数按紫丁香苷计算不低于80000，高效液相色谱仪的耐受压力为20MPa，色谱柱为welchXB-C18，检测的波长为254-330nm，柱温为25-35℃，流速为0.5-2.0mL/min。
2.根据权利要求1所述的腹可安片剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，检测的波长为280nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。
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