CN114252541B - 一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、色谱条件优化和确定、多指标定量测定、指纹图谱测定，以及指纹图谱分析处理。在定量方面，采用柚皮苷为内参物进行一测多评，建立其与绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，通过相对校正因子计算该5种指标成分含量，与外标法检测结果比较差异较小。此外，直接通过外标法计算槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖‑7‑O‑β‑D‑龙胆双糖苷、连翘苷含量。在指纹图谱方面，在尽可能短的分离时间内得到更多的指纹图谱特征峰。该方法为该口服液质量控制评价提供了更有效、更全面的方法依据。

Description

一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量 含量测定方法

技术领域

本发明涉及超高效液相色谱利用领域以及中药制剂分析质量控制领域，具体地，涉及一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，尤其涉及一种基于色谱柱串联的改进的小儿消积止咳口服液UHPLC指纹图谱及一测多评法多指标定量的构建方法以及由此方法得到的指纹图谱在小儿消积止咳口服液的质量控制中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

小儿消积止咳口服液由炒山楂、槟榔、枳实、蜜枇杷叶、瓜蒌、炒莱菔子、炒葶苈子、桔梗、连翘、蝉蜕十味中药材制成，具有清热肃肺、消积止咳的功能，用于小儿饮食积滞、痰热蕴肺所致的咳嗽、夜间加重、喉间鸣痰、腹胀、口臭，具有确切的临床疗效，收载于《中国药典》2020年版一部。

目前，现行2020版中国药典中小儿消积止咳口服液的质量标准中只有辛弗林作为含量测定指标，标准中的质量控制方法对于处方复杂、成分繁多的小儿消积止咳口服液不能全面反映其质量。中药指纹图谱在中药质量控制和药效成分研究等方面具有重要作用，具有信息量大、特征性强、整体性和系统性等特点。能较全面的反映药材所含化学成分的相对关系，能对中药内在质量进行有效表征和整体评价。梁琰等虽对小儿消积止咳口服液多指标成分分析及其HPLC指纹图谱进行了研究，但一针140min，时间较长，指纹图谱共有峰不够多，用外标法进行多指标定量，具有对照品难得，检验周期长、耗能、耗时的特点。

一测多评法通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系法，测定一个成分(对照品易得、价廉、有效)实现多个成分(对照品价格较高或不易得到) 同步测定；解决了中药多指标定量中存在的对照品缺乏问题，可实现多指标同步质量控制。陆林玲等虽以柚皮苷为内标，同时测定橙皮苷、新橙皮苷的一测多评法进行小儿消积止咳口服液的定量分析，但一测多评定量指标较少，不能对一些具有抗菌消炎作用的有效组分进行同步一测多评定量。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，发明人在前述研究的基础上进一步改进优化，针对小儿消积止咳口服液作为一种中药复方制剂，由10味处方药材组成、成分非常复杂多样的特点，通过研究实验，进一步对小儿消积止咳口服液中其他8 个含量较多的组分，或单味中药材的特征性成分进行有效分离，使其形成分离时间短、特征峰多且能有效表征制剂质量的指纹图谱。并且根据现有技术的不足提供一种采用一测多评法与外标法相结合测定小儿消积止咳口服液8种组分含量的方法，该方法简单、准确、操作方便、实用性高，采用该方法能实现小儿消积止咳口服液中绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷 A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷含量的同步测定，从而为保证临床用药安全和有效提供科学依据。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，包括：

取小儿消积止咳口服液，加入甲醇、过滤，得到供试品溶液；

取绿原酸对照品，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、连翘脂苷A对照品、金丝桃苷对照品、橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、连翘苷对照品，加入甲醇制成混合对照品溶液；

将供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱分离检测，色谱柱由C18 柱串联C8柱形成，得到供试品溶液的特征图谱；

以柚皮苷为内参物，计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，采用一测多评法通过相对校正因子计算出小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，用外标法计算槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘苷的含量；

对超高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理，即得小儿消积止咳口服液指纹图谱。

本发明的第二个方面，提供了上述的方法构建的指纹图谱。

本发明的第三个方面，提供了上述的指纹图谱在小儿消积止咳口服液的质量控制中的应用，包括：

取多个批次的小儿消积止咳口服液按照上述构建方法得到小儿消积止咳口服液样品指纹图谱，将该多个批次小儿消积止咳口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

将待检测样品指纹图谱与小儿消积止咳口服液对照指纹图谱进行相似性比较，若相似度不低于0.850，则判定为待检测样品质量合格。

本发明的有益效果在于：

(1)与现有的单一C18柱建立的小儿消积止咳口服液指纹图谱相比，本发明将不同极性固定相的超高效色谱柱(C18和C8色谱柱)直接串联，在总柱长并未明显变化甚至总柱长更短的条件下，建立了小儿消积止咳口服液指纹图谱及多指标定量的改进方法，通过梯度洗脱方式，在不同极性柱上能改善特征性成分的分离选择性，进而提高分离能力，使得到更多指纹图谱特征峰(峰容量较大)。

(2)本发明采用一测多评法进行多指标定量，节约对照品，节省分析时间。总之，此方法能更全面的反应小儿消积止咳口服液的物质成分信息，有效表征该制剂质量。而且本发明所述方法简便易行，所有检测的组分均在45min内被分离，精密度高、重复性及稳定性好，得到的指纹图谱特征峰多，能全面客观的评价小儿消积止咳口服液质量，可用于小儿消积止咳口服液的质量控制。

(3)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明基于色谱柱串联建立的11批小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱；

图2为本发明基于色谱柱串联建立的8组分混合对照品溶液在327nm和 277nm下的HPLC色谱图；

图3为本发明基于色谱柱串联建立的11批小儿消积止咳口服液生成的对照指纹图谱；

图4为本发明基于单柱建立的3批小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱；

图5为本发明基于双柱串联建立的3批小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱；

图6为本发明基于单柱与双柱串联建立的同一批小儿消积止咳口服液HPLC 指纹图谱；

图7为本发明基于单柱与双柱串联建立的同一批小儿消积止咳口服液HPLC 指纹图谱局部放大图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

诚如背景技术所述，目前小儿消积止咳口服液指纹图谱及多指标定量分离时间较长分离能力有限，对复杂样品往往不能达到理想的分离效果，本发明针对现有固定相色谱柱建立指纹图谱及多指标定量过程中分析时间较长、分离能力不足以及峰容量较小的问题，提供一种基于色谱柱串联的小儿消积止咳口服液指纹图谱构建改进方法，并建立了相应的指纹图谱及一测多评定量检测方法。本发明通过对不同极性色谱柱直接串联组合的研究，提供了一种分离能力更好、峰容量更多、操作较为简便的小儿消积止咳口服液色谱柱串联构建方法，为提升和完善小儿消积止咳口服液的质量控制技术提供参考。

本发明的一个具体实施方式中公开了一种小儿消积止咳口服液指纹图谱及多指标定量的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取小儿消积止咳口服液，加入甲醇，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷对照品，加入甲醇制成混合对照品溶液；

(3)指纹图谱测定：分别精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪经 UHPLC分离检测，流动相的组成为乙腈-0.4％醋酸水溶液，采用梯度洗脱，色谱柱由C18柱串联C8柱形成，用指纹图谱软件对超高效液相色谱测定所得指纹图谱进行分析处理，即得小儿消积止咳口服液指纹图谱。

(4)多指标定量测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，在上述(3) 指纹图谱测定色谱条件下测定，供试品溶液的特征图谱中呈现绿原酸、槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷的峰值，以柚皮苷为内参物，采用一测多评法通过相对校正因子计算出小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，用外标法计算槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘苷的含量；

在一些实施例中，本发明所述步骤(1)中，多指标定量供试品溶液的制备方法为：精密量取1ml小儿消积止咳口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.22μm有机系滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液；指纹图谱供试品溶液的制备方法为：精密量取1ml小儿消积止咳口服液于2ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.22μm有机系滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液；

在一些实施例中，本发明所述步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：分别精密称取绿原酸标准品10.977mg、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷标准品10.776mg、连翘脂苷A标准品10.503mg、金丝桃苷标准品5.153mg、橙皮苷标准品5.212mg、柚皮苷标准品10.604mg、新橙皮苷标准品10.266mg、连翘苷标准品10.264mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

在一些实施例中，本发明步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为Agilent SB-Aq 与Agilent Eclipse Plus C8色谱柱串联形成。

在一些实施例中，其中一根为C18柱(Agilent SB-Aq色谱柱(1.8μm， 50*4.6mm；即填料粒径为1.8μm，柱长为50mm，柱内径为4.6mm))，另一根为C8柱，(Agilent Eclipse PlusC8色谱柱(1.8μm，100*3.0mm；即填料粒径为 1.8μm，柱长为100mm，柱内径为3.0mm))；流动相A为0.4％醋酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱；流动相流速为0.4ml/min；检测波长为254nm、277nm、 327nm，其中254nm为指纹图谱检测波长，277nm为连翘苷外标法定量检测波长，327nm为绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷一测多评法定量及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷外标法定量检测波长；柱温为30℃；串联顺序是Agilent SB-Aq柱在前，Agilent Eclipse Plus C8柱在后。

其中，梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：0-10min，流动相 A95％-85％，流动相B5％-15％；10-35min，流动相A85％-70％，流动相B15％-30％； 35-40min，流动相A70％-40％，流动相B30％-60％；40-41min，流动相A40％-20％，流动相B60％-80％；41-45min，流动相A20％-20％，流动相B80％-80％。

在一些实施例中，本发明步骤(3)中，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为5μl。

在本发明指纹图谱及多指标定量方法的建立过程中，为了得到尽可能多的指纹图谱特征峰、更大的峰容量、各定量指标间较好的分离度、峰形等，通过科学实验对不同长度性质的色谱柱串联组合、检测波长、色谱条件、流速、进样量等进行了优选。

本发明考察了多种色谱柱串联组合的选择:试验了Waters Atlantis T3(3μm，150×4.6mm)串联Waters SymmetryShield^TM RP8(3.5μm，150×4.6mm),Waters AtlantisT3(3μm，150×4.6mm)串联Waters SymmetryShield^TM RP18(3.5μm， 150×4.6mm),AgilentSB-Aq(1.8μm，50×4.6mm)串联Agilent Eclipse Plus C8(1.8μm， 100×3.0mm),AgilentSB-Aq(1.8μm，50×4.6mm)串联Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，50×2.1mm)。结果表明：串联顺序是Agilent SB-Aq柱在前，Agilent Eclipse Plus C8柱在后。Agilent SB-Aq串联Agilent Eclipse Plus C8时分离度、分离能力得到明显提高，可将口服液成分进一步分离，得到较多的色谱峰。

高效液相色谱中影响物质分离度的因素有多种，包括柱效、选择性、容量因子等，本发明着重考察了选择性的因素来提高小儿消积止咳口服液中成分的有效分离，本发明通过串联超高效液相色谱柱，在总柱长并未明显变化甚至相较于有关文献及专利总柱长变短的条件下，在不同极性的色谱柱上，通过分离选择性的改进提高了分离度，增大了峰容量，使8个定量指标间分离良好，得到的指纹图谱更能全面反映小儿消积止咳口服液的物质成分信息，可以有效表征该制剂质量。

本发明考察了色谱条件的选择：试验了流动相乙腈-醋酸水、乙腈-三氟乙酸水对色谱分离效果的影响。试验结果表明：流动相乙腈-醋酸水色谱分离效果较好，基线平稳，分离度、峰形较好，柱效最佳，因此流动相确定为：A相(0.4％醋酸水)-B相(乙腈)。并对梯度洗脱条件进行优化，各色谱峰保留时间适中，确定了合适的检测时间为45分钟。

本发明考察了不同流速(0.3ml/min，0.4ml/min，0.5ml/min，0.6ml/min及0.7ml/min)、柱温(如30℃、35℃、40℃、45℃)、进样量(1μl、2μl、4μl、5μl、 6μl、8μl、10μl、15μl、20μl、30μl、40μl、50μl)、检测波长(包括215nm，230nm， 254nm，277nm，327nm，360nm)对指纹图谱及多指标定量的影响，结果表明在流动相流速为0.4ml/min、柱温为35℃、进样量5μl条件下分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，在254nm下色谱峰较多，信息量较大，适合作为指纹图谱检测波长；在277nm下连翘苷响应较大，但其他定量指标与连翘苷响应强度比例较大，故作为连翘苷外标法检测波长；在327nm下绿原酸、槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷响应强度比例适中，尤其含量较少的绿原酸响应较大，故作为绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷多指标定量的波长。

所测定的小儿消积止咳口服液指纹图谱得到的共有特征峰为55个，以柚皮苷峰为参照，其相对保留时间分别为：

0.0964、0.1133、0.1782、0.2077、0.2252、0.2492、0.2753、0.2887、0.3137、0.3525、 0.3700、0.3769、0.3838、0.4301、0.4438、0.4515、0.4589、0.4876、0.5037、0.5088、 0.5261、0.5353、0.5478、0.5749、0.5952、0.6090、0.6211、0.6340、0.6684、0.6822、0.7433、0.7623、0.7806、0.7906、0.8128、0.8244、0.8429、0.8582、 0.8948、0.9024、0.9333、0.9486、0.9904、1.0000、1.0256、1.0788、1.0908、1.1169、 1.1242、1.1448、1.2074、1.2808、1.2927、1.3610、1.4190。

本发明的具体实施方式中还公开了上述构建方法构建的指纹图谱的应用。

基于该应用，本发明公开了一种小儿消积止咳口服液的质量控制方法，所述方法包括：

(1)取多个批次的小儿消积止咳口服液按照上述构建方法得到小儿消积止咳口服液样品指纹图谱，将该多个批次(一般10个批次以上)小儿消积止咳口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

(2)将待检测样品指纹图谱与小儿消积止咳口服液对照指纹图谱进行相似性比较，采用向量夹角余弦法进行相似性比较，与小儿消积止咳口服液对照指纹图谱相比，相似度不低于0.850为待检测样品质量合格。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：基于双柱串联的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建、应用及多指标定量

色谱条件为：色谱柱为Agilent SB-Aq色谱柱(1.8μm，50*4.6mm)串联AgilentEclipse Plus C8色谱柱(1.8μm，100*3.0mm)；流动相：流动相A为0.4％醋酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；流速0.4ml/min，柱温30℃，检测波长254nm、277nm、327nm，其中254nm为指纹图谱检测波长，277nm为连翘苷外标法定量检测波长，327nm为绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷一测多评法定量及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷外标法定量的检测波长；进样量5μl，理论塔板数按柚皮苷色谱峰计算不低于 50000，所有组分均在45min内被检测完。其中，流动相线性梯度如表1所示；

表1色谱流动相梯度洗脱条件

(1)指纹图谱供试品溶液的制备：精密量取1.0ml小儿消积止咳口服液于 2ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得稀释2倍的供试品溶液。

(2)多指标定量供试品溶液的制备：精密量取1.0ml小儿消积止咳口服液于 10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得稀释10 倍的供试品溶液；

(3)对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸标准品10.977mg、槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷标准品10.776mg、连翘脂苷A标准品 10.503mg、金丝桃苷标准品5.153mg、橙皮苷标准品5.212mg、柚皮苷标准品 10.604mg、新橙皮苷标准品10.266mg、连翘苷标准品10.264mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

(4)图谱测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl，注入超高效液相色谱仪，测定11个批次的小儿消积止咳口服液和对照品含量测定图谱及指纹图谱。

供试品溶液的特征图谱中呈现绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷的峰值，以柚皮苷为内参物，计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，采用一测多评法通过相对校正因子计算出小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，用外标法计算槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘苷的含量；

相对校正因子的计算方法为：分别吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，分别置1.0mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按上述色谱条件测定，分别进样5μL，测定小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积，以柚皮苷为内参物，按照相对校正因子计算公式如下：

f_ai＝f_a/f_i＝(A_a/c_a)/(A_i/c_i)，

计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子f_ai，式中用对照品来计算，A_a为内参物柚皮苷的峰面积，c_a为内参物柚皮苷的浓度， A_i为某待测成分峰面积；c_i为某待测成分浓度；相对校正因子f_ai为各实验所得数据的平均值。

用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得图谱进行分析处理，即得11批小儿消积止咳口服液指纹图谱(如图1)。图谱共有55个共有特征峰，以柚皮苷峰为参照(44号峰)，其相对保留时间分别为：0.0964、0.1133、0.1782、0.2077、 0.2252、0.2492、0.2753、0.2887、0.3137、0.3525、0.3700、0.3769、0.3838、0.4301、 0.4438、0.4515、0.4589、0.4876、0.5037、0.5088、0.5261、0.5353、0.5478、 0.5749、0.5952、0.6090、0.6211、0.6340、0.6684、0.6822、0.7433、0.7623、 0.7806、0.7906、0.8128、0.8244、0.8429、0.8582、0.8948、0.9024、0.9333、 0.9486、0.9904、1.0000、1.0256、1.0788、1.0908、1.1169、1.1242、1.1448、1.2074、1.2808、1.2927、1.3610、1.4190。混合对照品的指纹图谱如图2所示，1-8号色谱峰分别为绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷。

将所测的11批小儿消积止咳口服液(批号：04191632、04191682、04192312、04192372、04192472、04192592、04200172、04200222、04200352、04200432、 04200682)图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件分析，进行色谱峰匹配。以04200352批作为参照图谱，生成的对照指纹图谱为R(采用平均法，见图3)。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表2。

表2 11个批次小儿消积止咳口服液指纹图谱的相似度值

	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	R
													S1	1.000	0.997	0.996	0.995	0.996	0.992	0.985	0.985	0.987	0.982	0.988	0.995
S2	0.997	1.000	0.994	0.994	0.993	0.993	0.986	0.986	0.988	0.982	0.989	0.995
													S3	0.996	0.994	1.000	0.998	0.999	0.994	0.989	0.990	0.991	0.989	0.992	0.997
S4	0.995	0.994	0.998	1.000	0.998	0.993	0.986	0.989	0.989	0.987	0.991	0.996
													S5	0.996	0.993	0.999	0.998	1.000	0.994	0.989	0.990	0.991	0.990	0.993	0.997
S6	0.992	0.993	0.994	0.993	0.994	1.000	0.995	0.996	0.995	0.992	0.995	0.998
													S7	0.985	0.986	0.989	0.986	0.989	0.995	1.000	0.998	0.998	0.996	0.997	0.996
S8	0.985	0.986	0.990	0.989	0.990	0.996	0.998	1.000	0.998	0.997	0.997	0.997
													S9	0.987	0.988	0.991	0.989	0.991	0.995	0.998	0.998	1.000	0.997	0.996	0.997
S10	0.982	0.982	0.989	0.987	0.990	0.992	0.996	0.997	0.997	1.000	0.997	0.995
													S11	0.988	0.989	0.992	0.991	0.993	0.995	0.997	0.997	0.996	0.997	1.000	0.997
R	0.995	0.995	0.997	0.996	0.997	0.998	0.996	0.997	0.997	0.995	0.997	1.000

由表2可以看出，S1到S11相似度均较高，在0.982以上。

实施例2：指纹图谱测定方法学考察

指纹图谱方法学考察主要考察了精密度、稳定性和重复性，考察方法和结果如下：

(1)精密度实验：取同一批次小儿消积止咳口服液样品，经预处理后，在最优色谱条件下，采用双柱直接串联法，连续测定6次，记录色谱图，结果见表 3。由表3可见，各主要色谱峰其相对保留时间比值无明显变化，RSD为 0.013％～0.45％。各主要色谱峰峰面积RSD为0.1％～4.7％，RSD＜5.0％，说明仪器的精密度良好。

(2)稳定性实验：取同一批批次小儿消积止咳口服液样品，经预处理后，在最优色谱条件下，采用双柱直接串联法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、18h 和24h进样分析，记录色谱图，结果见表3。由表3可见，各主要色谱峰的保留时间和峰面积比值无明显变化，RSD％分别为0.155％～2.56％和0.2％～4.8％，说明供试品溶液的成分在24h内稳定。

(3)重复性实验：取6份同一批次的小儿消积止咳口服液样品，经预处理后，在最优的色谱条件下，采用双柱直接串联法，分别进样分析，记录色谱图，结果见表3。各共有色谱峰保留时间和峰面积无明显变化，RSD分别为 0.050％～0.74％和0.7％～5.0％，RSD≤5.0％，说明该实验方法的重复性较好。

表3小儿消积止咳口服液指纹图谱方法学验证结果

实施例3：基于双柱串联的小儿消积止咳口服液指纹图谱与单柱指纹图谱分离效果的对比

1.单一Agilent SB-Aq色谱柱与串联双柱建立的小儿消积止咳口服液指纹图谱对比；

单一Agilent SB-Aq色谱柱色谱条件为：色谱柱为Agilent SB-Aq色谱柱(1.8μm，50*4.6mm)；流动相：流动相A为0.04％醋酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；柱温35℃，检测波长254nm，流速及流动相线性梯度如表4所示；

表4色谱流动相梯度洗脱条件

时间(min)	流速(ml/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.4	100	0
5	0.4	97	3
				10	0.4	90	10
35	0.4	70	30
				40	0.4	60	40
42	0.6	20	80
				50	0.6	20	80

供试品溶液的制备：取三个批次小儿消积止咳口服液，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。

图谱测定：精密吸取供试品溶液3μl，注入超高效液相色谱仪，测定得到小儿消积止咳口服液指纹图谱，如图4所示S1、S2、S3三个图谱。

为试验双柱串联分离能力，在优化至最佳色谱条件下，与使用单柱Agilent SB-Aq色谱柱比较，采用双柱串联测定混合标准溶液和三个批次的小儿消积止咳口服液，得到了3个批次的小儿消积止咳口服液指纹图谱，如图5所示S1、 S2、S3三个图谱，其与双柱峰容量对比结果见表5。选取其中一个批次色谱图与双柱同批次色谱图进行比较(见图6，图6中a为单柱图谱，图6中b为双柱串联图谱)，局部放大图如图7所示，图7中b为双柱图谱，图7中c为单柱串联图谱。对8个指标成分间进行了分离度比较和说明，结果见表6。

表5双柱与单柱峰容量结果

表6双柱与单柱对八种指标成分之间的分离度对比

由表5可得单柱与双柱串联建立的指纹图谱峰容量结果，批次1单柱得到色谱峰65个，而双柱串联测定同一样品得到色谱峰73个；批次2单柱得到色谱峰 69个，双柱串联测定得到色谱峰75个；批次3单柱得到色谱峰66个，双柱串联测定得到色谱峰78个；峰容量均增加。

由表6可看出双柱串联测得的8种指标成分间的分离度均大于单柱，且在单柱中无法达到完全分离的柚皮苷与橙皮苷在双柱串联中达到完全分离。综合表5 与表6，在相同色谱条件下，双柱串联和单柱相比特征成分的分离度得到改善，指纹图谱的峰容量得到提高，能够获得更多的色谱峰，说明双柱串联比单柱具有更强的分离能力。

2.专利(CN 103954719 A)小儿消积止咳口服液指纹图谱建立法与双柱串联法分离效果对比

在专利(CN 103954719 A)小儿消积止咳口服液指纹图谱建立法发明条件下测定三个批次样品。

色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18(4.6*250mm,5μm)柱；流动相：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长203nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，梯度洗脱如表7所示：

表7色谱流动相梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)
			0	98	2
40	70	30
			50	60	40

供试品溶液的制备：精密量取小儿消积止咳口服液1ml，置于5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22μm有机系滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

图谱测定：精密吸取供试品溶液5μl，注入超高效液相色谱仪，测定得到小儿消积止咳口服液指纹图谱。

为试验双柱串联分离能力，将双柱串联法与使用单柱Kromasil C18色谱柱比较，测定混合标准溶液和三个批次的小儿消积止咳口服液，得到了3个批次的小儿消积止咳口服液指纹图谱，其峰容量对比结果见表8。对8个指标成分间进行了分离度比较和说明，结果见表9。

表8双柱与专利CN 103954719 A峰容量结果

表9双柱与专利CN 103954719 A对八种指标成分之间的分离度对比

由表8可得专利CN 103954719 A与双柱串联建立的指纹图谱峰容量结果，批次1专利CN 103954719 A得到色谱峰56个，而双柱串联测定同一样品得到色谱峰73个；批次2专利CN 103954719 A得到色谱峰51个，双柱串联测定得到色谱峰75个；批次3专利CN 103954719A得到色谱峰54个，双柱串联测定得到色谱峰78个；峰容量均增加。

由表9可看出双柱串联测得的8种指标成分分离度均大于1.5，达到完全分离，且在专利CN 103954719 A中无法达到完全分离的连翘脂苷A与金丝桃苷在双柱串联中达到完全分离。综合表8与表9，在相同色谱条件下，双柱串联和专利CN 103954719 A相比特征成分的分离度得到改善，指纹图谱的峰容量得到提高，能够获得更多的色谱峰，说明双柱串联具有更强的分离能力。

实施例4：多指标定量测定方法学考察

多指标定量方法学考察了专属性、精密度、稳定性、重复性、定量限、检测限、线性与范围、准确度，考察方法和结果如下：

(1)专属性实验：取空白溶液、各对照品定位溶液、混合对照品溶液、供试品溶液，分别进样，记录色谱图，空白溶剂均无干扰，对照品溶液与供试品溶液的主峰保留时间基本一致。

(2)精密度实验：取混合对照品溶液，按照色谱条件，采用双柱直接串联法，连续测定6次，记录色谱图，结果见表10。由表可见，绿原酸、槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷色谱峰出峰时间RSD为0.1％～0.2％，峰面积RSD为0.3％～0.8％，说明仪器的精密度良好。

(3)稳定性实验：取S9号小儿消积止咳口服液样品，经预处理后，按照色谱条件，采用双柱直接串联法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、18h和24h进样分析，记录色谱图，结果见表10。由表10可见，绿原酸、槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷色谱峰的保留时间RSD为0.1％～0.2％，峰面积RSD为0.9％～2.9％，说明供试品溶液的成分在24h内稳定。

(4)重复性实验：取6份S9号小儿消积止咳口服液样品，经预处理后，按照色谱条件，采用双柱直接串联法，分别进样分析，记录色谱图，结果见表 10。绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷色谱峰保留时间无明显变化，RSD 为0.1％～0.9％，连翘脂苷A、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、连翘苷峰面积RSD 为0.7％～2.1％，RSD较小，绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、金丝桃苷峰面积RSD为7.7％～10.0％，是由于此三种组分在样品中含量较少峰面积较小所致。该实验方法的重复性较好。

表10小儿消积止咳口服液多指标定量精密度、稳定性、重复性方法学验证结果

(5)定量限和检测限：取混合对照品溶液，逐级稀释，当各低浓度成分测出的信号与空白溶液测出的信号比较，信噪比约为10:1和3:1时确定为定量限和检测限。结果见表11。

表11小儿消积止咳口服液多指标定量检测限、定量限方法学验证结果

(6)线性与范围：分别吸取混合对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6ml，分别置于2.0ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按本发明所限定的色谱条件测定，分别进样5μl，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，经线性回归范围考察结果见表12。由结果可得：在本次实验中线性范围考察良好。

表12小儿消积止咳口服液多指标定量线性范围方法学验证结果

(7)加样回收试验：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、绿原酸对照品、连翘脂苷A对照品、金丝桃苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、连翘苷对照品，分别置量瓶中，加已用甲醇稀释10倍且测定含量的小儿消积止咳口服液超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得回收率溶液，按照色谱条件测定，并记录上述八个定量指标的峰面积并计算回收率，由结果可得回收率在98％～103％之间，加样回收试验考察良好。结果见表13。

表13小儿消积止咳口服液多指标定量加样回收试验方法学验证结果

实施例5：多指标定量中待测组分一测多评法相对校正因子计算、系统耐用性考察及一测多评法与外标法含量测定结果比较

(1)一测多评法相对校正因子的计算

在本发明限定的色谱条件下，分别吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml，分别置于1.0ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液，以柚皮苷为内标，测定小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积，按照相对校正因子计算公式计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，结果见表14，相对校正因子取平均值。按下式计算f_ai＝f_a/f_i＝(A_a/c_a)/(A_i/c_i)，式中用对照品来计算，A_a为内参物(柚皮苷)峰面积，c_a为内参物(柚皮苷)浓度，A_i为某待测成分峰面积，c_i为某待测成分浓度。

表14以柚皮苷为内标的相对校正因子

(2)系统耐用性的考察

在本发明限定的色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液，为考察耐用性改变色谱条件，计算对照品中待测成分含量的相对校正因子、相对保留值，以验证一测多评法的应用。

①不同进样量考察：考察4、5、6μl不同进样量对相对校正因子的影响，结果见表15。不同进样量对绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷影响均不显著，耐用性良好。

表15不同进样量的相对校正因子

②不同色谱柱考察：选择Agilent SB-Aq(1.8μm，50×4.6mm)色谱柱、Agilent SB-Aq色谱柱(1.8μm，50*4.6mm)串联Agilent Eclipse Plus C8色谱柱(1.8μm， 100*3.0mm)，考察相对校正因子的影响，结果见表16。可知不同色谱柱对绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷影响程度不明显，耐用性良好。

表16不同色谱柱对相对校正因子的影响

③不同柱温考察：考察30、35、40℃柱温对相对校正因子和相对保留值的影响，结果见表17。不同柱温对其影响程度不明显，耐用性良好。

表17不同柱温对相对校正因子和相对保留值的影响

④不同波长考察：考察325nm、327nm、329nm波长对相对校正因子和相对保留值的影响，结果见表18。不同波长对其影响程度不明显，耐用性良好。

表18不同波长对相对校正因子和相对保留值的影响

⑤一测多评法与外标法含量测定结果比较

经方法学优化和考察后，采用以上建立的一测多评方法，对15批小儿消积止咳口服液中的绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量进行了测定，按照本发明的测定方法进行测定，分别测定绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量。采用外标法和相对校正因子进行比较，结果见表19、表20。

为验证一测多评法“QAMS”方法的准确性，对“QAMS”法的测定结果与外标法的测定结果进行了比较。以准确度来评价所建立的一测多评方法的可行性，准确度由以下公式计算：准确度(％)＝CS/CE×100％，其中，CS表示一测多评法计算所得的含量，CE表示通过外标法计算所得的含量。

表19一测多评法(QAMS)和外标法所得结果比较(mg/ml)

表20一测多评法(QAMS)和外标法所得结果比较(mg/ml)

实验结果：本次实验采用一测多评法测定15批小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量，结果显示柚皮苷、橙皮苷、连翘脂苷A、新橙皮苷含量较高，绿原酸、金丝桃苷的含量相对较低。此外，一测多评法与外标法检测结果差异较小。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，包括：

取小儿消积止咳口服液，加入甲醇、过滤，得到供试品溶液；

取绿原酸对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品、连翘脂苷A对照品、金丝桃苷对照品、橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、连翘苷对照品，加入甲醇制成混合对照品溶液；

将供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱分离检测，色谱柱由C18柱串联C8柱形成，得到供试品溶液的特征图谱；

以柚皮苷为内参物，计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，采用一测多评法通过相对校正因子计算出小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，用外标法计算槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、连翘苷的含量；

对超高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理，即得小儿消积止咳口服液指纹图谱；

采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的变化为：0-10min，流动相A 95％-85％，流动相B5％-15％；10-35min，流动相A 85％-70％，流动相B15％-30％；35-40min，流动相A 70％-40％，流动相B 30％-60％；40-41min，流动相A 40％-20％，流动相B 60％-80％；41-45min，流动相A 20％-20％，流动相B 80％-80％；

流动相A为0.4～0.6％醋酸水溶液，流动相B为乙腈。

2.如权利要求1所述的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，流动相流速为0.4～0.6ml/min；柱温为30～32℃；检测波长包括：254nm、277nm、327nm。

3.如权利要求1所述的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，所述指纹图谱中的共有峰为55个。

4.如权利要求3所述的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，55个共有特征峰，以柚皮苷为参照，其相对保留时间分别为：

0.0964、0.1133、0.1782、0.2077、0.2252、0.2492、0.2753、0.2887、0.3137、0.3525、0.3700、0.3769、0.3838、0.4301、0.4438、0.4515、0.4589、0.4876、0.5037、0.5088、0.5261、0.5353、0.5478、0.5749、0.5952、0.6090、0.6211、0.6340、0.6684、0.6822、0.7433、0.7623、0.7806、0.7906、0.8128、0.8244、0.8429、0.8582、0.8948、0.9024、0.9333、0.9486、0.9904、1.0000、1.0256、1.0788、1.0908、1.1169、1.1242、1.1448、1.2074、1.2808、1.2927、1.3610、1.4190。

5.如权利要求1所述的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，相对校正因子的计算方法为：分别吸取不同体积混合对照品溶液，分别置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，进行超高效液相色谱分离检测，测定小儿消积止咳口服液中绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积，以柚皮苷为内参物，按照相对校正因子计算公式如下：

f_ai＝f_a/f_i＝(A_a/c_a)/(A_i/c_i)，

计算绿原酸、连翘脂苷A、金丝桃苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子f_ai，式中用对照品来计算，A_a为内参物柚皮苷的峰面积，c_a为内参物柚皮苷的浓度，A_i为某待测成分峰面积；c_i为某待测成分浓度；相对校正因子f_ai为各实验所得数据的平均值。

6.如权利要求1所述的小儿消积止咳口服液指纹图谱的构建方法及多指标定量含量测定方法，其特征在于，多指标定量供试品溶液的体积浓度为10～12％；所述指纹图谱供试品溶液的体积浓度为50～55％。

7.权利要求1-6任一项所述的方法构建的指纹图谱在小儿消积止咳口服液的质量控制中的应用。

8.一种小儿消积止咳口服液的质量鉴别方法，其特征在于，包括：

取多个批次的小儿消积止咳口服液按照权利要求1-6任一项构建方法得到小儿消积止咳口服液样品指纹图谱，将该多个批次小儿消积止咳口服液样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照权利要求1-6任一项构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

将待检测样品指纹图谱与小儿消积止咳口服液对照指纹图谱进行相似性比较，若相似度不低于0.850，则判定为待检测样品质量合格。

9.如权利要求8所述的小儿消积止咳口服液的质量鉴别方法，其特征在于，所述相似性比较为向量夹角余弦法。

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