CN103954719B - 小儿消积止咳口服液hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有19个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为0.066、0.077、0.088、0.124、0.157、0.166、0.192、0.220、0.229、0.275、0.481、0.837、0.872、0.890、0.962、1.000、1.026、1.061、1.203。本发明方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰多，通过标准指纹图谱共有峰的比较，可对小儿消积止咳口服液的质量进行全面评价，有利于稳定产品质量，确保临床用药的安全性、有效性。
Description
技术领域
本发明涉及一种小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC标准指纹图谱，属于中药制剂分析领域。
背景技术
小儿消积止咳口服液收载于《中国药典》2010年版一部第一增补本，由炒山楂、槟榔、枳实、蜜枇杷叶、瓜蒌、炒莱菔子、炒葶苈子、桔梗、连翘、蝉蜕十味中药制备而成，具有清热肃肺、消积止咳的功能，用于小儿饮食积滞、痰热蕴肺所致的咳嗽、夜间加重、喉间痰鸣、腹胀、口臭，具有确切的临床疗效，已收载入《国家基本药物目录(2012年版)》。
现行《中国药典》中小儿消积止咳口服液质量控制方法主要包括鉴别和含量测定两方面，其中鉴别项采用薄层色谱法，分别鉴定处方中的槟榔、连翘、枳实、桔梗；含量测定项采用HPLC测定枳实中辛弗林的含量。小儿消积止咳口服液由十味中药制备而成，仅用薄层色谱法定性鉴别药材及用HPLC色谱法检测其中一味中药中指标性成分的含量不足以全面、准确地控制小儿消积止咳口服液的质量。
中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较为全面地控制药品的质量，具有系统性、整体性特点。目前，以指纹图谱控制小儿消积止咳口服液的质量，国内外尚未见专利公开及文献报道。本发明公开了一种小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱的建立方法，以及用该方法制作的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱。在用相似度进行评价的情况下，可用其标准指纹图谱对小儿消积止咳口服液的质量进行全面地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。
发明内容
本发明的目的是针对现有小儿消积止咳口服液质量控制方法的不足，提供一种HPLC指纹图谱的建立方法及用该方法所得的HPLC标准指纹图谱。其特点是将小儿消积止咳口服液制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，获得小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱，从而为小儿消积止咳口服液的真伪鉴别和内在质量控制提供可靠依据。
本发明一种小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备：取小儿消积止咳口服液，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)HPLC色谱条件的确定：精密吸取供试品溶液，经HPLC分离检测，其中，流动相 的组成为乙腈—0.1％磷酸溶液，采用梯度洗脱；
3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对小儿消积止咳口服液供试品溶液进行分析，得HPLC色谱图，对色谱图进行比较，得到由样品共有特征峰构成的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱。
其中，供试品溶液按具体按如下步骤制备：精密量取小儿消积止咳口服液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
所述的HPLC色谱条件为：Kromasil C18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相：乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：0-40min，流动相A的体积百分含量由2％提高至30％，流动相B的体积百分比由98％降低至70％；40-50min，流动相A的体积百分含量有由0％提高至40％，流动相B的体积百分比由70％降低至60％；检测波长：203nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。
按上述谱条件对22批小儿消积止咳口服液样品进行分析，得到22批样品的HPLC色谱图，对22批样品的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱。
本发明还提供了由上述方法得到的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱，具体步骤是将22份小儿消积止咳口服液样品按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱。
所述HPLC标准指纹图谱有19个共有特征峰，其相对保留时间tR依次分别为：0.066、0.077、0.088、0.124、0.157、0.166、0.192、0.220、0.229、0.275、0.481、0.837、0.872、0.890、0.962、1.000、1.026、1.061、1.203。
与现有技术相比，本发明提供的小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重现性好，通过对比所得标准指纹图谱中共有峰的有无，可对小儿消积止咳口服液的质量进行全面地评价，有效地保证了成品的质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的缺点。此外，本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了基线分离，稳定性高、特征峰多，能全面、准确地评价小儿消积止咳口服液的质量，适用于对小儿消积止咳口服液真伪鉴别和产品质量的控制。
附图说明
图1是小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱(1-19为19个共有峰)；
图2为22批小儿消积止咳口服液的HPLC标准指纹图谱叠加图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1100高效液相色谱仪(美国)；DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent1100色谱工作站。
1.2试药
小儿消积止咳口服液由鲁南厚普制药有限公司提供(见表1)；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1小儿消积止咳口服液测试样品批号
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：203nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。
2.2供试品溶液的制备：精密量取小儿消积止咳口服液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定22个批号小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱19个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.066、0.077、0.088、0.124、0.157、0.166、0.192、0.220、0.229、0.275、0.481、0.837、0.872、0.890、0.962、1.000、1.026、1.061、1.203。
将22个批号小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱导入国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，进行色谱峰匹配，以16号峰为参照确定19个共有峰为构成小儿消积止咳口服液指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间见表2，22批小儿消积止咳口服液共有峰的相对峰面积见表3。22批小儿消积止咳口服液与标准指纹图谱相似度计算结果依次分别为：0.989，0.986，0.992，0.984，0.996，0.996，0.994，0.991，0.987，0.994，0.993，0.998，0.998，0.987，0.980，0.967，0.968，0.978，0.972，0.908，0.994，0.995。
表222批小儿消积止咳口服液共有峰的相对保留时间(tR)
表322批小儿消积止咳口服液共有峰的相对峰面积
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
取样品(00414058)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以16号峰为参照峰，计算出1～19号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
2.4.2稳定性试验
取样品(00414058)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0,2,4,6,8,24h进样，以16号峰为参照峰，计算出1～19号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。
2.4.3重现性试验
取同一批号样品(00414058)，分别精密量取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以16号峰为参照峰，计算出1～19号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种小儿消积止咳口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）供试品溶液的制备：取小儿消积止咳口服液，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2）HPLC色谱条件的确定： Kromasil C18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：0-40min，流动相A的体积百分含量由2%提高至30%，流动相B的体积百分比由98%降低至70%；40-50min，流动相A的体积百分含量由30%提高至40%，流动相B的体积百分比由70%降低至60%；检测波长：203nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；
3）指纹图谱的制作：精密吸取供试品溶液，经HPLC分离检测，按步骤2）色谱条件对小儿消积止咳口服液供试品溶液进行分析，得HPLC色谱图，对色谱图进行比较，得到由样品共有特征峰构成的小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液按如下步骤制备：精密量取小儿消积止咳口服液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，按色谱条件对22批小儿消积止咳口服液样品进行分析，得到22批样品的HPLC色谱图，对22批的色谱图进行比较，得到由其共有特征峰构成的小儿消积止咳口服液HPLC的标准指纹图谱。
4.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，所述小儿消积止咳口服液HPLC标准指纹图谱有19个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为：0.066、0.077、0.088、0.124、0.157、0.166、0.192、0.220、0.229、0.275、0.481、0.837、0.872、0.890、0.962、1.000、1.026、1.061、1.203。
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