CN102323343B

CN102323343B - 青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其使用方法

Info

Publication number: CN102323343B
Application number: CN 201110158620
Authority: CN
Inventors: 刘丽娟; 张丽杰
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102323343A

Abstract

青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其使用方法，它涉及中药材指纹图谱的建立方法和使用方法。本发明目的是提供青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其使用方法。建立方法：一、供试品溶液的制备；二、对照品溶液的制备；三、指纹图谱的制作；四、标准指纹图谱的确定。使用方法：将青龙衣的高效液相色谱指纹图谱与权利要求1得到的青龙衣的标准指纹图谱相比较，相似度大于50％属于合格产品。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。适用于青龙衣药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。本发明为全面、准确评价青龙衣的质量提供了新的方法，也为提高青龙衣药材及其制剂的质量标准工作作出贡献。

Description

青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其使用方法

技术领域

本发明涉及中药材指纹图谱的建立方法和使用方法，具体地说是青龙衣高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法。

背景技术

青龙衣是胡桃科植物胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)的新鲜未成熟果实，早在宋代《开宝本草》就有记载。《本草纲目》称之为胡桃壳，烧存性，用于治疗下血、崩中。近代民间用其治疗疼痛症，也常用来治疗癌症、皮肤病，还可作为止痛剂来应用。青龙衣的药理作用主要有：抗肿瘤、抗病毒、抑菌、镇痛和清除氧自由基等作用。青龙衣的化学成分复杂，主要为酚苷类成分，包括黄酮类、萘醌及其衍生物的苷类，另外还含有二芳基庚烷、挥发油和鞣质等。目前，对青龙衣的鉴定和质量控制的方法还不够全面。《黑龙江省药材标准》中收载的青龙衣药材标准只采用了显色反应来作为鉴别项，缺乏专属性，文献报道中也仅有采用一、二个指标成分进行含量测定，以其含量来判定质量的相关研究，这些方法对于以多组分协同起药理作用的中药来说是不足的。另外，中药的产地、来源、采收季节等情况复杂，有必要采用更合理的方法全面控制其质量以保证临床用药的安全。而指纹图谱技术是2000年我国食品药品监督管理局对中药注射剂开始实行质量控制的新方法，以其整体性和模糊性的特点从全貌特征上控制中药的质量。在科学性和专属性方面远远超过目前采用显色反应以及单一组分的含量测定。因此，为科学有效地控制青龙衣的内在质量，有必要建立青龙衣的指纹图谱。

发明内容

本发明目的在于提供青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其使用方法。本发明探索出一种青龙衣质量控制的方法，建立青龙衣的标准指纹图谱，借此可将青龙衣指纹图谱作为质量控制及真伪鉴别的指标之一，提出了一种更好的青龙衣药材质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使青龙衣药材的质量控制更加完善和科学。

青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法是通过下述步骤进行的：

一、供试品溶液的制备是通过下述步骤完成的：步骤a、将新鲜的青核桃的外表皮削下后阴干，然后粉碎成粉末状，再用乙醇浸泡3次后滤过，每次浸泡时间为48h，合并滤液后减压蒸馏回收溶剂，得青龙衣浸膏，步骤b、然后将4g青龙衣浸膏加入5mL，充分搅拌，水中静置30min，滤过，滤液用AB-8型大孔树脂柱吸附，然后用蒸馏水洗脱至流出液无色，弃去蒸馏水洗脱的洗脱液，再用体积浓度为30％的乙醇溶液洗脱至流出液无色，收集用体积浓度为30％的乙醇溶液洗脱的洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体A，步骤c、将步骤b获得干燥固体A溶解于蒸馏水中，然后用质量浓度为1％的盐酸溶液调pH值为2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量与溶解干燥固体A所用蒸馏水体积相等，然后合并萃取液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体B 60mg，步骤d、精密称取20mg步骤c获得的干燥固体B，置于容量瓶中，用甲醇溶解成浓度为400μg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

二、对照品溶液的制备：精密称取(4S)-4，5-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解配制成浓度为50μg/mL的溶液，作为对照品溶液；

三、指纹图谱的制作：以粒径为5μm的YMC-Pack ODS A C₁₈作为色谱分离柱填料，色谱分离柱的柱长为250mm且内径为4.6mm，由A液和B液组成混合流动相，A液为体积浓度为0.2％的磷酸水溶液，B液由甲醇和体积浓度为0.2％的磷酸水溶液按9∶1的体积比组成，流动相的流速为0.8mL/min，检测波长为259nm，柱温为35℃，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪采用梯度洗脱进行测定，以对照品溶液的色谱峰保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和相对峰面积，得到青龙衣的指纹图谱，其中梯度洗脱程序为：0 min～35 min→35 min～60 min→60 min～100 min→100min～130min，从0 min到35 min混合流动相中B液的体积浓度由15％梯度匀速增加到20％，从35 min到60 min混合流动相中B液的体积浓度由20％梯度匀速增加到30％，从60min到100min混合流动相中B液体积浓度由30％梯度匀速增加到40％，在100min～130min时间段内混合流动相中B液体积浓度保持为40％；

四、标准指纹图谱的确定：确定了14个共有特征峰；1号共有特征峰相对保留时间为0.512±0.25％，2号峰相对保留时间为0.532±0.17％，3号峰相对保留时间为0.598±0.11％；4号峰相对保留时间为0.689±0.24％，5号峰相对保留时间为0.802±0.11％，6号峰相对保留时间为0.942±0.08％，7号峰相对保留时间为1.000(此峰为对照品溶液峰)，8号峰相对保留时间为1.065±0.08％，9号峰相对保留时间为1.144±0.06％，10号峰相对保留时间为1.239±0.06％，11号峰相对保留时间为1.342±0.07％，12号峰相对保留时间为1.541±0.05％，13号峰相对保留时间为1.675±0.04％，14号峰相对保留时间为1.814±0.05，上述共有特征峰构成了青龙衣的指纹特征，作为青龙衣的标准指纹图谱，其中7号峰为对照品溶液峰)。

青龙衣高效液相色谱指纹图谱的使用方法如下：将青龙衣的高效液相色谱指纹图谱与权利要求1得到的青龙衣的标准指纹图谱相比较，相似度大于50％属于合格产品。

本发明以青龙衣化学成分的整体特征作为控制指标建立色谱指纹图谱，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定青龙衣整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为添加对照成分的可能性。本发明为全面、准确评价青龙衣的质量提供了新的方法，也为提高青龙衣药材及其制剂的质量标准工作作出贡献。

本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。适用于青龙衣药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。

附图说明

图1是青龙衣药材的标准指纹谱图，图中从左到右分别标出了其共有特征峰1至14号；图2是10批青龙衣药材指纹谱图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式中青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法是通过下述步骤进行的：

一、供试品溶液的制备是通过下述步骤完成的：步骤a、将新鲜的青核桃的外表皮削下后阴干，然后粉碎成粉末状，再用乙醇浸泡3次后滤过，每次浸泡时间为48h，合并滤液后减压蒸馏回收溶剂，得青龙衣浸膏，步骤b、然后将4青龙衣浸膏加入5mL，充分搅拌，水中静置30min，滤过，滤液用AB-8型大孔树脂柱吸附，然后用蒸馏水洗脱至流出液无色，弃去蒸馏水洗脱的洗脱液，再用体积浓度为30％的乙醇溶液洗脱至流出液无色，收集用体积浓度为30％的乙醇溶液洗脱的洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体A，步骤c、将步骤b获得干燥固体A溶解于蒸馏水中，然后用质量浓度为1％的盐酸溶液调pH值为2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量与溶解干燥固体A所用蒸馏水体积相等，然后合并萃取液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体B 60mg，步骤d、精密称取20mg步骤c获得的干燥固体B，置于容量瓶中，用甲醇溶解成浓度为400μg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

二、对照品溶液的制备：精密称取(4S)-4，5-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解配制成浓度为50μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

三、指纹图谱的制作：以粒径为5μm的YMC-Pack ODS A C₁₈作为色谱分离柱填料，色谱分离柱的柱长为250mm且内径为4.6mm，由A液和B液组成混合流动相，A液为体积浓度为0.2％的磷酸水溶液，B液由甲醇和体积浓度为0.2％的磷酸水溶液按9∶1的体积比组成，流动相的流速为0.8mL/min，检测波长为259nm，柱温为35℃，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪采用梯度洗脱进行测定，以对照品溶液的色谱峰保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和相对峰面积，得到青龙衣的指纹图谱，其中梯度洗脱程序为：0min～35min→35min～60min→60min～100min→100min～130min，从0min到35min混合流动相中B液的体积浓度由15％梯度匀速增加到20％，从35min到60min混合流动相中B液的体积浓度由20％梯度匀速增加到30％，从60mm到100min混合流动相中B液体积浓度由30％梯度匀速增加到40％，在100min～130min时间段内混合流动相中B液体积浓度保持为40％；

四、标准指纹图谱的确定：确定了14个共有特征峰；1号共有特征峰相对保留时间为0.512±0.25％，2号峰相对保留时间为0.532±0.17％，3号峰相对保留时间为0.598±0.11％；4号峰相对保留时间为0.689±0.24％，5号峰相对保留时间为0.802±0.11％，6号峰相对保留时间为0.942±0.08％，7号峰相对保留时间为1.000(此峰为对照品溶液峰)，8号峰相对保留时间为1.065±0.08％，9号峰相对保留时间为1.144±0.06％，10号峰相对保留时间为1.239±0.06％，11号峰相对保留时间为1.342±0.07％，12号峰相对保留时间为1.541±0.05％，13号峰相对保留时间为1.675±0.04％，14号峰相对保留时间为1.814±0.05，上述共有特征峰构成了青龙衣的指纹特征，作为青龙衣的标准指纹图谱(见图1)，其中7号峰为对照品溶液峰)。

具体实施方式二：本实施方式中青龙衣高效液相色谱指纹图谱的使用方法如下：将青龙衣的高效液相色谱指纹图谱与权利要求1得到的青龙衣的标准指纹图谱相比较，相似度大于50％属于合格产品。

采用下述试验验证本发明效果：

1仪器与试药

1.1仪器

HITACHI L-2000高效液相色谱仪；HITACHI L-2400紫外检测器；AT-130色谱柱柱温箱；HITACHI D-2000色谱工作站。

1.2试药

(4S)-4，5-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品，自制，纯度大于99％；青龙衣药材共10批，购于黑龙江省及吉林省；其它试剂为色谱纯或分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为YMC-Pack ODS A C₁₈(5μm，250×4.6mm)；流动相为0.2％的磷酸水(A)，甲醇-0.2％的磷酸水溶液(9∶1)(B)；检测波长：259nm；柱温：35℃。

2.2梯度洗脱程序(参见步骤三)

3指纹图谱测定

3.1青龙衣指纹图谱制备

对照品溶液的制备：精密称取对照品(4S)-4，5-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，用甲醇溶解，配制成浓度为50μg/mL的溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：将新鲜的青核桃(2kg)的外表皮削下，阴干，粉碎成粗粉，用10倍量的乙醇浸泡3次，每次2天，滤过，滤液合并，减压回收溶剂，得青龙衣浸膏。称取4g青龙衣浸膏加5mL水溶解，滤过，水溶液经AB-8型大孔树脂柱色谱，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，弃去水洗脱液。再用30％乙醇洗至无色，收集洗脱液，减压回收溶剂，得干燥固体0.08g。加适量蒸馏水溶解，用1％(质量浓度)的盐酸溶液调pH为2后，用等量的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，得干燥固体60mg。精密称取20mg，置于容量瓶中，用甲醇溶解成浓度为400μg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。

测定法：精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录130分钟的色谱图，即得。以对照品溶液的色谱峰保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和相对峰面积。将得到的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件(中华人民共和国药典委员会，2004年版)，进行相似度计算。

3.2共有峰确定和标准指纹图谱的生成

按照本发明提供的方法对10批青龙衣药材进行指纹图谱的测定，得到的谱图导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件(中华人民共和国药典委员会，2004年版)，见附图2。通过分析比较，确定了14个共有特征峰。分别以10批药材指纹图谱中的对照品色谱峰的保留时间作为参照，14个特征峰的相对保留时间分别为：0.512±0.25％，0.532±0.17％，0.598±0.11％，0.689±0.24％，0.802±0.11％，0.942±0.08％，1.000(参照峰)，1.065±0.08％，1.144±0.06％，1.239±0.06％，1.342±0.07％，1.541±0.05％，1.675±0.04％，1.814±0.05％。10批青龙衣药材共有特征峰相对保留时间统计结果见表1。同时生成对照指纹图谱，见附图1。

表1：10批青龙衣药材相对保留时间统计

3.3相似度的计算

将10批青龙衣药材的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件(中华人民共和国药典委员会，2004年版)，进行相似度计算，见表2。10批药材指纹图谱的相似度均大于50％。

3.4指纹图谱重现性试验

以10号样黑龙江省五常市青龙衣药材为供试品，按照指纹图谱重现性规定方法操作，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。结果见表3，结果显示本发明的方法重现性良好。

3.5指纹图谱精密度试验

以10号样黑龙江省五常市青龙衣药材为供试品，按照指纹图谱精密度规定方法操作，连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。结果见表4，结果显示本发明的方法精密度良好。

3.6指纹图谱稳定性试验

以10号样黑龙江省五常市青龙衣药材为供试品，按照指纹图谱稳定性测定方法操作，考察48小时溶液的稳定，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD％不超过3％。结果见表5，结果显示供试品48小时稳定。

以上试验结果显示，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。

表2相似度计算结果

表3重现性试验结果(n＝5)

表4精密度试验结果(n＝5)

表5稳定性试验结果(n＝5)

Claims

1.青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于青龙衣高效液相色谱指纹图谱的建立方法是通过下述步骤进行的：

一、供试品溶液的制备是通过下述步骤完成的：步骤a、将新鲜的青核桃的外表皮削下后阴干，然后粉碎成粉末状，再用乙醇浸泡3次后滤过，每次浸泡时间为48h，合并滤液后减压蒸馏回收溶剂，得青龙衣浸膏，步骤b、将4g青龙衣浸膏加入5mL水中，充分搅拌，静置30min，滤过，滤液用AB-8型大孔树脂柱吸附，然后用蒸馏水洗脱至流出液无色，弃去蒸馏水洗脱的洗脱液，再用体积浓度为30%的乙醇溶液洗脱至流出液无色，收集用体积浓度为30%的乙醇溶液洗脱的洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体A，步骤c、将步骤b获得干燥固体A溶解于蒸馏水中，然后用质量浓度为1%的盐酸溶液调pH值为2，再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯用量与溶解干燥固体A所用蒸馏水体积相等，然后合并萃取液，减压蒸馏回收溶剂，干燥后得到干燥固体B 60mg，步骤d、精密称取20mg步骤c获得的干燥固体B，置于容量瓶中，用甲醇溶解成浓度为400μg/mL的溶液，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

二、对照品溶液的制备：精密称取（4S）-4,5-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解配制成浓度为50μg/mL的溶液，作为对照品溶液；

三、指纹图谱的制作：以粒径为5μm的YMC-Pack ODS A C₁₈作为色谱分离柱填料，色谱分离柱的柱长为250mm且内径为4.6mm，由A液和B液组成混合流动相，A液为体积浓度为0.2%的磷酸水溶液，B液由甲醇和体积浓度为0.2%的磷酸水溶液按9：1的体积比组成，流动相的流速为0.8mL/min，检测波长为259nm，柱温为35℃，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪采用梯度洗脱进行测定，以对照品溶液的色谱峰保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和相对峰面积，得到青龙衣的指纹图谱，其中梯度洗脱程序为：0min～35min→35min～60min→60min～100min→100min～130min，从0min到35min混合流动相中B液的体积浓度由15%梯度匀速增加到20%，从35min到60min混合流动相中B液的体积浓度由20%梯度匀速增加到30%，从60min到100min混合流动相中B液体积浓度由30%梯度匀速增加到40%，在100min～130min时间段内混合流动相中B液体积浓度保持为40%；

四、标准指纹图谱的确定：确定了14个共有特征峰；1号共有特征峰相对保留时间为0.512±0.25%，2号峰相对保留时间为0.532±0.17%，3号峰相对保留时间为0.598±0.11%；4号峰相对保留时间为0.689±0.24%，5号峰相对保留时间为0.802±0.11%，6号峰相对保留时间为0.942±0.08%，7号峰相对保留时间为1.000，8号峰相对保留时间为1.065±0.08%，9号峰相对保留时间为1.144±0.06%，10号峰相对保留时间为1.239±0.06%，11号峰相对保留时间为1.342±0.07%，12号峰相对保留时间为1.541±0.05%，13号峰相对保留时间为1.675±0.04%，14号峰相对保留时间为1.814±0.05，上述共有特征峰构成了青龙衣的指纹特征，作为青龙衣的标准指纹图谱，其中7号峰为对照品溶液峰。