CN112730655B - 葶苈大枣泻肺颗粒指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有27个共有峰。本发明质量检测方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰多，通过标准指纹图谱共有峰的比对，可对葶苈大枣泻肺颗粒的质量进行全面评价和控制，有利于精准评估制剂的内在质量，确保临床用药的安全性、有效性。

Description

葶苈大枣泻肺颗粒指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明公开了一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，属于中药制剂分析领域。
背景技术
葶苈大枣泻肺汤载于汉·张仲景所著《金匮要略》，由葶苈子、大枣2味药物组成。方中葶苈子为主药，行泻肺逐水、化痰平喘之用，配伍大枣以缓和其峻猛之性，且大枣兼具固脾通津之能，二者伍用，诚为泻肺而不伤脾之法，共奏泻肺利水、下气消痰之功效，临床用治痰涎壅盛，咳喘，胸胁胀满，不得平卧；或心悸，面目浮肿，苔腻，脉弦滑；或鼻塞流清涕，嗅觉减退等。
葶苈大枣泻肺颗粒是由葶苈大枣泻肺汤经提取、浓缩、干燥、制粒而成的现代颗粒剂产品，并于2020年3月20日申请了国家专利，专利申请号CN202010200721.2。目前，葶苈大枣泻肺颗粒的质量控制研究尚有不足，为稳定和保证产品质量，需要对其质量检测和控制方法进行全面地研究。中药指纹图谱作为一种中药质量控制技术及方法，具有整体性、模糊性特点，能较为全面地反应中药的整体质量。目前国内外尚未有以中药指纹图谱控制葶苈大枣泻肺颗粒质量的相关专利公开及文献报道。
本发明公开了一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，以及用该方法制作的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，可有效反映葶苈大枣泻肺颗粒化学成分的整体性和复杂性，对制剂质量进行全面地评价和控制，进而保证临床用药的安全性与有效性。
发明内容
针对现有葶苈大枣泻肺颗粒质量检测方法的不足，本发明的目的是提供一种葶苈大枣泻肺颗粒指纹图谱建立方法。具体来说，该方法将葶苈大枣泻肺颗粒制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，从而获得葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，实现全方位多方面检测，完善其质量检测体系，进而为葶苈大枣泻肺颗粒的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。
本发明一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括下列步骤：
1)供试品溶液的制备：取葶苈大枣泻肺颗粒，加入50％-70％甲醇，超声处理20-60min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)HPLC色谱条件的确定：ZORBAX SB C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈为流动相A，0.08-0.18％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％
0-5 5％→9％ 95％→91％
5-15 9％→11％ 91％→89％
15-37 11％→20％ 89％→80％
37-47 20％→30％ 80％→70％
47-53 30％→40％ 70％→60％
53-57 40％→5％ 60％→95％
57-65 5％ 95％
检测波长：240-270nm；流速：0.5-1.5ml/min；柱温：25-35℃；
3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对葶苈大枣泻肺颗粒供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱。
优选地，步骤1)所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，精密加入60％甲醇，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
优选地，步骤2)所述流动相B为0.12％磷酸溶液。
优选地，取14批次葶苈大枣泻肺颗粒按步骤1)制备供试品溶液，步骤2)进行HPLC色谱分析，步骤3)制作标准指纹图谱。
所述葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件进行相似度评价。
本发明还提供了由上述方法得到的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，具体步骤是将14批葶苈大枣泻肺颗粒样品，按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱。
本发明中，所述葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱有27个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为：0.394，0.703，0.916，0.974，1.000，1.321，1.355，1.467，1.788，1.816，1.847，2.051，2.098，2.135，2.161，2.508，2.543，2.596，2.721，2.825，3.180，3.349，3.598，3.862，4.002，4.059，4.256。
其中5号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
本发明中，所述方法的检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
与现有技术相比，本发明一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的缺点，所提供的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重现性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对葶苈大枣泻肺颗粒的质量进行全面评价，有效地保证了成品的质量。
此外，本发明根据葶苈大枣泻肺颗粒的处方成分构成特点，优选最佳流动相组成及其梯度洗脱程序、流速、检测波长等，解决了特征峰难以分开及杂质峰干扰大的难题，所得指纹图谱分离度高、峰形好，各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价葶苈大枣泻肺颗粒的质量，适用于对葶苈大枣泻肺颗粒真伪鉴别和产品质量的控制。
附图说明
图1为葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(1-27为27个共有峰)
其中，5号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
图2为14批葶苈大枣泻肺颗粒的HPLC指纹图谱叠加图
其中，5号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚、明晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显而易见，以下实施例是本申请实施例的一部分，而不是全部。因此，以下对实施例的详细描述并非限定本申请要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所作出的等同替换或修改，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2试药
葶苈大枣泻肺颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1葶苈大枣泻肺颗粒测试样品批号
Figure BDA0002846285920000031
Figure BDA0002846285920000041
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.12％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％
0-5 5％→9％ 95％→91％
5-15 9％→11％ 91％→89％
15-37 11％→20％ 89％→80％
37-47 20％→30％ 80％→70％
47-53 30％→40％ 70％→60％
53-57 40％→5％ 60％→95％
57-65 5％ 95％
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的27个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.394，0.703，0.916，0.974，1.000，1.321，1.355，1.467，1.788，1.816，1.847，2.051，2.098，2.135，2.161，2.508，2.543，2.596，2.721，2.825，3.180，3.349，3.598，3.862，4.002，4.059，4.256。其中，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
将14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，进行色谱峰匹配，以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照确定27个共有峰为构成葶苈大枣泻肺颗粒指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间分别列于表2，14批葶苈大枣泻肺颗粒共有峰的相对峰面积见表3。14批葶苈大枣泻肺颗粒与标准指纹图谱相似度计算结果依次为0.986，0.999，0.992，0.999，0.981，0.990，0.984，0.987，0.990，0.977，0.993，0.998，0.979，0.973。
表2 14批葶苈大枣泻肺颗粒共有峰的相对保留时间(tR)
Figure BDA0002846285920000051
表3 14批葶苈大枣泻肺颗粒共有峰的相对峰面积
Figure BDA0002846285920000052
Figure BDA0002846285920000061
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
取样品(201001)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算出1-27号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。
2.4.2稳定性试验
取样品(201001)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24，48h进样，以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算出1-27号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在48小时内稳定。
2.4.3重现性试验
取同一批号样品(201001)，分别精密称取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算出1-27号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
实施例2葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2试药
葶苈大枣泻肺颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表4；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表4葶苈大枣泻肺颗粒测试样品批号
Figure BDA0002846285920000071
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.18％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002846285920000072
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，超声处理60min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的27个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.391，0.701，0.915，0.974，1.000，1.319，1.356，1.467，1.785，1.816，1.845，2.053，2.097，2.136，2.158，2.507，2.545，2.597，2.722，2.825，3.179，3.347，3.598，3.860，4.003，4.057，4.255。其中，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
实施例3葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2试药
葶苈大枣泻肺颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表5；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表5葶苈大枣泻肺颗粒测试样品批号
Figure BDA0002846285920000081
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.12％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002846285920000082
Figure BDA0002846285920000091
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇，超声处理20min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的27个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.392，0.701，0.914，0.973，1.000，1.321，1.354，1.466，1.786，1.815，1.847，2.051，2.098，2.136，2.162，2.505，2.540，2.596，2.721，2.822，3.179，3.348，3.597，3.861，4.002，4.057，4.255。其中，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
实施例4葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2试药
葶苈大枣泻肺颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表6；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表6葶苈大枣泻肺颗粒测试样品批号
Figure BDA0002846285920000092
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.08％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002846285920000101
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入65％甲醇，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的27个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.391，0.701，0.915，0.971，1.000，1.321，1.356，1.468，1.788，1.816，1.848，2.049，2.097，2.134，2.160，2.509，2.544，2.595，2.719，2.825，3.180，3.347，3.598，3.862，4.002，4.060，4.254。其中，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
实施例5葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2试药
葶苈大枣泻肺颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，见表7；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表7葶苈大枣泻肺颗粒测试样品批号
Figure BDA0002846285920000102
Figure BDA0002846285920000111
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.15％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002846285920000112
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入55％甲醇，超声处理50min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定14个批号葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以5号槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的27个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.392，0.702，0.913，0.971，1.000，1.319，1.355，1.467，1.787，1.817，1.845，2.050，2.097，2.132，2.158，2.506，2.540，2.596，2.719，2.825，3.179，3.349，3.598，3.860，4.001，4.058，4.256。其中，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种葶苈大枣泻肺颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）供试品溶液的制备：取葶苈大枣泻肺颗粒，加入50%-70%甲醇，超声处理20-60min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2）HPLC色谱条件的确定：ZORBAX SB C18柱，乙腈为流动相A，体积百分含量0.08%-0.18%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；
3）指纹图谱的制作：按步骤2）色谱条件对葶苈大枣泻肺颗粒供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱；
所述标准指纹图谱有27个共有峰，其中5号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷，18号峰为芦丁，19号峰为异槲皮苷，21号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖，24号峰为槲皮素，27号峰为异鼠李素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密称取葶苈大枣泻肺颗粒5g，精密加入60%甲醇，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述流动相B为体积百分含量0.12%磷酸溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取14批次葶苈大枣泻肺颗粒，按步骤1）制备供试品溶液，步骤2）进行HPLC色谱分析，步骤3）制作标准指纹图谱。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葶苈大枣泻肺颗粒HPLC标准指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件进行相似度评价。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述共有峰的相对保留时间tR依次分别为：0.394，0.703，0.916，0.974，1.000，1.321，1.355，1.467，1.788，1.816，1.847，2.051，2.098，2.135，2.161，2.508，2.543，2.596，2.721，2.825，3.180，3.349，3.598，3.862，4.002，4.059，4.256。
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