CN109270181B

CN109270181B - 首荟通便胶囊hplc指纹图谱的建立方法及其标准图谱

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Publication number: CN109270181B
Application number: CN201811404354.7A
Authority: CN
Inventors: 刘武占; 关永霞
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109270181A

Abstract

本发明公开了一种首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作，由该方法得到的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有25个共有峰，其相对保留时间t_R依次分别为0.101，0.108，0.137，0.268，0.282，0.312，0.690，0.717，0.798，0.887，0.925，1.000，1.052，1.125，1.173，1.255，1.270，1.409，1.489，1.520，1.648，1.861，1.893，2.048，2.158。本发明指纹图谱建立方法所得图谱特征峰多，重现性好、操作简便、稳定性高，通过标准指纹图谱共有峰的比较，可对首荟通便胶囊的质量进行全面地评价和控制，确保其内在质量的均一性和稳定性。

Description

首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱

技术领域

本发明涉及一种首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，属于中药制剂分析领域。

背景技术

中国专利CN100453105C公开了一种具有通便排毒、减肥降脂功能的中药组合物及制备方法，产品为治疗功能性便秘的中药复方制剂“首荟通便胶囊”。首荟通便胶囊处方以中医理论为指导，融汇临床经验，在润肠通便、泻浊排毒之品中辅以补血润燥之品，佐以补气健脾之品，使以降浊消痞之药味，达到补泻兼施，以通为用，降中有升，泻中有补，一走一守，一急一缓，相互制约，相互为用，补不留滞，泻不伤正之功效，从而引导全方作用于脾胃，使中焦脾胃恢复升清降浊的正常功能。首荟通便胶囊组方合理，配伍精当，气阴同补，补泻兼施，疗效确切，起效快，无毒副反应，对毒邪内蕴、阴液亏虚所致的便秘具有良好的治疗作用，可全面改善胃肠功能，润肠通便，并具有排毒养颜、减肥降脂的功效。

首荟通便胶囊为鲁南厚普制药有限公司研制开发的中药6类新药，为独家产品，具有处方工艺、质量标准和用途等核心技术的自主知识产权，于2015年5月6日获得生产批件(国药准字Z20150041)和新药证书(国药证字Z20150005)，现已成功上市。首荟通便胶囊主要通过益气养阴，改善体质而达到治疗便秘的目的，以何首乌、芦荟为主药，针对气阴两虚证有益气养阴之功效，属“润下之极品”。临床应用结果表明其疗效确切，适合老年人和体质虚弱的患者服用，深得医患好评，对治疗功能性便秘具有显著的作用。

现行首荟通便胶囊质量控制方法主要包括真伪鉴别和含量测定，真伪鉴别通常采用薄层色谱法分别鉴别制剂中人参、枳实、芦荟和阿胶药材的真伪，含量测定以HPLC法测定何首乌中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量、枳实中柚皮苷的含量。中药具有成分繁多、组分复杂，通过多靶点、多途径、多成分协同作用的特点，上述特点使得中药质量控制与评价成为制约中药发展的一大难题。

中药指纹图谱是从中药物质基础的角度出发，运用现代分析测试技术，得到能够表征中药材或中成药特征的光谱图或色谱图。中药指纹图谱技术是一种综合的、可量化的鉴定手段，基本反映了中药材或中成药的成分组成和含量分布情况，可以用来作为鉴别中药真伪优劣的依据。随着生命科学以及现代分析化学技术的进步和发展，中药质量控制领域的研究手段越来越丰富，中药指纹图谱技术在中药优劣评价、真伪鉴别、活性成分识别以及一致性和稳定性评价等方面应用越来越广泛，已成为国际公认的分析方法。

目前，以指纹图谱控制首荟通便胶囊的质量，国内外尚未见专利公开及文献报道。

发明内容

本发明目的是提供一种首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法。其步骤是将首荟通便胶囊内容物制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，获得首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，从而为首荟通便胶囊的真伪鉴别和内在质量评价提供有力支撑依据。

本发明提供了一种首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取首荟通便胶囊内容物，加入50％以上的甲醇，超声处理20-50min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

2)HPLC色谱条件的确定：Kromasil C₁₈柱，乙腈为流动相A，0.05％-0.20％磷酸溶液为流动相B，洗脱，优选的是，采用梯度洗脱，更优选的是，所述梯度洗脱方法为：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0-40	12％→30％	88％→70％
40-60	30％→65％	70％→35％

3)HPLC标准指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对首荟通便胶囊供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的首荟通便胶囊标准指纹图谱。

优选地，供试品溶液具体按如下步骤制备：称取首荟通便胶囊内容物0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入60％甲醇25ml，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

所述的HPLC色谱条件为：检测波长：220nm；流速：1mL/min；柱温：30℃。

按上述色谱条件对2批或2批以上首荟通便胶囊样品进行分析，优选的是，对10-20批首荟通便胶囊样品进行分析，更优选的是，对11批首荟通便胶囊样品进行分析，得到11批样品的HPLC色谱图，对11批样品的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱。

本发明还提供了由上述方法得到的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，具体步骤是将11批首荟通便胶囊样品按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》软件分析，得到首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱。

所述首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱有25个共有峰，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的其相对保留时间t_R依次分别为：0.101，0.108，0.137，0.268，0.282，0.312，0.690，0.717，0.798，0.887，0.925，1.000，1.052，1.125，1.173，1.255，1.270，1.409，1.489，1.520，1.648，1.861，1.893，2.048，2.158。

上述峰的相对保留时间为0.798时为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，相对保留时间1.000时为柚皮苷，相对保留时间1.270时为芦荟苷。

进一步，本发明还提供了上述首荟通便胶囊HPLC指纹图谱构建方法所得HPLC指纹图谱在首荟通便胶囊检测中的应用。

与现有技术相比，本发明首荟通便胶囊HPLC指纹图谱建立方法灵敏度高、重现性好，简便易操作，通过对比待检样品所得指纹图谱与标准图谱共有峰的相似程度，可对首荟通便胶囊的质量进行全面评价和控制。此外，本发明色谱条件下的制剂各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价首荟通便胶囊的质量，适用于真伪鉴别和产品质量的检测，从而保证了制剂内在质量的均一性和稳定性。

附图说明

图1为首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱(1-25为25个共有峰)；

图2为11批首荟通便胶囊的HPLC指纹图谱叠加图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。

1.2试药

首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

表1首荟通便胶囊测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.10％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

检测波长：220nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。

2.2供试品溶液的制备：称取首荟通便胶囊内容物0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入60％甲醇25ml，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3 HPLC标准指纹图谱的建立

测定11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间t_R分别为：0.101，0.108，0.137，0.268，0.282，0.312，0.690，0.717，0.798，0.887，0.925，1.000，1.052，1.125，1.173，1.255，1.270，1.409，1.489，1.520，1.648，1.861，1.893，2.048，2.158。

其中，9号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

将11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》软件中分析，进行色谱峰匹配，以12号柚皮苷峰为参照确定25个共有峰为构成首荟通便胶囊指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间见表2，11批首荟通便胶囊共有峰的相对峰面积见表3。11批首荟通便胶囊与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.998，0.998，0.998，1.000，0.999，0.998，0.999，0.999，0.998，0.999，0.988。

表2 11批首荟通便胶囊共有峰的相对保留时间(t_R)

表3 11批首荟通便胶囊共有峰的相对峰面积(S)

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验

取S1批样品，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，连续进样6次，以12号峰为参照峰，计算出

号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性试验

取S1批样品，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别在时间点为0，2，4，6，8，24h进样，以12号峰为参照峰，计算出

号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.4.3重现性试验

取S1批样品，分别称取6份，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别进样，以8号峰为参照峰，计算出

号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明该方法重现性良好。

实施例2首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试药

首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表4；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

表4首荟通便胶囊测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.05％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

2.2供试品溶液的制备：称取首荟通便胶囊0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，超声处理20min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 HPLC标准指纹图谱的建立

测定11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间t_R分别：0.101，0.108，0.138，0.270，0.281，0.311，0.701，0.718，0.798，0.888，0.926，1.000，1.053，1.125，1.174，1.256，1.271，1.408，1.488，1.521，1.650，1.860，1.891，2.049，2.156。其中，9号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

实施例3首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试药

首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表5；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

表5首荟通便胶囊测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.20％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

2.2供试品溶液的制备：称取首荟通便胶囊0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理50min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 HPLC标准指纹图谱的建立

测定11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间t_R分别：0.101，0.109，0.138，0.268，0.281，0.313，0.692，0.716，0.799，0.886，0.927，1.000，1.054，1.126，1.174，1.253，1.271，1.410，1.491，1.521，1.649，1.862，1.891，2.046，2.157。其中，9号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

实施例4首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试药

首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表6；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

表6首荟通便胶囊测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.17％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

2.2供试品溶液的制备：称取首荟通便胶囊0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25ml，超声处理36min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 HPLC标准指纹图谱的建立

测定11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间t_R分别：0.102，0.108，0.135，0.269，0.283，0.311，0.692，0.716，0.797，0.888，0.926，1.000，1.054，1.124，1.171，1.253，1.272，1.411，1.487，1.522，1.647，1.861，1.894，2.047，2.157。其中，9号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

实施例5首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试药

首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，见表7；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

表7首荟通便胶囊测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C₁₈(4.6×250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.14％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

2.2供试品溶液的制备：称取首荟通便胶囊0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml，超声处理45min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.3 HPLC标准指纹图谱的建立

测定11个批号首荟通便胶囊HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的首荟通便胶囊HPLC标准指纹图谱，其中以12号柚皮苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间t_R分别：0.101，0.109，0.138，0.266，0.284，0.313，0.693，0.719，0.799，0.886，0.924，1.000，1.050，1.123，1.171，1.253，1.269，1.407，1.488，1.519，1.647，1.861，1.895，2.046，2.155。其中，9号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以作出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种首荟通便胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1）供试品溶液的制备：取首荟通便胶囊内容物，加入50%以上的甲醇，超声处理20min-50min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

2）HPLC色谱条件的确定：Kromasil C₁₈柱，乙腈为流动相A，0.05%-0.2%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：

时间（min）流动相A（%）流动相B（%） 0-40 12％→30％ 88％→70％ 40-60 30％→65％ 70％→35％

检测波长：220nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃；

3）HPLC标准指纹图谱的制作：按步骤2）色谱条件对首荟通便胶囊供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的首荟通便胶囊标准指纹图谱；

所述标准指纹图谱具有25个特征峰，其中9号峰为2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，12号峰为柚皮苷，17号峰为芦荟苷。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的供试品溶液，按如下步骤制备：精密称取首荟通便胶囊内容物0.5g，精密加入60%甲醇，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述流动相B为0.1%磷酸溶液。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品的数量为11批次。