CN113341010A - 一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药领域，具体涉及一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法。所述质量控制方法包括多成分含量测定和特征图谱；所述多成分含量测定包括对半夏厚朴汤中的迷迭香酸、6‑姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚进行含量测定；所述特征图谱包括11个特征峰。本发明建立的成分含量测定方法，测定方法重复性好、稳定性高、专属性强，更加全面的反映半夏厚朴汤制剂的质量。本发明建立了半夏厚朴汤制剂的特征图谱，特征图谱包括11个特征峰，更好的控制药材或制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法。
背景技术
半夏厚朴汤始载于张仲景《金匮要略》，是治疗痰气郁结型(俗称“梅核气”)的经典名方。该方由半夏、厚朴、茯苓、紫苏叶和生姜等五味中药组成，常用以治疗精神性疾病如抑郁症、焦虑症等。由于中药材质量良莠不齐，加之成分复杂，现有检测方法缺少处方中其他药材的质量信息，很难全面反应产品质量，难以对药材和制剂的质量进行有效的控制。
中药特征图谱是一种综合的鉴定手段，它建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富化学成分信息的检测方法，故建立中药特征图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此建立半夏厚朴汤制剂特征图谱对于半夏厚朴汤制剂的质量控制具有重要意义。但是现有技术对半夏厚朴汤制剂的特征图谱研究少有报道。同时，现有技术中对半夏厚朴汤制剂含量测定指标的主要集中于源于厚朴的指标成分，而对于半夏厚朴汤中源于其他几味药的指标成分并无报道。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，包括多成分含量测定方法和特征图谱。其中多成分含量测定方法为对半夏厚朴汤中包括迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚的多个指标进行含量测定，测定方法重复性好、稳定性高、专属性强。所述特征图谱包括11个特征峰，对半夏厚朴汤制剂的质量进行整体描述和评价，更加全面的反应半夏厚朴汤制剂的质量。本发明提供的半夏厚朴汤制剂的多成分含量测定及其特征图谱，为半夏厚朴汤制剂的研究和质量控制提供参考依据。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，包括多成分含量测定方法和特征图谱；所述多成分含量测定方法包括对半夏厚朴汤中的迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚进行含量测定；所述特征图谱包括11个特征峰。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，所述半夏厚朴汤制剂为半夏厚朴汤冻干粉；制备方法为：按重量份计，取半夏2份，厚朴1.5份，茯苓2份，生姜2.5份，苏叶1份，加8倍量水，武火煎煮至沸腾，用文火再煎煮30min，双层纱布趁热过滤，所得滤液为一煎样品，放冷；所得滤渣继续加5倍量水，武火煎煮至沸腾，后文火煎煮18min，双层纱布趁热过滤，所得滤液为二煎样品，与一煎样品混合，冻干即可。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚含量测定的方法包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚对照品适量，加甲醇溶解；制备的每1mL对照品溶液中含有迷迭香酸35μg、6-姜辣素40μg、和厚朴酚30μg、厚朴酚45μg；
(2)供试品溶液的制备：称取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密加入50％甲醇20mL，称重；超声下提取60min；放冷；加50％甲醇补至原重，过滤，滤液即为供试品溶液；
(3)：色谱检测条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B；流速为1mL/min；色谱条件如下表：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 10 | 90 |
| 25 | 30 | 70 |
| 30 | 40 | 60 |
| 50 | 100 | 0 |
；其中迷迭香酸检测波长为329nm，理论板数按迷迭香酸计算不低于3000；6-姜辣素检测波长为280nm，理论板数按6-姜辣素计算不低于3000；和厚朴酚以及厚朴酚的检测波长为294nm，理论板数按和厚朴酚计算不低于3000；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，按照步骤(3)色谱条件测定，计算检测迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚的含量。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，每1g半夏厚朴汤冻干粉中迷迭香酸含量不低于0.2mg，6-姜辣素含量不低于1mg，和厚朴酚以及厚朴酚的含量之和不低于0.5mg。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，计算的方法为采用外标两点法或标准曲线法。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，所述特征图谱的建立方法步骤如下：
步骤S1：参照物溶液的制备：取木兰苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含100μg的溶液；
步骤S2：供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密称定，加入50％甲醇25mL后称重，超声处理30min，放冷后补充50％甲醇至原重，即得；
步骤S3：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B；流速为0.8mL/min，检测波长为230nm。理论板数按木兰苷A峰计算不低于2500，
步骤S4：测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20uL，注入液相色谱仪，按照步骤S3中的色谱条件测定，记录色谱图，即得。
进一步的，在上述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法中，各特征峰与参照峰的相对保留时间分别为：1号峰0.54；2号峰0.67；3号峰0.73；4号峰0.88；5号峰参照峰1.00；6号峰1.17；7号峰1.25；8号峰1.38；9号峰1.69；10号峰1.75；11号峰1.80。
本发明的有益效果为：
(一)本发明所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，建立了包括对半夏厚朴汤中迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚的多个指标的成分含量测定方法，测定方法重复性好、稳定性高、专属性强，更加全面的反映半夏厚朴汤制剂的质量。
(二)本发明所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，建立了半夏厚朴汤制剂的特征图谱，特征图谱包括11个特征峰，更好的控制药材或制剂的质量，当质量发生问题或出现不良反应时，能更准确的反应问题所在之处，对指导工业生产控制药剂质量具有重要的意义。
附图说明
图1是实施例1制备方法中供试品溶液的HPLC谱图；
图2是以乙腈为流动相A，水为流动相B梯度洗脱检测得到HPLC谱图；
图3是实施例1制备方法中对照品溶液的HPLC谱图；
图4是实施例1中各检测成分的标准曲线；
图5是实施例2建立方法得到的特征图谱；
图6是厚朴相关化合物的对比图谱；
图7是厚朴相关化合物的对比图谱；
图8是紫苏相关化合物的对比图谱；
图9是生姜相关化合物的对比图谱；
图10是特征图谱构建方法中采用不同提取溶剂得到的对比图谱；
图11是特征图谱构建方法中采用不同提取时间得到的对比图谱；
图12是特征图谱构建方法中提取溶剂采用不同添加量得到的对比图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例1中所用仪器包括：
万分之一分析天平：FA1004(YUEPING)；
十万分之一分析天平：XS105(瑞士Mettler-Toledo公司)；
超声清洗器：KQ5200DE(昆山市超声仪器有限公司)；
HPLC：岛津DGU-20AT高效液相色谱仪；
安捷伦1200高效液相色谱仪；
色谱柱：紫苏/半夏厚朴汤复方Diamonsil Plus 5um C18，250*4.6mm(DIKMA Cat#99403 Ser#2037924)、厚朴Diamonsil 5um C18(2)250*4.6mm(DIKMA Cat#99603 Ser#201054330)、生姜Diamonsil C18(2)5μ250*4.6mm(DIKMA cat.no.99603ser.no.201042932)
本发明实施例所用试剂及样品：
甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈、磷酸(分析纯)、纯净水(娃哈哈)
迷迭香酸(111871-201706)、6-姜辣素(111833-201705/111833-201805)、和厚朴酚(110730-201614)、厚朴酚(110729-201714)购买于中检院。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、半夏厚朴汤制剂多成分含量测定方法
半夏厚朴汤冻干粉的制备：按重量份计，取半夏2份，厚朴1.5份，茯苓2份，生姜2.5份，苏叶1份，加8倍量水，武火煎煮至沸腾，用文火再煎煮30min，双层纱布趁热过滤，所得滤液为一煎样品，放冷；所得滤渣继续加5倍量水，武火煎煮至沸腾，后文火煎煮18min，双层纱布趁热过滤，所得滤液为二煎样品，与一煎样品混合，冻干即可，备用。
迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚含量测定的方法包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚对照品适量，加甲醇溶解；制备的每1mL对照品溶液中含有迷迭香酸35μg、6-姜辣素40μg、和厚朴酚30μg、厚朴酚45μg；
(2)供试品溶液的制备：称取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密加入50％甲醇20mL，称重；超声下提取60min；放冷；加50％甲醇补至原重，过滤，滤液即为供试品溶液；
(3)：色谱检测条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B；流速为1mL/min；色谱条件如下表：
；其中迷迭香酸检测波长为329nm，理论板数按迷迭香酸计算不低于3000；6-姜辣素检测波长为280nm，理论板数按6-姜辣素计算不低于3000；和厚朴酚以及厚朴酚的检测波长为294nm，理论板数按和厚朴酚计算不低于3000；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，按照步骤(3)色谱条件测定，采用外标两点法计算检测迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚的含量。
一、含量测定方法的筛选
1.1、供试品溶液的提取溶剂筛选
(1)色谱条件
①迷迭香酸(紫苏)：采用岛津HPLC(DGU-20AT)，乙腈-0.2％磷酸水＝18：82系统洗脱，流速1ml/min，柱温30摄氏度，检测波长329nm，进样量10μl，色谱柱：Diamonsil Plus5um C18，250*4.6mm(Cat#99403Ser#2037294)
②6-姜辣素(生姜)：采用岛津HPLC(DGU-20AT)，色谱条件为乙腈-甲醇-水(40∶5∶55)为流动相，流速1ml/min，进样量20ul，柱温35摄氏度，检测波长280nm，色谱柱DiamonsilC18(2)5μ250*4.6mm(cat.no.99603ser.no.201042922)
③和厚朴酚、厚朴酚(厚朴)：采用安捷伦1200HPLC：以甲醇-水(78：22)为流动相，检测波长为294nm；柱温30摄氏度；进样量10ul，色谱柱：Diamonsil5um C18(2)250*4.6mm(DIKMA Cat#99603Ser#201054330)。
(2)供试品制备：称取BXHPT-4冻干粉(混合均匀)约0.2g，分别加入水、10％甲醇、50％甲醇、乙酸乙酯10ml，超声处理30min，放冷，补重，过0.22um滤膜备用。其中10％甲醇、50％甲醇和100％甲醇分别指的是甲醇与纯净水混合的体积比。
将标准品：迷迭香酸高浓度0.717mg/ml，低浓度0.00717mg/ml、6-姜辣素高浓度0.854mg/ml，低浓度0.01708mg/ml、和厚朴酚高浓度0.391mg/ml，低浓度0.00782mg/ml、厚朴酚高浓度0.399mg/ml，低浓度0.00798mg/ml。按照外标两点法，制备标准曲线：
迷迭香酸Y＝2,754,704.44X-29,815.81；
6-姜辣素Y＝519235X-5113.3；
和厚朴酚Y＝1475.8X+3.9958；
厚朴酚Y＝1389.6X+3.4104
以上Y代表峰面积，X代表进样量μg。
将供试品溶液制备方法中不同的提取溶剂测定的样品峰面积带入上述标准曲线中，不同指标的含量测定见表1。
表1.供试品溶液制备方法中不同提取溶剂测定的指标峰面积和含量
注：样品平行制备2份，每份样品进2针；“-”：未检测到
由表1可知，供试品溶液制备方法中提取溶剂为50％甲醇时，4个指标成分的含量均较高且稳定，因此考虑用同一供试品制备方法、以及同一个色谱条件对复方进行含量测定。
1.2色谱条件的筛选
流动相梯度洗脱条件考察：按照实施例1中多成分含量测定方法测定指标含量，不同之处在于色谱条件为乙腈为流动相A，水为流动相B梯度洗脱，洗脱条件如下表
| 时间(min) | 乙腈(A) | 水(B) |
| 0 | 20 | 80 |
| 15 | 24 | 76 |
| 30 | 60 | 40 |
| 40 | 70 | 30 |
；其余条件相同。实施例1测定方法得到的谱图如图1所示，以乙腈为流动相A，水为流动相B梯度洗脱得到的谱图如图2所示。图1为供试品溶液分别在329nm、280nm以及294nm下检测得到的谱图，图1中1为迷迭香酸(329nm)、2为6-姜辣素(280nm)3为和厚朴酚(294nm)、4为厚朴酚(294nm)。由图1和图2对比可知，乙腈(A)-水(B)梯度洗脱程序中6-姜辣素的色谱峰有轻微的分裂现象，乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)梯度洗脱程序中峰分离度更好。
1.3供试品溶液的提取方式筛选
按照实施例1中含量测定方法测定指标含量，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的提取方式分别采用超声提取30min和浸渍提取24h，其余步骤相同。
按照外标两点法，制备标准曲线：
混标高浓度的配制：取迷迭香酸标准品(0.717mg/ml)0.6ml，6-姜辣素标准品(0.854mg/ml)0.5ml，和厚朴酚(0.391mg/ml)厚朴酚(0.399mg/ml)混标0.6ml，共计1.70ml混合后得混标高浓度对照品。其中迷迭香酸浓度0.2531mg/ml，6-姜辣素浓度0.2512mg/ml，和厚朴酚0.1380mg/ml，厚朴酚0.1408mg/ml；
混标低浓度的配制：取迷迭香酸标准品(0.00717mg/ml)0.5ml，6-姜辣素标准品(0.01708mg/m1)0.5ml，和厚朴酚标准品(0.00782mg/m1)、厚朴酚标准品(0.00798mg/ml)混标0.5ml，共计1.50ml混合后得混标低浓度对照品。其中迷迭香酸浓度0.00239mg/ml，6-姜辣素浓度0.00569mg/ml，和厚朴酚浓度0.00261mg/ml，厚朴酚0.00266mg/ml。
迷迭香酸Y＝2,893,237.28X-22,789.56；
6-姜辣素Y＝515640X+4426.2；
和厚朴酚Y＝1,560,317.71X+773.56；
厚朴酚Y＝1,434,199.99X+502.42；
以上Y代表峰面积，X代表进样量μg。
将供试品溶液制备方法中不同的提取方式测定的样品峰面积带入上述标准曲线中，不同指标的含量测定见表2。
表2.供试品溶液制备方法中不同提取方式测定的指标峰面积和含量
注：样品平行制备2份，每份样品进2针
由表2可知，相对于浸渍24h的提取方式，超声30min提取更加节省时间，并且提取效率更高。
1.4供试品溶液的提取溶剂添加量的筛选
按照实施例1中含量测定方法测定指标含量，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的提取溶剂50％甲醇的添加量分别为5ml、10ml、20ml，其余步骤相同。标准曲线的制备同1.3中的标准曲线。将不同添加量的提取溶剂检测的不同指标的峰面积带入标准曲线，结果如表3所示。
表3.供试品溶液的提取溶剂不同添加量测定的指标峰面积和含量
注：样品平行制备2份，每份样品进2针
由表3可知，供试品溶液的制备方法中的提取溶剂50％甲醇的添加量为20ml时，各个指标的含量较高。
1.5供试品溶液的提取时间的筛选
按照实施例1中含量测定方法测定指标含量，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的超声提取的时间分别为20min、30min和60min，其余步骤相同。
标准曲线的制备同1.2中的标准曲线。将不同添加量的提取溶剂检测的不同指标的峰面积带入标准曲线，结果如表4所示。
表4.供试品溶液的超声提取溶不同时间测定的指标峰面积和含量
注：样品平行制备2份，每份样品进2针
由表4可知，超声提取60min时，各个指标成分的含量较高。
二、方法学考察
2.1专属性考察
按照实施例1的制备方法，得到迷迭香酸对照品溶液、6-姜辣素对照品溶液、及和厚朴酚对照品溶液、厚朴酚对照品溶液以及供试品溶液；按照实施例1的色谱检测条件，得到供试品溶液的谱图。图1为供试品溶液分别在329nm、280nm以及294nm下检测得到的谱图，图1中1为迷迭香酸(329nm)、2为6-姜辣素(280nm)3为和厚朴酚(294nm)、4为厚朴酚(294nm)。将上述几种对照品溶液混合后制得混合对照品溶液，按照实施例1的色谱检测条件检测，得到图3的图谱。图3中1为迷迭香酸(329nm)、2为6-姜辣素(280nm)3为和厚朴酚(294nm)、4为厚朴酚(294nm)；由图1和图3对比可知，供试品中所测目标成分均具有较好的分离，专属性强。
2.2精密度考察
按照实施例1的制备方法中制备供试品溶液的色谱条件考察。
日内精密度：取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积，计算RSD值。
日间精密度：取同一供试品溶液，分别于1、2、3天进样分析，每次连续进样3针，记录色谱图上迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积，计算RSD值。
表5日内精密度考察结果
表6日间精密度考察结果
| 编号 | 迷迭香酸峰面积 | 6-姜辣素峰面积 | 和厚朴酚峰面积 | 厚朴酚峰面积 |
| 第一天精密度1 | 1095794 | 178598 | 243048 | 170915 |
| 第一天精密度2 | 1095544 | 178728 | 240707 | 171603 |
| 第一天精密度3 | 1096425 | 178860 | 242318 | 171960 |
| 第二天精密度1 | 1095649 | 178785 | 242455 | 171172 |
| 第二天精密度2 | 1095646 | 178921 | 243143 | 171456 |
| 第二天精密度3 | 1095606 | 178734 | 242428 | 171063 |
| 第三天精密度1 | 1035262 | 178392 | 246562 | 171676 |
| 第三天精密度2 | 1050285 | 178409 | 246873 | 170855 |
| 第三天精密度3 | 1061023 | 178341 | 246484 | 171543 |
| RSD | 225％ | 0.12％ | 0.93％ | 0.22％ |
由表5和表6可知，日内精密度/日间精密度4个化学成分的RSD值均小于3.00％，说明仪器精密度良好。
2.3稳定性考察
按照实施例1的制备方法中制备供试品溶液的色谱条件考察。
取同一供试品溶液，分别在室温条件下(25±5℃)保持0h、4h、9h、12h、24、48h连续进样6次，记录色谱图中迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积，计算RSD值，结果如表7所示。
表7.稳定性考察结果
由表7可知，实施例1制备的供试品溶液在室温条件下48h内稳定。
2.5线性关系考察
标准品母液的配置：
迷迭香酸：精密称取迷迭香酸标准品6.93mg，用50％甲醇定溶于10ml容量瓶中，配置成每1ml含迷迭香酸0.693mg的标准品溶液；
6-姜辣素：精密称取6-姜辣素标准品7.98mg，用50％甲醇定溶于10ml容量瓶中，配置成每1ml含6-姜辣素0.798mg的标准品溶液；
和厚朴酚：精密称取和厚朴酚标准品5.64mg，用50％甲醇定溶于10ml容量瓶中，配置成每1ml含和厚朴酚0.564mg的标准品溶液；
厚朴酚：精密称取厚朴酚标准品8.83mg，用50％甲醇定溶于10ml容量瓶中，配置成每1ml含厚朴酚0.883mg的标准品溶液；
取以上所配的各标准品母液，迷迭香酸0.693mg/ml、6-姜辣素0.798mg/ml、和厚朴酚0，564mg/ml、厚朴酚0.883mg/ml按以下方法配制线性关系考察所用的系列混合标准品。
混标①：以上已配置好的4个标准品各取1ml混合均匀，迷迭香酸0.17325mg/ml、6-姜辣素0.1995mg/ml、和厚朴酚0.141mg/ml、厚朴酚0.22075mg/ml
混标②：精密吸取混标①1ml，用50％甲醇溶液定溶到5ml容量瓶中(稀释5倍)，迷迭香酸0.03465mg/ml、6-姜辣素0.0399mg/ml、和厚朴酚0.0282mg/ml、厚朴酚0.04415mg/ml
混标③：精密吸取混标②1ml，用50％甲醇溶液定溶到5ml容量瓶中(稀释5倍)，迷迭香酸0.00693mg/ml、6-姜辣素0.00798mg/ml、和厚朴酚0.00564mg/ml、厚朴酚0.00883mg/ml
混标④：精密吸取混标③1ml，用50％甲醇溶液定溶到5ml容量瓶中(稀释5倍)，迷迭香酸0.001386mg/ml、6-姜辣素0.001596mg/ml、和厚朴酚0.001128mg/ml、厚朴酚0.001766mg/ml
混标⑤：精密吸取混标④1ml，用50％甲醇溶液定溶到2ml容量瓶中(稀释2倍)，迷迭香酸0.000693mg/ml、6-姜辣素0.000798mg/ml、和厚朴酚0.000564mg/ml、厚朴酚0.000883mg/ml
按照实施例1中的色谱条件，各混标样品进样量均为15μL(每个混标平行进样3针，n＝3)，结果如表8所示；
表8.线性关系结果
根据结果得到4个化学成分线性方程，曲线如图4所示。
迷迭香酸：Y＝2643465.58X+5698.11(Y代表峰面积，X代表进样量ug，r＝0.9999，线性范围0.01ug-2.60ug)
6-姜辣素：Y＝494168.26X+2477.65(Y代表峰面积，X代表进样量ug，r＝0.9999，线性范围0.01ug-2.99ug)
和厚朴酚：Y＝1450388.53X+5413.90(Y代表峰面积，X代表进样量ug，r＝0.9999，线性范围0.01ug-2.12ug)
厚朴酚：Y＝1348645.92X+7731.36(Y代表峰面积，X代表进样量ug，r＝0.9999，线性范围0.01ug-3.31ug)
由图4可知，本发明线性关系良好。
2.6重复性考察
取同一份半夏厚朴汤冻干粉，按实施例1供试品溶液制备方法，分别平行制备6份。按照实施例1的色谱条件检测，结果如表9所示。
表9.重复性考察结果
| 编号 | 称样量(g) | 迷迭香酸百分含量 | 6-姜辣素百分含量 | 和厚朴酚百分含量 | 厚朴酚百分含量 |
| 重复性1 | 0.2008 | 0.2733％ | 0.2361％ | 0.1138％ | 0.0825％ |
| 重复性2 | 0.2038 | 0.2703％ | 0.2345％ | 0.1091％ | 0.0802％ |
| 重复性3 | 0.2018 | 0.2717％ | 0.2359％ | 0.1147％ | 0.0830％ |
| 重复性4 | 0.2044 | 0.2758％ | 0.2375％ | 0.1156％ | 0.0834％ |
| 重复性5 | 0.2029 | 0.2750％ | 0.2376％ | 0.1155％ | 0.0832％ |
| 重复性6 | 0.2015 | 0.2730％ | 0.2358％ | 0.1149％ | 0.0830％ |
| 平均百分含量(％) | 0.2732％ | 0.2362％ | 0.1139％ | 0.0826％ | |
| RSD | 0.75％ | 0.49％ | 2.17％ | 1.43％ |
由表9可知，RSD值均小于3％，重复性符合要求。
2.7加样回收率考察
(1)标准品的配制：
取标准曲线所用母液迷迭香酸(0.693mg/ml)，精密吸取5ml母液，用50％甲醇稀释10倍，得回收率实验所用迷迭香酸标准品溶液(0.0693mg/ml)；
取标准曲线所用母液6-姜辣素(0.798mg/ml)，精密吸取3ml，用50％甲醇稀释10倍，得回收率实验所用6-姜辣素标准品溶液(0.0798mg/ml)；
取标准曲线所用母液和厚朴酚(0.564mg/ml)，精密吸取2ml，用50％甲醇稀释10倍，得回收率实验所用和厚朴酚标准品溶液(0.0564mg/ml)；
取标准曲线所用母液厚朴酚(0.883mg/ml)，精密吸取1ml，用50％甲醇稀释10倍，得回收率实验所用厚朴酚标准品溶液(0.0883mg/ml)
(2)加样回收率供试品制备：
按照样品中待测成分含量与标准品加入量之比为1∶1，进行加样回收率实验，样品中4个待测成分含量根据重复性实验所得含量结果进行计算。
按照供试品制备方法，精密称取重复性实验所用半夏厚朴汤冻干粉0.1g，精密加50％甲醇10ml，再逐次精密加入迷迭香酸标准品溶液4ml(0.0693mg/ml)、6-姜辣素3ml(0.0798mg/ml)、和厚朴酚标准品2ml(0.0564mg/ml)、厚朴酚标准品1ml(0.0883mg/ml)，共计20mL，称重，超声处理60min，放冷，补重，过0.22um滤膜备用。以上样品平行制备8份。
回收率＝(实测含量-样品中所目标成分含量)/加入量*100％。
(3)色谱条件：同实施例1中的色谱条件
测试结果如表10.1、表10.2、表10.3和表10.4所示，由表10.1、表10.2、表10.3和表10.4可得到如下结论：
①迷迭香酸：重复性计算结果样品中迷迭香酸的百分含量为0.27％，处于0.1％-1％之间(根据2015版《中国药典》四部“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”，回收率限度为90-108％)，8个迷迭香酸的回收率结果均在96.1％-102.7％之间，均值为98.8％，RSD值为2.67％，迷迭香酸的回收率符合要求。
②6-姜辣素：重复性计算结果样品中6-姜辣素的百分含量为0.24％，处于0.1％-1％之间(根据2015版《中国药典》四部“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”，回收率限度为90-108％)，8个6-姜辣素的回收率结果均在97.0％-103.2％之间，均值为99.8％，RSD值为2.04％，6-姜辣素的回收率符合要求。
③和厚朴酚：重复性计算结果样品中和厚朴酚的百分含量为0.11％，处于0.1％-1％之间(根据2015版《中国药典》四部“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”，回收率限度为90-108％)，8个和厚朴酚的回收率结果在90.2％-96.8％之间，均值为92.8％，RSD值为2.77％，和厚朴酚的回收率符合要求。
④厚朴酚：重复性计算结果样品中厚朴酚的百分含量为0.08％，处于0.01％-0.1％之间(根据2015版《中国药典》四部“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”，回收率限度为85-110％)，8个和厚朴酚回收率测定结果在88.5％-94.7％之间，均值为90.9％，RSD值为2.43％，厚朴酚的回收率符合要求。
表10.1 迷迭香酸回收率
表10.2 6-姜辣素回收率
表10.3 和厚朴酚回收率
表10.4 厚朴酚回收率
2.8不同批次样品含量测定
按照实施例1的方法，取16个批次半夏厚朴汤冻干粉，平行制备两份，每份平行进样2针，进行测定，测定结果如表11.1所示；并对其中同一批次半夏厚朴汤冻干粉BXHPT-14的重复性样品进行测定，结果如表11.2所示。
表11.1 16个批次半夏厚朴汤冻干粉的含量测定结果(n＝2，
)
*：按第一份BXHPT-14-1样品计
表11.2 BXHPT-14批次半夏厚朴汤冻干粉重复性样品测定结果
由表11.1和表11.2可知，参考以上样品测定结果的范围，在最小值的基础上，暂定本品每1g含迷迭香酸(C18H16O8)不低于0.2mg，含6-姜辣素(C17H26O4)不低于1mg，含和厚朴酚(C18H18O2)、厚朴酚(C18H18O2)含量之和不低于0.5mg。同一批次制备的半夏厚朴汤冻干粉中，迷迭香酸，6-姜辣素，厚朴酚、和厚朴酚之和的含量测试稳定。
实施例2、半夏厚朴汤制剂特征图谱
特征图谱的建立方法步骤如下：
步骤S1：参照物溶液的制备：取木兰苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含100μg的溶液；
步骤S2：供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密称定，加入50％甲醇25mL后称重，超声处理30min，放冷后补充50％甲醇至原重，即得；
步骤S3：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B，流速为0.8mL/min，检测波长为230nm。理论板数按木兰苷A峰计算不低于2500，色谱条件如下表
步骤S4：测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20uL，注入液相色谱仪，按照步骤S3中的色谱条件测定，记录色谱图，如图5所示。
特征图谱中各特征峰与参照峰的相对保留时间分别为：1号峰0.54；2号峰0.67；3号峰0.73；4号峰0.88；5号峰参照峰1.00；6号峰1.17；7号峰1.25；8号峰1.38；9号峰1.69；10号峰1.75；11号峰1.80。
三、特征图谱中各特征峰的归属和指认
化合物对照品制备：分别选择迷迭香酸、咖啡酸、野黄芩苷、生姜混合标准品(分别制备6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的标准品后进行混合)、和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、木兰苷A、木兰苷B标准品，按照实施例2中参照物的制备方法，按照实施例2中的色谱条件进行检测，得到的不同标准品的HPLC光谱图；根据出峰时间及色谱峰的紫外吸收光谱对实施例2中特征图谱的主要色谱峰进行鉴定。
单味药材水提物冻干粉：分别取紫苏、厚朴、生姜各单味药材30g，置于电磁煎药锅中(参数：陶瓷，4升)，加8倍量水，浸泡30min后，盖干煎煮。武火加热至沸腾后，再用文火再煎煮30min，趁热过滤，得一煎样品；剩余残渣再加水5倍量水，武火加热至沸腾后，再用文火煎煮20min，趁热过滤，得二煎样品，合并一煎、二煎样品，不经浓缩直接冷冻干燥，依次得到。紫苏水提物冻干粉、厚朴水提物冻干粉、生姜水提物冻干粉。
单味药材对照品制备：依次称取单味药材水提物冻干粉0.2g，精密加入50％甲醇25ml，称重，超声处理30min，放冷，补充至原重，过0.22μm滤膜，依次得到不同单味药材对照品。按照实施例2中的色谱条件检测，分别得到紫苏单味药材、厚朴单味药材、生姜单味药材的色谱图。
3.1厚朴相关化合物的比对
图6中由上至下依次为厚朴单味药的色谱图、木兰花碱标准品的色谱图、木兰苷B标准品的色谱图、木兰苷A标准品的色谱图；图7中由上至下依次为厚朴单味药的色谱图、和厚朴酚标准品的色谱图以及厚朴酚标准品的色谱图。
将图6、图7与图5对比可知，特征图谱中峰1：源于厚朴药材，峰2：源于厚朴药材中的化合物木兰花碱，峰4：源于厚朴药材中的化合物木兰苷B，峰5：源于厚朴药材中的化合物木兰苷A，峰10：源于厚朴药材中的化合物和厚朴酚，峰11：源于厚朴药材中的化合物厚朴酚。
3.2紫苏相关化合物的比对
图8中由上至下依次为紫苏单味药的色谱图、迭香酸标准品标准品色谱图、野黄芩苷标准品的色谱图、咖啡酸标准品的色谱图。
将图8与图5对比可知，特征图谱中峰3：源于紫苏叶中的化合物咖啡酸，峰6：源于紫苏药材，峰7：源于紫苏叶中的化合物野黄芩苷，峰8：源于紫苏叶中的化合物迷迭香酸。
3.3生姜相关化合物的比对
图9中由上至下依次为生姜单味药材的色谱图、生姜混合标准品(6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚)的色谱图。将图9与图5对比可知，特征图谱中：峰9：源于生姜中的化合物6-姜辣素。
四、特征图谱制备方法的筛选
4.1特征图谱制备方法中供试品溶液提取溶剂的筛选
按照实施例2中的供试品溶液制备方法，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的提取溶剂和补充至原重的溶剂分别为20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇，其余步骤相同。色谱条件同实施例2。提取溶剂为20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇得到的HPLC图谱分别为如图10中A、B、C、D所示。由图10可知，50％甲醇提取的色谱图峰较多，峰型较好。
4.2特征图谱制备方法中供试品溶液提取时间的筛选
按照实施例2中的供试品溶液制备方法，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的超声提取时间分别为20min、30min和60min，其余步骤相同。色谱条件同实施例2。超声提取时间为20min、30min和60min得到的HPLC图谱分别如图11A、B、C所示。由图11可知，超声提取20min、30min、60min对色谱图无太大区别，为了节省时间，最终确定最佳提取时间为超声提取20min。
4.3特征图谱制备方法中供试品溶液提取溶剂添加量的筛选
按照实施例2中的供试品溶液制备方法，不同之处的在于供试品溶液的制备方法中的提取溶剂50％甲醇的添加量分别为10ml、25ml、50ml，其余步骤相同。色谱条件同实施例2。提取溶剂50％甲醇的添加量为10ml、25ml、50ml得到的色谱图分别如图12A、B、C所示。由图12可知，加入25ml 50％甲醇的色谱图更好。
五、精密度考察
取同一份供试品，连续进样5次，测试结果如表12.1和表12.2所示。主要共有峰的保留时间的RSD为0.11-0.00％，以木兰苷A(峰号5，平均Rt＝73.20min)为参照物(S)，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0.14-0.00％；参照物色谱峰面积的RSD为0.36％，主要共有峰的峰面积的RSD为7.29-0.01％。以上结果说明该特征图谱条件下各共有峰出峰时间稳定，仪器精密度良好。
表12.1 精密度考察结果(出峰时间min)
说明：相对出峰时间以木兰苷A(峰号5，Rt＝73.20min)为参照
表12.2 精密度考察结果(峰面积)
六、稳定性考察
按照实施例2的供试品溶液制备方法和色谱条件，取同一份供试品溶液，分别于制备后3h、9h、12h、21h、27h五个时间点进样，计算共有峰的峰面积和保留时间的RSD值(结果见表13.1和表13.2)。共有峰的保留时间的RSD为0.14-0.01％，以木兰苷A(峰号5，平均Rt＝73.19min)为参照物(S)，主要共有峰的相对保留时间的RSD为0.19-0.01％；参照物色谱峰面积的RSD为0.45％，其它共有峰的峰面积的RSD为13.01-0.06％。以上结果说明供试品在常温放置条件下，27小时内样品稳定性良好。
表13.1 样品稳定性考察结果(出峰时间min)
说明：相对出峰时间以木兰苷A(峰号5，Rt＝73.19min)为参照
表13.2 样品稳定性考察结果(峰面积)
七、重复性考察
取同一份半夏厚朴汤冻干粉，按照实施例2中供试品溶液制备方法，平行制备5份，按实施例2中色谱条件进行测定，计算共有峰的峰面积和保留时间的RSD值(结果见表14.1和表14.2)。共有峰的保留时间的RSD为0.07-0.00％，以木兰苷A(峰号5，平均Rt＝73.18min)为参照物，共有峰的相对保留时间的RSD为0.09-0.01％；参照物色谱峰面积的RSD为0.53％，其他共有峰的峰面积的RSD为12.52-0.29％。以上结果说明重复性较好。
表14.1 重复性考察结果(保留时间，min)
说明：相对出峰时间以木兰苷A(峰号5，平均Rt＝73.18min)为参照
表14.2 重复性考察结果(峰面积)
| 编号 | 峰归属 | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | RSD |
| 1 | 39.41 | 1511632 | 1321006 | 1510585 | 1517216 | 1506856 | 5.79％ |
| 2 | 49.31 | 1541936 | 1540805 | 1514759 | 1514758 | 1513692 | 0.97％ |
| 3 | 53.65 | 1024737 | 1030587 | 1022501 | 962428 | 951068 | 3.83％ |
| 4 | 64.76 | 3105157 | 3089227 | 3098762 | 3133365 | 3121986 | 0.57％ |
| 5 | 73.18 | 1565019 | 1552748 | 1556584 | 1573878 | 1566058 | 0.53％ |
| 6 | 85.58 | 704596 | 698581 | 696458 | 701505 | 699407 | 0.44％ |
| 7 | 91.33 | 433339 | 426972 | 430224 | 339274 | 341061 | 12.52％ |
| 8 | 101.06 | 449009 | 446638 | 500809 | 500267 | 497078 | 5.91％ |
| 9 | 123.57 | 1159018 | 1155492 | 1157136 | 1163079 | 1154869 | 0.29％ |
| 10 | 128.43 | 282028 | 293488 | 293039 | 289886 | 292246 | 1.63％ |
| 11 | 131.74 | 1252461 | 1276073 | 1274271 | 1265893 | 1266489 | 0.74％ |
八、样品测定
按照实施例2中特征图谱的建立方法，对16个批次的半夏厚朴汤冻干粉进行测定，结果如表15.1和表15.2所示，所有特征图谱中均呈现11个特征峰。
表15.1 不同批次半夏厚朴汤冻干粉特征图谱绝对保留时间(min)
表15.2 不同批次半夏厚朴汤冻干粉特征图谱相对保留时间
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，包括多成分含量测定和特征图谱；所述多成分含量测定包括对半夏厚朴汤中的迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚进行含量测定；所述特征图谱包括11个特征峰。
2.根据权利要求1所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，所述半夏厚朴汤制剂为半夏厚朴汤冻干粉。
3.根据权利要求2所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚含量测定的方法包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚对照品适量，加甲醇溶解；制备的每1mL对照品溶液中含有迷迭香酸35μg、6-姜辣素40μg、和厚朴酚30μg、厚朴酚45μg；
(2)供试品溶液的制备：称取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密加入50％甲醇20mL，称重；超声下提取60min；放冷；加50％甲醇补至原重，过滤，滤液即为供试品溶液；
(3)色谱检测条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B；流速为1mL/min；色谱条件如下表：
其中迷迭香酸检测波长为329nm，理论板数按迷迭香酸计算不低于3000；6-姜辣素检测波长为280nm，理论板数按6-姜辣素计算不低于3000；和厚朴酚以及厚朴酚的检测波长为294nm，理论板数按和厚朴酚计算不低于3000；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，按照步骤(3)色谱条件测定，计算检测迷迭香酸、6-姜辣素、和厚朴酚以及厚朴酚的含量。
4.根据权利要求2所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，每1g半夏厚朴汤冻干粉中迷迭香酸含量不低于0.2mg，6-姜辣素含量不低于1mg，和厚朴酚以及厚朴酚的含量之和不低于0.5mg。
5.根据权利要求3或4任意一项所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，计算的方法为采用外标两点法或标准曲线法。
6.根据权利要求1所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，所述特征图谱的建立方法步骤如下：
步骤S1：参照物溶液的制备：取木兰苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含100μg的溶液；
步骤S2：供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤冻干粉0.2g，精密称定，加入50％甲醇25mL后称重，超声处理30min，放冷后补充50％甲醇至原重，即得；
步骤S3：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸水为流动相，其中乙腈为流动相A，0.2％磷酸水为流动相B；流速为0.8mL/min，检测波长为230nm；理论板数按木兰苷A峰计算不低于2500，
；
步骤S4：测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20uL，注入液相色谱仪，按照步骤S3中的色谱条件测定，记录色谱图，即得。
7.根据权利要求6所述的半夏厚朴汤制剂的质量控制方法，其特征在于，各特征峰与参照峰的相对保留时间分别为：1号峰0.54；2号峰0.67；3号峰0.73；4号峰0.88；5号峰参照峰1.00；6号峰1.17；7号峰1.25；8号峰1.38；9号峰1.69；10号峰1.75；11号峰1.80。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210903 |
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