CN110274962B - 一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分含量测定方法，所述方法包括以下步骤：A对照品溶液制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成丹参素钠的对照品溶液；B供试品溶液制备:取芪参益气滴丸，精密称定，超声溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；C测定：分别精密吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图采用归一法计算芪参益气滴丸中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A的含量。

Description

一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分含量测定方法

技术领域：

本发明涉及一种中药成分的含量测定方法，特别涉及一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分含量测定方法。

背景技术：

芪参益气滴丸为天士力心血管疾病用药市场布局的重要产品，常用于气虚血瘀型胸痹、症见胸闷胸痛，气短乏力，心悸、面色少华、自汗、舌体胖有齿痕、舌质暗或紫暗有瘀斑，脉沉或沉弦，适用于冠心病心绞痛见上述证候者，与我公司复方丹参滴丸起到相互补充作用。

芪参益气滴丸处方由丹参、三七、黄芪、降香四味组成，其中丹参药材富含多种酚酸类化合物，文献研究表明，酚酸类化合物尤其是丹酚酸L/M具有显著的抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化以及预防心血管疾病的作用，是芪参益气滴丸中主要有效成分之一，也是重点质量控制指标。现行质量标准中采用HPLC(高效液相色谱)法对芪参益气滴丸中丹参素含量进行定量控制，也未对丹酚酸L/M进行检测。丹酚酸L/M在芪参益气滴丸中起着很重要的作用，文献报道，具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和抗血栓形成等药理作用

本发明于采用UPLC对芪参益气滴丸丹参中多种酚酸类成分进行研究，结合指纹图谱技术，以单一对照品(丹参素钠)为参照，利用随行线性试验计算校正因子，并以校正因子对丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A四种成分进行含量测定，建立丹参多酚酸指纹图谱和利用单一对照品同时定量多个成分的(一测多评)含量测定检测方法，以达到全面控制产品质量的目的。

通过文献及专利查阅，与芪参益气滴丸相关专利包括药理作用、制剂工艺、药材提取和成分测定等四个方面，其中涉及有效成分测定的共有2篇，分别为《一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法》(CN103926366B)、《快速检测滴丸剂有效成分含量的近红外漫反射光谱法》(CN1982874B)。专利《一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法》中申报了关于芪参益气滴丸中三七、黄芪、降香三味成分的薄层鉴别方法和丹参中丹参素成分的HPLC含量测定方法，《快速检测滴丸剂有效成分含量的近红外漫反射光谱法》中采用近红外光谱法对芪参益气滴丸制剂中有效成分进行检测，以上两种检测方法仅控制丹参素含量，对有效成分的控制较为单一；另有文献《芪参益气滴丸多维指纹图谱研究》(陈慧贞，浙江大学硕士学位论文)中对芪参益气滴丸中丹参成分进行指纹图谱研究，但并未对其中成分进行定量。相比以上专利及相关文献中方法，本发明的分析方法其特点主要在于在同一次分析中可以将芪参益气滴丸丹参中的成分同时进行定性及定量的测定，在定量的过程中仅使用一种对照品即可实现4种成分的测定，较之以往发表论文及申请专利的分析方法，本方法具有提高分析效率、降低人力物力等成本的优势。

发明内容：

本发明提供一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分检测方法，其特征在于，包括以下步骤

A对照品溶液制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成丹参素钠的对照品溶液；

B供试品溶液制备:取芪参益气滴丸，精密称定，超声溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

C测定：分别精密吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据色谱图使用相对校正因子计算芪参益气滴丸中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A的含量；

其中所述超高效液相色谱的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

表1，流动相梯度洗脱表

或

表2，流动相梯度洗脱表

或

表3，流动相梯度洗脱表

优选的，本发明的检测方法，其中，

步骤A对照品溶液制备

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加70％～80％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.12～0.20mg的对照品溶液；

步骤B供试品溶液制备

取芪参益气滴丸0.25g-0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为10min-20min

步骤C测定中，流动相A为0.045％～0.055％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.35～0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温38～42℃

最优选的，本发明的检测方法，步骤如下：

【对照品溶液制备】取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液；

【供试品溶液制备】取本品约0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

步骤C测定中，【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表4进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；

表4流动相梯度洗脱表

【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图(记录13分钟即可)，以丹参素对照品峰面积为参照，以其相应色谱峰为S峰，分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A的含量。

经测定，原儿茶醛相对保留时间为1.492±0.005，迷迭香酸相对保留时间为4.283±0.024，丹酚酸A相对保留时间为5.280±0.058

原儿茶醛相对校正因子为0.1593±0.003，迷迭香酸相对校正因子为0.4184±0.012，丹酚酸A相对校正因子为0.2521±0.005。

本发明进一步提供一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分指纹图谱建立方法，所述方法，包括以下步骤

A对照品溶液制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成丹参素钠的对照品溶液；

B供试品溶液制备:取多批次合格的芪参益气滴丸，精密称定，超声溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

C测定：分别吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱。

优选的，其中，

步骤A对照品溶液制备，方法如下：

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加70％～80％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.12～0.20mg的对照品溶液；

B供试品溶液制备，方法如下：

取取多批次合格的芪参益气滴丸0.25g-0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为10min-20min

所述超高效液相色谱的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为0.045％～0.055％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.35～0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温38～42℃

按下表进行梯度洗脱：

表5，流动相梯度洗脱表

或

表6，流动相梯度洗脱表

或

表7，流动相梯度洗脱表

最优选的，其中，

【对照品溶液制备】取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液；

【供试品溶液制备】取取多批次合格的芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表8进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；

表8流动相梯度洗脱表

【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图(记录13分钟即可)，以丹参素对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱。

其中，所述计算机模型为中药色谱指纹相似度评价系统，所得图谱包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸L/M、迷迭香酸、丹酚酸A在内的9个共有峰。其中以下4个成分的相对保留时间如下：

表9，

本发明还提供一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，所述方法，步骤如下：

A供试品溶液制备，方法如下：

取芪参益气滴丸0.25g-0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为10min-20min

B测定：将供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，

所述超高效液相色谱的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为0.045％～0.055％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.35～0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温38～42℃

按下表进行梯度洗脱：

表10，流动相梯度洗脱表

或

表11，流动相梯度洗脱表

或

表12，流动相梯度洗脱表

C所得色谱图和芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。最优选的，其中，

【供试品溶液制备】取芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表13进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；

表13流动相梯度洗脱表

【测定法】精密吸取供试品溶液2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图(记录13分钟即可)，所得色谱图和芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

一种检测芪参益气滴丸质量检测的方法，所述方法步骤如下：

【对照品溶液制备】取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液。

【供试品溶液制备】取本品约0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得。

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表14进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃。

表14流动相梯度洗脱表

【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图(记录13分钟即可)，与标准图谱比对；并以丹参素对照品峰面积为参照，以其相应色谱峰为S峰，分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A的含量；丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A相对保留时间应在规定值的±5％范围之内。

标准图谱及相对保留时间、相对校正因子见图1、表15：

表15相对保留时间及校正因子

在以下范围也是可以的，原儿茶醛相对保留时间为1.492±0.005，迷迭香酸相对保留时间为4.283±0.024，丹酚酸A相对保留时间为5.280±0.058

原儿茶醛相对校正因子为0.1593±0.003，迷迭香酸相对校正因子为0.4184±0.012，丹酚酸A相对校正因子为0.2521±0.005。

计算公式(每1mg丹参素相当于丹参素钠0.9mg)：

芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分质量检测方法，包括建立丹参多酚酸指纹图谱检测法和利用单一对照品同时定量多个成分的(一测多评)含量测定检测方法。

对现将以上方法建立情况进行如下说明。

3.0研究过程

研究内容包括：(1)对原有供试品提取固液比、色谱条件进行优化，提高色谱峰分离度，使其整体能够满足指纹图谱和含量测定(一测多评)的要求；(2)含量测定(一测多评法)相对保留时间和校正因子的确定；(3)指纹图谱和含量测定方法学验证。

具体研究过程如下：

3.1供试品取样量的确定由于丹参中酚酸类成分多为水溶性，分别取供试品1.0g、0.5g、0.35g、0.3g、0.25g于10ml容量瓶中，以纯化水为提取溶剂，超声溶解，定容摇匀，考察各取样量下丹参素色谱峰理论塔板数。结果表明取样量为0.35g时，丹参素色谱峰理论塔板数最高，故确定取样量为0.35g(见图2-1至2-5)。

3.2色谱条件的确定

3.2.1流动相体系选择

本次实验中，主要考察乙腈-磷酸溶液、甲醇-乙腈-水两种不同流动相体系，结果表明采用甲醇-乙腈-水系统洗脱，色谱峰分离度较差，采用乙腈-磷酸溶液能使基线平稳，保证色谱峰良好分离。

3.2.2梯度洗脱程序的确定

由于制剂中成分较为复杂，尝试100余种不同梯度洗脱方式，确定最佳洗脱梯度如表16。

表16流动相梯度洗脱表

最终确定色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按表16进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃(典型色谱图见图3)。

3.3指纹图谱的确定

3.3.1色谱峰归属

按3.2.2中色谱条件试验，分别取丹参素、原儿茶醛、丹酚酸L/M、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等对照品对指纹图谱中各色谱峰进行归属指认，供试品色谱中能够检测以上7种成分色谱峰，见图3

3.3.2共有峰及含量测定指标确定

取11批芪参益气滴丸样品，按以上色谱条件进行测试，利用中药色谱指纹相似度评价系统进行拟合，确定包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸L/M、迷迭香酸、丹酚酸A在内的9个共有峰和标准图谱，见图4

从指纹图谱的9个共有峰中，丹酚酸L、丹酚酸M由于分离度较差，不建议作为含量测定考察指标；丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A四个色谱峰峰面积比例较大，分离度好，故选择丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A四种成分作为定量控制指标。

3.4相对保留时间和校正因子的确定

3.4.1相对保留时间的确定

取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A对照品适量，于不同天配制一系列浓度的混合对照溶液，照3.2项下色谱条件进行随行线性试验，以丹参素色谱峰为参照峰，计算原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A相对保留时间，并以每种成分的平均相对保留时间作为该成分色谱峰的相对保留时间，具体数据见表17。

表17相对保留时间的确定

3.4.2校正因子的确定据文献资料，可采用多点法、斜率法、过原点的曲线斜率法对一测多评的校正因子进行计算，具体方法如下：

(1)多点法(MP)：即以多个浓度点计算所得校正因子的平均值作为相对校正因子f_i/s，可配制不同浓度的混合对照品溶液分别测定，或精密吸取不同体积的同一混合对照品溶液进样分析，分别计算不同体积下的f_i/s，计算公式为：

注：f_i/s为相对校正因子；C_s为参照物浓度；A_s为参照物峰面积；C_i为待测物质浓度；A_i为待测物质浓度

(2)斜率法(CC)：通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，在标准曲线y＝kx+b中，在k/b值大于100时，相对校正因子f_i/s可用二者的斜率k之比直接计算，计算公式为:

注：f_i/s为相对校正因子；k_i为待测成分标准曲线斜率；k_s为参照物标准曲线斜率；

(3)过原点的曲线斜率法(SC):通过一系列浓度的混合对照品溶液，分别测定各对照品的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率k的比值求得待测成分相对校正因子f_i/s，计算公式同斜率法。

取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A对照品适量，分别于不同天配制一系列浓度的混合对照溶液，照3.2项下色谱条件进行随行线性试验，以丹参素色谱峰为参照，分别按照多点法、斜率法、过原点的曲线斜率法计算校正因子。另取同一批样品进行测试，对比一测多评法与外标一点法计算所得原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A含量结果差异。

结果表明，采用多点法计算校正因子精密度较差，故不予采用；斜率法、过原点的曲线斜率法计算所得校正因子无显著差异，通过与外标法计算结果进行比对，发现斜率法求得含量结果与外标法最为接近，故以斜率法计算校正因子，最终确定校正因子为f_{原儿茶醛/丹参素}＝0.1593，f_{迷迭香酸/丹参素}＝0.4184，f_{丹酚酸A/丹参素}＝0.2521，具体数据见表18～21。

表18多点法校正因子数值比较表

表19，斜率法与过原点曲线斜率法校正因子比较

表20一测多评(CC)与外标法结果比对

表21一测多评(SC)与外标法结果比对

4.0方法学验证

4.1指纹图谱方法学验证

4.1.1稳定性

取本品1份，按2.0项方法制备供试品溶液，分别于0、2、3、5、7、9、12、15、18、21时进样分析，记录不同时间点下各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并与0时数据进行比较，计算RAD％，具体见表22，23。

表22相对保留时间稳定性测试结果

表23相对峰面积稳定性测试结果

表22、23结果显示，在21小时内，与0时数据相比，各时间点相对保留时间RAD在0～0.20％之间，均不大于2.0％；在9小时内，与0时数据相比，各时间点相对峰面积RAD在0～1.4％之间，均不大于2.0％，9小时后，丹酚酸A相对峰面积变化较大，故供试品溶液仅在9小时内稳定。

4.1.2重复性

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，计算各共有峰各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算9份样品中各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值，结果见表24、25。

表24相对保留时间重复性测试结果

表25相对峰面积重复性测试结果

表24、25结果显示，9份供试品中共有峰相对保留时间的RSD在0～0.095％之间，均不大于3.0％，9份供试品中共有峰相对峰面积的RSD在0～1.7％之间，均不大于3.0％。故本测试结果符合方法学验证要求。

4.1.3精密度

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，计算各共有峰各共有峰的相对保留时间及相对峰面积和各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值，结果见表26、27。

表26相对保留时间精密度测试结果

表27相对峰面积精密度测试结果

表26、27结果显示，各测试条件下9个共有峰相对保留时间的RSD在0～2.4％之间，相对峰面积的RSD在0～2.6％之间，均不大于3.0％。故精密度测试结果符合方法学验证要求。

4.2含量测定(外标一点法)方法学验证

4.2.1专属性

丹参阴性样品：按处方取黄芪、三七、降香油三味，照工艺制成不含丹参的阴性样品备用；

取芪参益气滴丸样品、丹参阴性样品，照供试品处理方法制备供试品溶液，另取混合对照溶液和空白溶剂按2.0项下色谱条件进样分析，结果见图5。

结果表明，阴性样品在丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A色谱峰处无干扰，专属性符合方法学验证规定。

4.2.2线性

线性对照品溶液的制备：以供试品溶液所含待测成分的浓度为100％，分别制备6个不同浓度的混合对照品溶液，其浓度范围应至少为70％～130％；

分别取上述对照品溶液，按照2.0项下分析方法进行色谱分析，绘制“浓度-峰面积”标准曲线，结果见表28。

表28线性测试结果

表28结果显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A四种成分标准曲线相关系数r在0.9997～0.99998之间，均不小于0.999；b/k值在0.000053～0.026之间，小于1％。线性测试结果符合方法学验证要求。

4.2.3稳定性

取本品1份，按2.0项方法制备供试品溶液，分别于0、2、3、5、7、9、12、15、18、21时进样分析，记录不同时间点下丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A色谱峰面积，并与0时数据进行比较，计算RAD％，具体见表29

表29溶液稳定性测试结果

表29结果显示，9小时内，与0时数据相比，各时间点峰面积RAD在0.012％～1.3％之间，均不大于2.0％；9小时后，丹酚酸A峰面积变化较大，与0时RAD最高为6.1％，故供试品溶液仅在9小时内稳定。

4.2.4重复性

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，计算各待测成分含量、每个浓度水平下3份样品中各待测成分RSD和9份样品中各待测成分RSD值，结果见表30。

表30重复性测试结果(含量均以mg/g计)

结果显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A4种化合物，3个浓度的3份平行样含量的RSD在0.11％～1.0％，均不大于2.0％；9份供试品含量结果的RSD在0.41％～2.2％之间，均不大于3.0％，重复性测试结果符合要求。

4.2.5中间精密度

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平制备1份，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，计算各待测成分含量及所有含量结果RSD值，结果见表31。

表31中间精密度测试结果(含量均以mg/g计)

结果显示，不同测试条件下丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A4种化合物所测得样品含量RSD在0.27％～1.7％之间，均不大于2.0％；各测试条件测得各成分所有含量的RSD在1.9％～2.3％之间，均不大于3.0％，中间精密度测试结果符合标准要求。

4.2.6准确度

取本品1批，分别称取相当于取样量50％供试品，分别加入丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A对照溶液，使各待测组分达到70％、100％、130％浓度水平，每个浓度水平制备3份，按2.0项下色谱条件，计算各待测成分回收率及回收率RSD值，结果见表32。

表32准确度测试结果

结果显示，不同浓度水平下样品中待测物含量的平均回收率在99.05～100.43％之间，在标准要求范围内；RSD在1.7％～2.7％之间，均不大于3.0％，准确度测试结果符合标准要求。

4.3含量测定(一测多评法)方法学再验证

结合以上研究结果，利用一测多评法对含量测定方法进行关键项目再验证，以确定该方法的可行性。本次验证主要针对方法的重复性、中间精密度、准确度等项目展开，计算结果与外标法进行对比，其它项目(专属性、线性、稳定性等)结果同4.2.1、4.2.2、4.2.3项下。

4.3.1重复性

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按2.0项下色谱条件进样分析，按一测多评法计算各待测成分相对保留时间成分含量、每个浓度水平下3份样品中各待测成分含量RSD和9份样品中各待测成分含量RSD值，结果见表33、34。

表33相对保留时间

表34重复性测试结果(含量均以mg/g计)

结果显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A4种化合物，保留时间均在±5％范围内，各浓度水平含量结果RSD在0.11％～1.0％，均不大于2.0％；9份供试品含量结果的RSD在0.41％～2.2％之间，均不大于3.0％；含量均值与外标法含量结果比较RAD在0.019％～0.83％之间，均不大于3.0％，重复性测试结果符合标准要求。

4.3.2中间精密度

取本品1批，分别制备相当于取样量70％、100％、130％水平的供试品溶液，每个浓度水平制备1份，按2.0项下色谱条件，分别于不同时间、由不同人员、采用不同仪器进样分析，按一测多评法计算各待测成分相对保留时间、成分含量及所有含量结果RSD值，结果见表35、36。

表35相对保留时间

表36中间精密度测试结果(含量均以mg/g计)

结果显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A4种化合物，保留时间均在±5％范围内，各浓度水平测得含量RSD在0.27％～1.7％之间，均不大于2.0％；各测试条件测得各成分所有含量的RSD在0.27％～2.4％之间，均不大于3.0％；含量均值与外标法相应测试项目含量均值在0.16％～0.84％之间，均不大于3.0％，中间精密度测试结果符合标准要求。

4.3.3准确度

取本品1批，分别称取相当于取样量50％供试品，分别加入丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A对照溶液，使各待测组分达到70％、100％、130％浓度水平，每个浓度水平制备3份，按2.0项下色谱条件，计算各待测成分保留时间，并按一测多评法计算回收率及回收率RSD值，结果见表37、38。

表37相对保留时间

表38准确度测试结果

结果显示，丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A4种化合物，保留时间均在±5％范围内，样品中待测物含量的平均回收率在99.05～100.43％之间，在标准要求范围内；含量均值与外标法相应测试项目回收率均值RAD在0.048％～1.6％之间，均不大于3.0％，准确度测试结果符合标准要求。

综合以上结果，一测多评法与外标法计算结果无明显差异，能够用于待测成分含量测定。

附图说明

图1标准指纹图谱

图2-1取样量1.0g；理论塔板数3408

图2-2取样量0.5g；理论塔板数10201

图2-3取样量0.35g；理论塔板数29184

图2-4取样量0.3g；理论塔板数22312

图2-5取样量0.25g；理论塔板数20189

图3典型色谱图

图4色谱峰成分归属

图5共有峰及标准指纹图谱

注：从上到下：供试品溶液、混合对照溶液、丹参阴性溶液、空白溶剂

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

一种检测芪参益气滴丸检测方法，所述方法步骤如下：

【对照品溶液制备】取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液。

【供试品溶液制备】取本品约0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得。

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表39进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃。

表39流动相梯度洗脱表

【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录13分钟内色谱图，与标准图谱比对；并以丹参素对照品峰面积为参照，以其相应色谱峰为S峰，分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A的含量；丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A相对保留时间应在规定值的±5％范围之内。

实施例2

一种检测芪参益气滴丸检测方法，所述方法步骤如下：

步骤A对照品溶液制备

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.12的对照品溶液；

步骤B供试品溶液制备

取芪参益气滴丸0.25g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为10min

步骤C测定中，流动相A为0.045％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.35ml/min；检测波长为280nm；柱温38℃

表40，流动相梯度洗脱表

或

表41，流动相梯度洗脱表

或

表42，流动相梯度洗脱表

实施例3

一种检测芪参益气滴丸质量检测方法，所述方法步骤如下：

步骤A对照品溶液制备

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.20mg的对照品溶液；步骤B供试品溶液制备

取芪参益气滴丸0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为20min

步骤C测定中，流动相A为0.055％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温42℃

表43，流动相梯度洗脱表

或

表44，流动相梯度洗脱表

或

表45，流动相梯度洗脱表

实施例4，

指纹图谱的制备

【对照品溶液制备】取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液；

【供试品溶液制备】取取多批次合格的芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表46进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；

表46流动相梯度洗脱表

【测定法】分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，以丹参素对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱。

实施例5

芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，步骤如下：

【供试品溶液制备】取芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

【色谱条件】以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选2.1×100mm，1.8μm)，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表47进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；

表47流动相梯度洗脱表

【测定法】精密吸取供试品溶液2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图(记录13分钟即可)，所得色谱图和芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。

Claims (4)

1.一种芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分指纹图谱建立方法，其特征在于，包括以下步骤:

步骤A对照品溶液制备，方法如下：

取丹参素钠对照品适量，精密称定，加70％～80％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.12～0.20mg的对照品溶液；

步骤B供试品溶液制备，方法如下：

取多批次合格的芪参益气滴丸0.25g-0.50g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤B供试品溶液制备中，超声时间为10min-20min；

步骤C测定，方法如下：

分别吸取步骤A所得的对照品溶液及步骤B供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，得到芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱；

其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为0.045％～0.055％的磷酸水溶液，步骤C测定中，流速为0.35～0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温38～42℃，按下表进行梯度洗脱：

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0—1.5 93—82 7—18 1.5—4.0 82 18 4.0—5.0 82—77 18—23 5.0—7.0 77—70 23—30 7.0—11.0 70—10 30—90 11.0—12.0 10—93 90—7 12.0—13.0 93 7

。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加75％甲醇制成每毫升含丹参素钠0.16mg的对照品溶液；

供试品溶液制备：取多批次合格的芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；流动相梯度洗脱表

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0—1.5 93—82 7—18 1.5—4.0 82 18 4.0—5.0 82—77 18—23 5.0—7.0 77—70 23—30 7.0—11.0 70—10 30—90 11.0—12.0 10—93 90—7 12.0—13.0 93 7

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，以丹参素对照品峰面积为参照，根据所得多批次芪参益气滴丸合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，从而得到芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱；其中，所述计算机模型为中药色谱指纹相似度评价系统，所得图谱包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸L/M、迷迭香酸、丹酚酸A在内的9个共有峰；其中以下4个成分的相对保留时间如下：

3.一种芪参益气滴丸指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤如下：

A供试品溶液制备，方法如下：

取芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声，使溶解，定容，滤过，得续滤液，步骤A供试品溶液制备中，超声时间为10min-20min；B测定，方法如下：

将供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；

所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为0.045％～0.055％的磷酸水溶液，步骤B测定中，流速为0.35～0.45ml/min；检测波长为280nm；柱温38～42℃，按下表进行梯度洗脱：

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0—1.5 93—82 7—18 1.5—4.0 82 18 4.0—5.0 82—77 18—23 5.0—7.0 77—70 23—30 7.0—11.0 70—10 30—90 11.0—12.0 10—93 90—7 12.0—13.0 93 7

C所得色谱图和芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于

供试品溶液制备：取芪参益气滴丸0.35g，精密称定，置10ml容量瓶中，加纯化水超声15min，使溶解，定容，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％的磷酸水溶液为流动相A；以乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温40℃；流动相梯度洗脱表

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0—1.5 93—82 7—18 1.5—4.0 82 18 4.0—5.0 82—77 18—23 5.0—7.0 77—70 23—30 7.0—11.0 70—10 30—90 11.0—12.0 10—93 90—7 12.0—13.0 93 7

测定法：精密吸取供试品溶液2μl，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，所得色谱图和芪参益气滴丸中丹参多酚酸成分标准对照指纹图谱对照，符合一致为合格产品。

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