CN113368185A - 一种百合地黄汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种百合地黄汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法；所述百合地黄汤，包括：鲜百合120份，鲜地黄汁200份。本发明还涉及所述百合地黄汤物质基准的制备方法，包括：步骤1，先将鲜百合洗净，并加入400份纯净水浸泡10‑15h，浸泡后弃去浸泡液，再加入400份纯净水，武火煎煮至沸后，改文火加热至水体积减半时趁热过滤；步骤2，向滤液中加入鲜地黄汁200份，武火煎煮至溶液体积的3/4，过滤取煎煮液并进行冷冻干燥，即得。本发明围绕指纹图谱的建立及指标化学成分的定量分析，对百合地黄汤物质基准的制备工艺进行全面的质量控制及物质传递属性进行了控制，既保证了制备工艺过程中的质量，也为复方制剂的开发奠定了坚实的基础。

Description

一种百合地黄汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法
技术领域
本发明属于中药制药技术领域；尤其涉及一种百合地黄汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法。
背景技术
百合地黄汤来源于东汉张仲景所著的《金匮要略》，由百合七枚(擘)，生地黄汁一升组成，原书中该方主要治疗百合病，原书言“百合病未经吐、下、发汗误治，病程虽长，而病情仍如初期，具备首条症状，病机为心肺阴虚内热者，主用百合地黄汤，润养心肺、凉血清热、兼能滋肾”。现代研究表明百合地黄汤具有良好抗抑郁、抗焦虑、调节亚健康状态、改善睡眠症状等作用，原方中的两种药物均为鲜品。
百合地黄汤被收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中，具有较高的开发应用价值。目前，对百合地黄汤的研究大多数集中在药理方面和临床应用方面，其中对治疗失眠、抗抑郁临床疗效及作用机制等方面的研究较多，但有关百合地黄汤的制备工艺和质量控制方面的研究尚无全程控制方法，也没有全面反映该处方中所含化学成分的含量传递性及其种类的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种百合地黄汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种百合地黄汤物质基准，包括以下重量份数的各组分：鲜百合120份，鲜地黄汁200份。
本发明还涉及前述的百合地黄汤物质基准的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，先将鲜百合洗净，并加入400份纯净水浸泡10-15h，浸泡后弃去浸泡液，再加入400份纯净水，武火煎煮至沸后，改文火加热至水体积减半时趁热过滤；
步骤2，向滤液中加入鲜地黄汁200份，武火煎煮至溶液体积的3/4，取煎煮液并进行冷冻干燥，即得。
优选地,步骤1中，所述煎煮的过程中加盖进行煎煮，煎煮一次，先武火后文火；
优选地，步骤2中，所述煎煮的过程，不加盖武火进行煎煮，所述鲜地黄汁为选用新鲜地黄洗净、榨汁取得。
优选地，步骤2中，所述干燥为将百合地黄汤煎煮液进行冷冻干燥。
本发明还涉及前述的百合地黄汤物质基准的检测方法，包括如下步骤：
步骤一，采用高效液相色谱法建立指纹图谱：通过多批次样品建立指纹图谱，指认共有峰，对共有峰进行归属；
步骤二，有效成分含量测定：通过混合对照品指认共有峰，得出其中含有梓醇、地黄苷D和益母草苷；通过建立含量测定分析方法学，测定百合地黄汤物质基准中三种成分的含量，并分析了鲜地黄汁、百合地黄汤和百合地黄汤物质基准之间的物质含量传递性。
优选地，步骤一中，所述高效液相色谱法所用的高效液相色谱仪，色谱条件为：采用C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长203nm、320nm；流速0.7ml/min；柱温35℃；流动相：乙腈(A)-0.10％磷酸水溶液(B)；进样量10μl；梯度洗脱(0-20min，2.0％A；20-60min，2.0％-20.0％A；60-70min，20.0-40.0％A；70-80min，40.0％-90.0％A)，其中梓醇、地黄苷D及益母草苷的检测波长为203nm。
优选地，步骤一中，所述指纹图谱中指认共有峰具体为：当波长为203nm时，共有16个共有峰；当波长为320nm时，共有9个共有峰；
优选地，步骤一中，所述共有峰进行归属具体为，当波长为203nm时，鲜地黄汁中所含共有峰14个，鲜百合药材中共有峰为2个；当波长为320nm时，鲜地黄汁中所含共有峰4个，鲜百合药材中共有峰为5个。在203nm处，通过对照品比对共指认出其中3个共有峰，分别为梓醇、地黄苷D和益母草苷，本方法全面的对物质基准进行了定性质量控制。
本发明所涉及的测定百合地黄汤物质基准中指标成分的含量测定及制备过程中关键质量属性传递性。通过高效液相色谱法，对物质基准中梓醇、地黄苷D和益母草苷进行了含量测定，同时对地黄汁和百合地黄汤中三种化合物进行了测定，并计算出她们之间三种化合物的质量传递。
本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了百合地黄汤物质基准的制备工艺，经典名方的研究主要包括物质基准的研究和制剂方面的研究，而物质基准的研究规定除成型工艺外，其他制备方法应当与古代医籍记载基本一致，本发明严格按照古籍记载并结合现代制备工艺，研究发明了百合地黄汤物质基准的制备工艺，制备工艺中分两步煎煮，第一步采用煎药壶加盖煎煮，药材煎煮前掰碎并浸泡，先武火煮沸后文火煎煮；第二步采用煎药壶不加盖煎煮，武火煎煮至规定量，即得。同时运用高效液相色谱法建立了指纹图谱及有关化学成分的含量测定，并对制备全过程中关键质量属性传递性进行了研究，为经典名方物质基准的研究提供了参考，以及为百合地黄汤的质量标准和制剂开发提供参考。
(2)本发明提供了百合地黄汤物质基准的质量控制方法，建立了百合地黄汤物质基准的双指纹图谱(203nm、320nm)，并对共有峰进行了药材归属，更加明确的对处方中各药材的质量进行了控制，同时也对鲜地黄汁、百合地黄汤和百合地黄汤物质基准之间的指标成分的传递性进行了研究。
附图说明
图1是波长为203nm时，混合对照品HPLC指纹图谱图；
图2是波长为203nm时，百合阴性HPLC指纹图谱图；
图3是波长为203nm时，地黄汁阴性HPLC指纹图谱图；
图4是波长为203nm时，共有模式图；
图5是波长为203nm时，15批物质基准的指纹图谱；
图6是波长为320nm时，百合阴性HPLC图；
图7是波长为320nm时，地黄汁阴性HPLC图；
图8是波长为320nm时，共有模式图；
图9是波长为320nm时，15批物质基准的指纹图谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及百合地黄汤物质基准的制备工艺
处方组成、处方量及煎煮体积的分析
本实施例经过考证大量有关百合地黄汤的文献资料，并结合国家中医药管理局发布的关于《古代经典名方信息表(7首方剂)》中剂量换算关系及古代度量衡演变过程；
本实施例百合地黄汤的处方组成为：鲜百合120g，鲜地黄汁200ml；
其处方的制备工艺为：将鲜百合洗净并加入400ml纯净水，浸泡10-15h，过滤，滤液弃去，药材中再加入400ml纯净水，煎煮至约为200ml，趁热滤过，收集滤液并加入200ml鲜地黄汁，共煎至约为300ml，即得。
煎煮工艺的分析
该方煎煮过程分为两步煎煮：
第一步是对鲜百合进行煎煮过程，该过程严格按照古代煎煮工艺，加盖先武火煮沸再文火煎煮至规定体积。
第二步煎煮为百合煎煮液同鲜地黄汁共同煎煮过程；
本实施例所涉及的方法中，所述煎煮：设计了加盖与不加盖的方式进行煎煮，煎煮至300ml。取煎煮液1ml，加初始流动相定容至10ml，摇匀，过膜，测定其中梓醇、地黄苷D和益母草苷的含量并测定其放置一定时间内的稳定性，结果见表1、2。通过实验结果，优选最终煎煮工艺。
表1
Figure BDA0003108767310000041
表2
Figure BDA0003108767310000051
结果表明：百合地黄汤第二步煎煮加盖或不加盖对指标成分的含量影响是一致的，且各实验组中指标成分在3天内稳定性良好；但从煎煮时间长短来看，不加盖全程武火用时最短。因此，从耗时及能耗上考虑，初步确定百合地黄汤煎煮工艺为第一步煎煮过程先武火至沸，再转为文火(由400ml溶液煎煮至约为200ml，加盖)；第二步煎煮过程选用全程武火(由400ml溶液煎煮至约为300ml，不加盖)。
物质基准干燥工艺的分析
选用常温烘干法、减压干燥法、真空冷冻干燥法以及喷雾干燥法对百合地黄汤进行干燥处理，以干燥物的颜色和样品中指标成分的含量为考察指标，对百合地黄汤物质基准的干燥方法进行研究，实验结果见表3。
表3
干燥方法 称样量g 梓醇峰面积/ml 地黄苷D峰面积/ml 益母草苷峰面积/ml
干燥前 / 1368.482 304.658 357.450
加热干燥 0.12445 299.845 248.004 131.298
减压干燥 0.12811 697.086 202.976 220.693
冷冻干燥 0.12584 1117.459 252.681 298.556
喷雾干燥 0.12609 846.905 233.030 289.569
从上表3中可以得出，百合地黄汤经不同干燥方法干燥后，各样品之间指标成分峰面积较干燥前均有下降；真空冷冻干燥法干燥后的样品中指标成分较干燥前变化最小，因此制备物质基准时，选用真空冷冻干燥法。
本实施例涉及指纹图谱方法学
1、供试品溶液的制备
样品溶液的制备：取物质基准适量(相当于1ml百合地黄汤)，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入适量流动相(0.1％磷酸水溶液：乙腈＝99：1)，充分振摇，使粉末溶解，再用流动相定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。
百合阴性样品制备：将鲜百合洗净并加入400ml纯净水，浸泡10h，过滤，滤液弃去，药材中再加入400ml纯净水，煎煮至约为200ml，趁热滤过，滤液中加入纯净水200ml，共煎至约为300ml，即得样品煎液。取上述液体1ml，置于10ml容量瓶中，加流动相(0.1％磷酸水溶液：乙腈＝99：1)，定容至刻度，摇匀，经0.45μm的滤膜过滤，即得。
地黄阴性样品制备：取200ml纯净水，并加入鲜地黄汁200ml，共煎至约为300ml，即得样品煎液。取上述液体1ml，置于10ml容量瓶中，加流动相(0.1％磷酸水溶液：乙腈＝99：1)，定容至刻度，摇匀，经0.45μm的滤膜过滤，即得。
2、对照品溶液的制备
取梓醇、地黄苷D、益母草苷对照品适量，精密称定，加流动相溶液(0.1％磷酸水溶液：乙腈＝99：1)分别制成相应浓度的对照品溶液，并吸取相应的各对照品溶液配制成含梓醇797.796μg/ml、地黄苷D 95.924μg/ml、益母草苷131.908μg/ml的混合对照品溶液，经0.45μm的滤膜过滤，即得。
3、色谱条件
采用Kromasil 100-5-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长203nm、320nm；流速0.7ml/min；柱温35℃；流动相：乙腈(A)-0.10％磷酸水溶液(B)；进样量10μl；梯度洗脱(0-20min，2.0％A；20-60min，2.0％-20.0％；60-70min，20.0-40.0％；70-80min，40.0％-90.0％；80-90min，90.0％-10.0％；90-95min，10.0％-2.0％；95-100min，2.0％)。
4、精密度实验
称取百合地黄汤物质基准适量(相当于1ml百合地黄汤)，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，连续进样6针，记录各色谱图，在203nm时，以地黄苷D峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于1.0％，在320nm时，以峰2为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于2.0％，表明该仪器精密度良好。
5、稳定性试验
称取精密度实验中同一供试品溶液，分别在0、3、6、11、16、23h后进样测定，记录色谱图，在203nm时，以地黄苷D峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于1.0％，在320nm时，以峰2为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于2.5％，表明供试品溶液在23h内稳定性良好。
6、重复性实验
称取百合地黄汤物质基准适量(相当于1ml百合地黄汤)，共6份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，在203nm时，以地黄苷D峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于5.0％，在320nm时，以峰2为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积RSD均小于4.0％，表明该方法重现性良好。
指纹图谱及共有峰
按供试品处理方法制备15批百合地黄汤物质基准供试品，并分别对203nm、320nm波长下色谱图进行分析。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件评价相似度，相似度均大于0.90，结果见表4和表5。并建立了15批次百合地黄汤物质基准在203nm和320nm处的指纹图谱和共有峰图。
指纹图谱共有峰的归属及指认
将百合地黄汤物质基准、鲜地黄汁阴性、百合阴性及对照品依次进样分析，共有峰的归属结果为：当波长为203nm时，共有峰有16个，并通过与混合对照品溶液对比，指认出其中3种化学成分，分别为梓醇(峰1)、地黄苷D(峰5)和益母草苷(峰8)其中峰2、峰9来源于鲜百合，峰1、峰3-8、峰10-16均来源于鲜地黄汁，见图1、图2、图3、图4、图5所示；当波长为320nm时，共有峰有9个，对样品中共有峰进行归属，其中峰2、4、6、9来源于鲜地黄汁，峰1、3、5、7-8均来源于鲜百合，见图6、图7、图8、图9所示。
表4
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 R
S1 1 0.996 0.997 0.984 0.992 0.991 0.982 0.986 0.982 0.988 0.988 0.99 0.978 0.977 0.98 0.993
S2 0.996 1 0.996 0.986 0.988 0.989 0.978 0.983 0.978 0.984 0.985 0.987 0.969 0.969 0.974 0.99
S3 0.997 0.996 1 0.99 0.994 0.993 0.981 0.987 0.981 0.988 0.988 0.99 0.977 0.976 0.98 0.994
S4 0.984 0.986 0.99 1 0.989 0.991 0.987 0.986 0.985 0.99 0.99 0.987 0.979 0.979 0.977 0.993
S5 0.992 0.988 0.994 0.989 1 0.999 0.986 0.995 0.985 0.987 0.988 0.994 0.98 0.978 0.987 0.995
S6 0.991 0.989 0.993 0.991 0.999 1 0.988 0.996 0.987 0.989 0.989 0.995 0.981 0.981 0.989 0.996
S7 0.982 0.978 0.981 0.987 0.986 0.988 1 0.991 0.999 0.997 0.997 0.989 0.988 0.989 0.979 0.995
S8 0.986 0.983 0.987 0.986 0.995 0.996 0.991 1 0.992 0.99 0.99 0.997 0.98 0.98 0.988 0.996
S9 0.982 0.978 0.981 0.985 0.985 0.987 0.999 0.992 1 0.996 0.996 0.989 0.987 0.987 0.977 0.994
S10 0.988 0.984 0.988 0.99 0.987 0.989 0.997 0.99 0.996 1 1 0.993 0.991 0.992 0.983 0.997
S11 0.988 0.985 0.988 0.99 0.988 0.989 0.997 0.99 0.996 1 1 0.993 0.991 0.992 0.982 0.997
S12 0.99 0.987 0.99 0.987 0.994 0.995 0.989 0.997 0.989 0.993 0.993 1 0.984 0.984 0.992 0.997
S13 0.978 0.969 0.977 0.979 0.98 0.981 0.988 0.98 0.987 0.991 0.991 0.984 1 0.999 0.988 0.991
S14 0.977 0.969 0.976 0.979 0.978 0.981 0.989 0.98 0.987 0.992 0.992 0.984 0.999 1 0.988 0.991
S15 0.98 0.974 0.98 0.977 0.987 0.989 0.979 0.988 0.977 0.983 0.982 0.992 0.988 0.988 1 0.99
R 0.993 0.99 0.994 0.993 0.995 0.996 0.995 0.996 0.994 0.997 0.997 0.997 0.991 0.991 0.99 1
表5
Figure BDA0003108767310000081
Figure BDA0003108767310000091
指标成分定量分析方法学考察
色谱条件
采用Kromasil 100-5-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长203nm；流速0.7ml/min；柱温35℃；流动相：乙腈(A)-0.10％磷酸水溶液(B)；进样量10μl；梯度洗脱(0-20min，2.0％A；20-60min，2.0％-20.0％A；60-70min，20.0-40.0％A；70-80min，40.0％-90.0％A)。
线性关系
取梓醇、地黄苷D和益母草苷对照品适量，精密称定，加流动相溶液分别制成含梓醇797.796μg/ml、地黄苷D 95.924μg/ml和益母草苷131.908μg/ml的混合对照品溶液，即得。
精密吸取上述混合对照品溶液适量，分别稀释成质量浓度为母液的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的混合对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，并记录色谱图。以对照品溶液的质量浓度为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y),进行线性回归方程计算，得到的线性回归方程为梓醇Y＝8.6387X+32.157(R2＝0.9999)、地黄苷D Y＝6.1495X+0.8544(R2＝1)、益母草苷Y＝5.6197X+2.5602(R2＝0.9999)，结果表明梓醇、地黄苷D、益母草苷分别在24.931～797.796μg/ml、2.998～95.924μg/ml、4.122～131.908μg/ml范围内线性关系良好。
精密度实验
称取百合地黄汤物质基准适量(相当于1ml百合地黄汤)，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定，连续进样6针，记录各色谱图，峰面积RSD均小于1.0％，表明该仪器精密度良好。
稳定性试验
称取精密度实验中同一供试品溶液，分别在0、3、6、11、16、23h后进样测定，记录色谱图，峰面积RSD均小于1.0％，表明供试品溶液在23h内稳定性良好。
重复性实验
称取百合地黄汤物质基准约0.13g(相当于1ml百合地黄汤)，共6份，精密称定，按上述方法制备物质基准供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，峰面积RSD均小于5.0％，表明该方法重现性良好。
加样回收率考察
称取已知含量的百合地黄汤物质基准6份，每组分别添加相当于供试品中梓醇、地黄苷D、益母草苷成分含量的50％、100％、150％的对照品，制得供试品，平行2次，按上述色谱条件测定，记录色谱图，计算各化合物的平均加样回收率在94.86％～102.71％之间及RSD在5.0％内。结果表明该方法各成分含量回收率高，准确性好。
物质基准中成分的含量测定
1、供试品的制备
取15批次的百合地黄汤物质基准称取适量(相当于1ml百合地黄汤)，加流动相溶解并定容至10ml容量瓶中，过微孔滤膜，即得。
2、梓醇、地黄苷D和益母草苷的含量及其传递性
按上述色谱条件对鲜地黄汁、百合地黄汤以及物质基准进行测定，记录色谱图，并计算它们之间的指标成分传递百分比，实验结果见表6。
表6
Figure BDA0003108767310000101
Figure BDA0003108767310000111
综上所述，本发明确定了百合地黄汤物质基准的制备工艺及其定性和定量的质量控制方法研究。本发明围绕指纹图谱的建立对指标化学成分进行定量分析，对百合地黄汤物质基准的制备工艺进行全面的质量控制及物质传递属性控制，既保证了制备工艺过程中的质量，也为复方制剂的开发奠定了坚实的基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (9)

1.一种百合地黄汤物质基准，其特征在于，包括以下重量份数的各组分：鲜百合120份，鲜地黄汁200份。
2.一种如权利要求1所述的百合地黄汤物质基准的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，先将鲜百合洗净，并加入400份纯净水浸泡10-15h，浸泡后弃去浸泡液，再加入400份纯净水，武火煎煮至沸后，改文火加热至水体积减半时趁热过滤；
步骤2，向滤液中加入鲜地黄汁200份，武火煎煮至溶液体积的3/4，取煎煮液并进行冷冻干燥，即得。
3.如权利要求2所述的百合地黄汤物质基准的制备方法，其特征在于,步骤1中，所述煎煮的过程中加盖进行煎煮，煎煮一次，先武火后文火。
4.如权利要求2所述的百合地黄汤物质基准的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述煎煮的过程，不加盖武火进行煎煮，所述鲜地黄汁为选用新鲜地黄洗净、榨汁取得。
5.如权利要求2所述的百合地黄汤物质基准的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述干燥为将百合地黄汤煎煮液进行冷冻干燥。
6.如权利要求1所述的百合地黄汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，采用高效液相色谱法建立指纹图谱：通过多批次样品建立指纹图谱，指认共有峰，对共有峰进行归属；
步骤二，有效成分含量测定：建立含量测定分析方法学，测定百合地黄汤物质基准中三种成分的含量，分析鲜地黄汁、百合地黄汤和百合地黄汤物质基准之间的物质含量传递性。
7.如权利要求6所述的百合地黄汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，步骤一中，所述高效液相色谱法所用的高效液相色谱仪，色谱条件为：采用C18色谱柱；检测波长203nm、320nm；流速0.7ml/min；柱温35℃；流动相：乙腈(A)-0.10％磷酸水溶液(B)；进样量10μl；梯度洗脱(0-20min，2.0％A；20-60min，2.0％-20.0％A；60-70min，20.0-40.0％A；70-80min，40.0％-90.0％A)。
8.如权利要求6所述的百合地黄汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，步骤一中，所述指纹图谱中指认共有峰具体为：当波长为203nm时，共有16个共有峰；当波长为320nm时，共有9个共有峰。
9.如权利要求6所述的百合地黄汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，步骤一中，所述共有峰进行归属具体为，当波长为203nm时，鲜地黄汁中所含共有峰14个，鲜百合药材中共有峰为2个；当波长为320nm时，鲜地黄汁中所含共有峰4个，鲜百合药材中共有峰为5个。
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