CN105277643B - 一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测方法 - Google Patents
一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测方法，所述方法包含6种酚酸类成分的UPLC一测多评含量测定方法，试验中采用原儿茶醛作为单个标定物，以外标加校正因子法进行测定，本方法为复方丹参滴丸药效物质提供了有效、准确的质量控制方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测方法，所述方法包含6种酚酸类成分的UPLC一测多评含量测定方法。
背景技术
由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的共识。目前，越来越多的国内外植物药标准将多指标含量测定收录其中。然而，在多指标含量测定方法实施的过程中，对照品消耗量大，检测操作难度高，严重制约了该方法的推广应用。
为解决以上问题，人们积极寻找替代性方法。研究人员发现，不同物质在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子。在样品检测过程中，使用外标法测定A化合物的峰面积并获得其含量，同时测定B化合物的峰面积，便可以根据以上信息和A/B物质间相对校正因子，计算获得B化合物的含量。该替代对照品法被命名为一测多评法。
由于大大减少了对照品的用量，并降低了检测试验的操作难度，一测多评质量控制方法得到迅速的推广和应用。目前，美国药典约有20余个品种，欧洲药典约有10余个品种，中国药典有1个品种(黄连)，使用该方法对植物来源药物进行多指标含量测定，且数目仍在不断增加。
复方丹参滴丸为一种已经上市的活血化瘀，理气止痛药物。用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛见上述证候者。复方丹参滴丸是由丹参、三七、冰片3味中药组成，丹参作为君药，现有技术中并没有一测多评方法对其进行检测的报道。
复方丹参滴丸有效成分复杂，将一测多评方法用于其中是否适合，以及如何进行其中的有效成分分析成为一个问题，本发明人对此进行了研究，复方丹参滴丸含有多种酚酸类成分，选择药理活性明确且含量比较丰富的6种酚酸类成分(分别为丹参素，原儿茶醛，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B和丹酚酸A)进行测定。在开发一测多评方法时，单个标定物的选择将严重影响测定方法的可靠性和实用性。目前没有筛选单个标定物的科学方法。
在一测多评多指标含量测定方法的过程中，由于分析物含量由相对校正因子计算获得，故相对校正因子的稳定性会影响到最终的含量测定结果的准确性。本发明人对此进行了研究，找到了一种对其中酚酸类化合物进行检测的方法，发现该类化合物特别适合用一测多评方法，从而解决了相关的技术问题。
发明内容
针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种高实用性、操作简单、节约成本的针对复方丹参滴丸6种酚酸类成分的检测方法。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量。
其中，1)将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸20-30粒，精密称定，于20-30mL量瓶中，加入15-25mL水，超声5-15min，待冷却至室温，定容至20-30mL，过0.2-0.3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液。
优选的，
方法如下：取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声(300W，50kHz)10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得到滤液即为待测试液。
其中，2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；方法如下：
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法或工作曲线法计算原儿茶醛含量；其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，工作曲线法采用浓度范围在10-100μg/mL的至少五个梯度的原儿茶醛作为对照品溶液
仪器：选择最高耐受压力大于6000psi或400bar的高效液相色谱仪；
色谱柱：选择亚2μm填料尺寸的色谱柱，优选Waters ACQUITY UPLC色谱柱或DikmaEndeavorsil色谱柱；
流动相选用如下三种方案中的一种：
a、溶剂A为醋酸盐缓冲溶液，其中含0.3-0.5％乙酸及0.05-0.1％三乙胺–溶剂B乙腈；
b、溶剂A0.1-0.3％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；
c、溶剂A0.1-0.3％醋酸水溶液–溶剂B乙腈；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
①0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
②0～1min，5％-10％B，1～3min，10％–15％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
③0～1min，10％–14％B，1～3min，14％–20％B，3～6min，20％–23％B，6～8min，23％–27％B,8～10min，27％–30％B；
④0～0.5min，8％–12％B，0.5～2.5min，12％–17％B，2.5～5.5min，17％–20％B，5.5～7.5min，20％–23％B,7.5～9.5min，23％–27％B；
⑤0～3min，8％–12％B，3～5min，12％–17％B，5～8min，17％–20％B，8～10min，20％–23％B,10～12min，23％–27％B；
流速：0.36-0.44mL/min；
柱温：25-35℃
进样量：1-5μL
PDA检测器波长：279-283nm，327-331nm；或可变波长检测器，波长程序：0～3min，281nm，3～8min，329nm，8～10min，281nm。
步骤2优选的检测方法为：
其中，步骤2)所述色谱条件设定如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18
Waters ACQUITY UPLC@BEH C18预柱
流动相：A相，0.2％甲酸水；B相，纯水；
梯度洗脱程序：0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.36-0.44mL/min；
柱温：25-35℃
进样量：1-5μL
PDA检测器波长：281nm，329nm。
步骤2最优选的检测方法为：
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C181.7μm,2.1mm i.d.×100mm，
Waters ACQUITY UPLC@BEH C18预柱1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm；
流动相：A相，0.2％甲酸水；B相，纯水；
梯度洗脱程序：0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃
进样量：3μL
PDA检测器波长：281nm，329nm。
其中，步骤3)使用对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰位置和含量；
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.55-0.67，3.87-4.73，4.37-5.35，3.11-3.80和3.40-4.163；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91-7.23，3.29-4.02，1.36-1.66，1.36-1.66和3.10-3.79；
；待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
相对校正因子和相对保留时间优选：
定性：以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78；
定量：以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44。
以下为本发明所用名词术语的解释：
一测多评：替代对照品含量测定方法的一种，即先使用外标法测定样品中一种分析物的含量，再通过分析物的峰面积和相对校正因子，计算样品中其他分析物中的含量。
UPLC：超高效液相色谱仪
单个标定物的筛选：采用层次分析法，从可靠性和实用性两个角度选择单个标定物。可靠性因素包括校正因子的耐用性和稳健性，实用性因素包括对照品的易得性、样品中含量的高低和化合物的化学稳定性。根据以上信息，分析不同单个标定物的优势与劣势，最大程度减小单个标定物对方法应用带来的影响。由于原儿茶醛具有最佳的可靠性和实用性，故选择原儿茶醛作为单个标定物。
6种酚酸类成分的分析测试方法：
定性方式：对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸，可通过比较相对于原儿茶醛对照品色谱峰的相对保留时间进行定性，其相对保留时间分别为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78，计算公式如下：
RRTX＝RTx/RTS
其中，RTx和RTS分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTX为相对保留时间。
定量方式：对于原儿茶醛，可采用标准曲线法或外标一点法进行定量，对于丹参素。丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸，可采用相对校正因子计算含量，相对校正因子分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44，计算公式如下：
其中，Ax和AS分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1.色谱条件考察
1.1.最大吸收波长的选择
标准溶液——分别取适量丹参素(DSS)、原儿茶醛(PCA)、迷迭香酸(ROA)、紫草酸(LA)、丹酚酸B(SAB)和丹酚酸A(SAA)对照品，精密称定，溶解于70％甲醇水溶液中，得到浓度分别为0.52，0.22，0.50，0.50，0.54和0.47mg/mL的标准溶液。全UV范围(200-400nm)内扫描标准溶液，分别测定待测物质的λmax。紫外光谱显示，丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A在281nm处有最大吸收，迷迭香酸在329nm处有最大吸收，紫草酸在329nm处有平缓肩峰，因此检测波长设定为281nm和329nm(图1)。
1.2.色谱柱考察
考察ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×100mm,1.7μm)和ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.7μm)三种填料色谱柱对样品分离的影响。结果表明，三根色谱柱均能够对目标化合物获得良好分离，但考虑到分离时间，最终选择ACQUITY UPLC BEH C18进行试验(图2和表1)。
表1色谱柱的选择
1.3.流动相考察
1.3.1流动相体系考察
在合适的溶剂洗脱条件下，考察甲醇-水和乙腈-水有机相体系对样品分离的影响。结果表明，乙腈-水体系中的分离效果较好，理论塔板数和分离度明显优于甲醇-水体系，且系统压力较低，故选用乙腈-水体系进行试验(图3和表2)。
表2流动相体系的选择
1.3.2流动相pH值考察
考察不同pH值流动相体系(水，0.1％甲酸水和0.2％甲酸水)对样品分离的影响。结果表明，流动相添加甲酸将显著改善目标化合物的分离，这可能是由于酚酸类化合物在酸性环境中成共价态，具有较好的色谱行为。同时，0.2％甲酸水体系较0.1％甲酸水体系具有更高的理论塔板数和更优的分离能力，最终选择0.2甲酸水体系进行试验(图4和表3)。
表3流动相pH值的选择
1.4.流速考察
考察不同流速(0.36mL/min，0.40mL/min和0.44mL/min)对样品分离的影响。结果表明，流速对目标化合物的分离效果影响较小，随着流速的增加，理论塔板数降低，保留时间延长。考虑得到最佳的色谱柱效率和色谱柱寿命(流速越大，柱压越高)，选择0.40mL/min进行试验(图5和表4)。
表4流速的选择
1.5.柱温考察
考察不同柱温(20℃，30℃，40℃)对样品分离的影响。结果表明，柱温较低时，柱效较高，但分离度稍差。由于20℃柱温的设置需要柱温箱具备制冷的功能，考虑到方法的实用性，选择30℃柱温进行试验(图6和表5)。
表5柱温的选择
1.6.进样量考察
考察不同进样量(1μL，3μL，5μL)对样品分离的影响。结果表明，随着进样量的增大，理论塔板数减小，拖尾因子增大。考虑到分析方法的灵敏度，选择3μL进样量进行试验。(图7和表6)。
表6进样量的选择
结论
根据以上结果建立优化的色谱条件。
流动相A：0.2％甲酸-水溶液
流动相B：乙腈
洗脱程序：见下表
色谱系统
检测器：紫外，281nm和329nm
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；VanGuard BEH C18(2.1×5mm,1.7μm)
流速：0.4mL/min
进样量：3μL
柱温：30℃
2.方法学验证
2.1.线性和范围
标准储备液——分别取丹参素12.93mg，原儿茶醛5.55mg，迷迭香酸13.55mg，紫草酸11.75mg，丹酚酸B12.48mg，丹酚酸A12.38mg于25mL棕色量瓶中，加入10％甲醇水稀释，得到已知浓度分别为0.52，0.22，0.50，0.50，0.54和0.47mg/mL的标准储备液。
标准溶液——分别定量转移0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5和10mL标准储备液于7个25mL棕色量瓶中，纯水稀释定容，混匀。
分别进样3μL标准溶液，每个浓度进样2次，测定丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积。分别以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，使用最小二乘法进行线性回归。(表7)
表7 6个分析物的回归方程、相关系数、标准偏差、LOD和LOQ
2.2.响应因子和相对保留时间
2.1.1响应因子的测定
一测多评法(SSDMC)的响应因子(RF，Relative response factor)通过6种分析物的工作曲线获取。响应因子可以通过以下等式进行计算：
FX＝BS/BX
其中，BS和BX分别代表单个标定物和分析物工作曲线的斜率。FX代表丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸对于原儿茶醛的响应因子。
使用三批对照品测定建立工作曲线，计算响应因子FX的平均值作为最终的FX。(表8)
表8 5种酚酸类分析物的响应因子——不同批次的对照品
+USP对照品
*相同批次的对照品
结果表明，以原儿茶醛为参照物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的响应因子分别为6.57，3.56，1.51，1.51和3.44。不同批次对照品测得响应因子的RSD小于2％，说明响应因子的重复性良好。
2.2.2.相对保留时间的测定
相对保留时间计算公式如下：
RRTX＝RTx/RTS
RTS是单个标定物的保留时间，单位为min。
RTx是丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸对照品的保留时间，单位为min。
结果表明，以原儿茶醛为参照物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间分别为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78。
2.3.准确度
准确度通过加样回收率试验测定。取一批复方丹参滴丸，分别精密加入低、中、高(50％、100％和150％)三个浓度的混合对照品溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定。每个样品测定3次。各成分的回收率结果按照下面方法计算：
式中A为供试品所含被测成分量；
B为加入对照品量；
C为实测值。
表9准确度试验结果
结果表明，精密度在95.3-104.0％之间，符合中国药典2010版中药质量标准分析方法要求。(表9)
2.4.精密度
2.4.1.重复性
取一批复方丹参滴丸，平行制备6份供试品溶液进行测定，考察分析方法的重复性。样品溶液进样3μL，记录丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积，计算含量并计算RSD。(表10)
表10重复性试验结果(n＝6)
结果表明，6种成分的重复性RSD在0.38-1.01％之间，符合中国药典2010版中药质量标准分析方法要求。
2.4.2.中间精密度-日内和日间精密度
方法的日内和日间精密度以一批复方丹参滴丸供试品溶液测定。在上述色谱条件下测定，一天连续进样6次，测定日内精密度。重复操作，连续测定三天，测定日间精密度。样品溶液进样3μL，记录丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积，并计算浓度、标准偏差和RSD。(表11)
表11日内和日间精密度
结果表明，6种成分的日内精密度RSD在0.23-0.47％之间，日间精密度RSD在0.36-1.38％之间，符合中国药典2010版中药质量标准分析方法要求。
2.4.3.中间精密度-分析者
取一批复方丹参滴丸，分别由3位操作者制备3份供试品溶液进行测定。样品溶液进样3μL，记录丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积，并计算浓度、标准偏差和RSD。(表12)
表12不同分析者考察
2.5.专属性
分别进样等体积(3μL)的空白溶剂(过0.22μm滤膜)，对照品溶液和样品溶液，记录色谱图。(图8)
样品溶液色谱图中的积分峰与对照品溶液色谱图峰保留时间一致。结果表明，专属性符合中国药典2010版中药质量标准分析方法要求。
2.6.稳定性
考察样品溶液稳定性。取一批复方丹参滴丸制备样品溶液，在室温下放置0，2，4，6，8，10，12和24小时后，进样测定丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰面积。稳定性通过峰面积的RSD进行评估。(表13)
表13稳定性试验结果
结果表明，6种成分的0-24h峰面积RSD在0.33-2.21％之间，符合中国药典2010版中药质量标准分析方法要求。
2.7.耐用性
2.7.1.色谱柱和色谱仪考察
考察不同色谱柱和色谱仪对响应因子(RF)和相对保留时间(RRT)的影响。结果见表X。(表14)
表14响应因子(RF)和相对保留时间(RRT)的耐用性
注：
1)Waters H-Class(TUV)：Waters H-Class系统(Waters Corp,Milford,MA,USA)，由一个四元泵输液系统，一个在线脱气机，一个自动进样器，一个柱温箱，一个可变波长检测器，和一个分析工作站(Empower3software)组成。
2)Waters UPLC(PDA)：Waters UPLC系统(Waters Corp,Milford,MA,USA)，由一个二元泵输液系统，一个在线脱气机，一个自动进样器，一个柱温箱，一个二极管阵列检测器，和一个分析工作站(Empower3software)组成。
3)Shimadzu LC30(PDA)：Shimadzu LC30系统(Shimadzu,JAP)，由两个一元泵输液系统，一个在线脱气机，一个自动进样器，一个柱温箱，一个二极管阵列检测器，和一个分析工作站(Labsolutions5.54SP2)组成。
4)色谱柱：
结果表明，色谱柱和色谱仪耐用性试验中，各分析物RF的RSD在1.21-2.42％之间，RRT的RSD在3.14-4.61％之间，表明该方法具有良好的耐用性。
2.7.2.分析过程参数考察
检测分析过程中参数微小变动的对RRT和RF的影响。过程参数包括流动相的pH值，有机相的比例，梯度洗脱程序，检测波长，流速，进样量和柱温。
2.7.2.1.流动相pH值
考察三个不同pH值的流动相体系(0.1％甲酸水，0.2％甲酸水和0.3％甲酸水)对标准溶液测定的影响。比较色谱图的相对保留时间(RRT)，响应因子(RF)，丹酚酸含量和系统适用性参数(分离度(R)，理论塔板数(P)，拖尾因子(T))。其他参数保持不变。
(表15)
表15耐用性——不同流动相的pH值
RRT，RF和含量的RSD＜2％，说明流动相酸度的影响较小。系统适用性参数表明，使用0.2％甲酸水体系可以获得较好的色谱系统性能。
2.7.2.2.梯度洗脱程序流动相比例
试验的梯度洗脱程序为0/1/3/6/8/10min，8/12/17/20/23/27乙腈(％)。考察有机相比例调节至-0.5％～+0.5％时，对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表16)
表16耐用性——不同流动相组成比例
RF和含量的RSD＜2％，受乙腈比例影响不大。RRT的RSD＞2％，说明乙腈比例的改变需要控制。
系统适用性参数受乙腈比例的影响很大，随着乙腈比例的降低，色谱系统性能明显改善，
提示可通过降低乙腈比例改善分离效果。
2.7.2.3.梯度洗脱程序的时间
试验的梯度洗脱程序为0/1/3/6/8/10min，8/12/17/20/23/27乙腈(％)。考察梯度洗脱程序时间调节至-0.5min～+0.5min时，对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表17)
表17耐用性——梯度洗脱程序时间
RF和含量的RSD＜2％，受梯度洗脱程序时间影响不大。RRT的RSD＞2％，说明梯度洗脱程序时间的改变需要控制。
系统适用性参数理论塔板数受梯度洗脱程序时间的影响很大，其他参数受影响较小。
2.7.2.4.紫外可见检测器波长
考察不同检测波长(279/327nm，281/329nm，283/331nm)对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表18)
表18耐用性——梯度洗脱程序时间
结果表明，RRT和系统适用性参数几乎不受波长的影响，但是RF的RSD大于2.0％。
这是由于丹酚酸B和丹酚酸A的紫外光谱差异较大，波长的微小变动可能引起物质间紫外吸收比例的的较大变化。因此，SSDMC法应该严格控制波长参数。
2.7.2.5.流速
考察不同流动相流速(0.36ml/min，0.40ml/min，0.44ml/min)对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表19)
表19耐用性——梯度洗脱程序时间
RF和含量的RSD均小于2.0％，说明RF和系统稳定性受流速变化影响较小。RRT的RSD大于2.0％，表明流速显著影响原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的色谱行为。为保证定性的准确性，SSDMC方法中应控制流速为0.4mL/min不变。
2.7.2.6.进样量
考察不同进样量(1μL,3μL,5μL)对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表20)
表20耐用性——梯度洗脱程序时间
结果表明，进样量对RRT、RF、系统适用性参数和含量的影响均较小。因此，进样量可以设置为1～5μL。
2.7.2.7.柱温
考察不同柱温(20℃,30℃,40℃)对标准溶液测定的影响。比较色谱图的RRT，RF，丹酚酸含量和系统适用性参数。其他参数保持不变。(表21)
表21耐用性——梯度洗脱程序时间
结果表明，柱温对RF、含量和系统适用性参数的影响较小，随着柱温的降低，分离度有所提高。但是柱温对RRT的影响较大，RSD大于2.0％，说明柱温对迷迭香酸和紫草酸的色谱行为影响较大。为保证定性的准确定，SSDMC方法中应控制柱温为30℃不变。
2.8再现性
使用三套分析系统，对11批复方丹参滴丸中的6种酚酸类成分进行含量测定，并比较一测多评法(SSDMC)和外标法(ESM)的测定结果。(表22)
表22 6种酚酸类化合物含量测定结果
表22-1丹参素含量测定结果
表22-2原儿茶醛含量测定结果
表22-3丹酚酸B含量测定结果
表22-4丹酚酸A含量测定结果
表22-5迷迭香酸含量测定结果
表22-6紫草酸含量测定结果
表22-7 6种酚酸总含量测定结果
I1：色谱仪—Waters UPLC(PDA)，色谱柱—Waters ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μmparticles,2.1mm i.d.×100mm)；
I2：色谱仪—Waters H-Class(TUV)，色谱柱—Waters ACQUITY UPLC@HSS C18(1.7μm particles,2.1mm i.d.×100mm)；
I3：色谱仪—Shimadzu LC20(PDA)，色谱柱—Waters ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm particles,2.1mm i.d.×100mm)。
RD：相对偏差，按照下式计算：RD(％)＝(amountSSDMC-amountESM)/amountESM×100％
结果表明，在三套分析系统中，以外标法为准，丹参素的RD在-4.55-0.20％之间，原儿茶醛的RD在-2.75-1.71％之间，丹酚酸B的RD在-3.76-5.99之间，丹酚酸A的RD在-3.05-2.39％之间，迷迭香酸的RD在-2.41-2.83％之间，紫草酸的RD在-5.74-5.53％之间，酚酸总含量的RD在-2.96-1.46％之间。SSDMC法测定结果与ESM法测定结果无明显区别，各待测成分的RD均在±10％以内，且结果再现性良好。
本发明的有益效果：
目前，尚未有针对复方丹参滴丸酚酸类成分的一测多评多指标含量测定方法本发明开发了准确可靠、简单易行测定方法，可作复方丹参滴丸酚酸类成分的检测手段。使用廉价易得的原儿茶醛，同时测定6种酚酸类成分，节省时间成本、劳动成本，方法快速、准确，能更全面的知晓制剂质量。
且该方法具推广到丹参药材、提取物及其中药制剂中6中酚酸类成分检测的应用性，可采用该方法，通过部分方法学验证，可对其它丹参类样品进行6种酚酸类成分的含量测定。
本发明根据可靠性因素和实用性因素，考察单个标定物。根据以上信息，分析不同单个标定物的优势与劣势，最大程度减小单个标定物对方法应用带来的影响。结果表明，原儿茶醛作为试验中采用的单个标定物，具有最佳的可靠性和实用性。
本发明通过对不同色谱柱硅胶类型、分析仪器厂家和UV检测器波长参数的全面考察，可以保证一测多评方法测定结果的准确性。
重现性试验表明，在各项检测参数控制良好的环境下，本方法能够获得准确的测定结果，且重现性好。与外标法比较，单个分析物测定结果偏差不大于10％，含量加和测定结果偏差不大于8％。本方法能够有效进行中药制剂复方丹参滴丸中6种酚酸类成分的含量测定。
附图说明
图1丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的紫外吸收
图2色谱柱的选择
图3流动相体系的选择
图4流动相pH值的选择
图5流速的选择
图6流速的选择
图7进样量的选择
图8对照品和样品色谱图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声(300W，50kHz)10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得待测样品。
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
取原儿茶醛对照品适量，精密称定，配置成浓度约为40μg/mL的对照品溶液
样品测定，使用UPLC测定样品溶液和对照品溶液中分析物的峰面积，
色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相：A相，0.2％甲酸水；B相，纯水；
梯度洗脱程序：0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃
进样量：3μL
PDA检测器波长：281nm(丹参素，原儿茶醛，丹酚酸B，丹酚酸A)，329nm(迷迭香酸，紫草酸)；
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
相对校正因子和相对保留时间
以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为6.57，3.65，1.51，1.51和3.44。
以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间分别为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78。
定性方式：待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.16％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.75％、0.06％、0.18％、0.08％和0.04％，总含量为1.27％。
实施例2
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声(300W，50kHz)10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得待测样品。
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，工作曲线法计算原儿茶醛含量；采用浓度范围在10-100μg/mL的五个梯度的原儿茶醛作为对照品溶液。
色谱柱：；或Dikma Endeavorsil色谱柱
流动相选用：
a、溶剂A为醋酸盐缓冲溶液，其中含0.3-0.5％乙酸及0.05-0.1％三乙胺–溶剂B乙腈；梯度洗脱程序选用：
①0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.36mL/min；
柱温：25℃；
进样量：1μL；
可变波长检测器，波长程序：0～3min，281nm，3～8min，329nm，8～10min，281nm。3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.55，3.87，4.37，3.11和3.40；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91，3.29，1.36，1.36和3.10；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.17％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.68％、0.05％、0.17％、0.08％和0.04％，总含量为1.19％。
实施例3
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸30粒，精密称定，于30mL量瓶中，加入25mL水，超声15min，待冷却至室温，定容至30mL，过0.3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法，其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用：
b、溶剂A0.1％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；
梯度洗脱程序选用：
②0～1min，5％-10％B，1～3min，10％–15％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.44mL/min；
柱温：35℃；
进样量：5μL；
PDA检测器波长：283nm，331nm。
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.67，4.73，5.35，3.80和4.16；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为7.23，4.02，1.66，1.66和3.79；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.18％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.81％、0.06％、0.19％、0.09％和0.05％，总含量为1.37％。
实施例4
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸20粒，精密称定，于20mL量瓶中，加入15mL水，超声5-min，待冷却至室温，定容至20mL，过0.2μm的滤膜，得到滤液即为待测试液
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法；其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，。
色谱柱：Dikma Endeavorsil色谱柱
流动相选用：
c、溶剂A0.1％醋酸水溶液–溶剂B乙腈；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
③0～1min，10％–14％B，1～3min，14％–20％B，3～6min，20％–23％B，6～8min，23％–27％B,8～10min，27％–30％B；
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃；
进样量：3μL；
PDA检测器波长：283nm，331nm；。
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.55，3.87，4.37，3.11和3.40；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91，3.29，1.36，1.36和3.10；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.16％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.67％、0.07％、0.14％、0.07％和0.04％，总含量为1.16％。
实施例5
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得到滤液即为待测试液。
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用工作曲线法计算原儿茶醛含量；其中工作曲线法采用浓度范围在10-100μg/mL的五个梯度的原儿茶醛作为对照品溶液。
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用：
A相，0.2％甲酸水；B相，纯水；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
④0～0.5min，8％–12％B，0.5～2.5min，12％–17％B，2.5～5.5min，17％–20％B，5.5～7.5min，20％–23％B,7.5～9.5min，23％–27％B；
流速：0.44mL/min；
柱温：25℃；
进样量：4μL；
PDA检测器波长：279nm，327nm
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.17％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.75％、0.05％、0.18％、0.08％和0.04％，总含量为1.26％。
实施例6
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
)将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得到滤液即为待测试液；
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法，浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用如下三种方案中的一种：
A相，0.2％甲酸水；B相，纯水
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
⑤0～3min，8％–12％B，3～5min，12％–17％B，5～8min，17％–20％B，8～10min，20％–23％B,10～12min，23％–27％B；
流速：0.36mL/min；
柱温：25℃；
进样量：2μL；
PDA检测器波长：279nm，327nm。
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.67，3.87，5.35，3.11和4.16；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91，4.02，1.66，1.66和3.10；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.16％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.68％、0.06％、0.19％、0.09％和0.04％，总含量为1.23％。
实施例7
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸30粒，精密称定，于20mL量瓶中，加入15mL水，超声15min，待冷却至室温，定容至30mL，过0.2μm的滤膜，得到滤液即为待测试液
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用工作曲线法计算原儿茶醛含量；工作曲线法采用浓度范围在10-100μg/mL的五个梯度的原儿茶醛作为对照品溶液。
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用如下三种方案中的一种：
b、溶剂A0.3％甲酸水溶液–溶剂B乙腈；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
①0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.36mL/min；
柱温：35℃；
进样量：1μL；
可变波长检测器，波长程序：0～3min，281nm，3～8min，329nm，8～10min，281nm。3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44。
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.17％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.74％、0.06％、0.18％、0.08％和0.05％，总含量为1.27％。
实施例8
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸20-30粒，精密称定，于20-30mL量瓶中，加入15-25mL水，超声5-15min，待冷却至室温，定容至20-30mL，过0.2-0.3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液。
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法，其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用：A相，0.2％甲酸水；B相，纯水；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
①0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃；
进样量：3μL；
PDA检测器波长：279nm，331nm；。
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.67，3.87，4.37、3.80和3.40；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91，3.29，1.36，1.66和3.79；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.17％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.68％、0.05％、0.17％、0.09％和0.04％，总含量为1.21％。
实施例9
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸30粒，精密称定，于30mL量瓶中，加入15mL水，超声5-15min，待冷却至室温，定容至30mL，过0.3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法；其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，。
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18(1.7μm,2.1mm i.d.×100mm)，Waters ACQUITYUPLC@BEH C18预柱(1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm)；
流动相选用如下三种方案中的一种：
c、溶剂A0.3％醋酸水溶液–溶剂B乙腈；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
②0～1min，5％-10％B，1～3min，10％–15％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.44mL/min；
柱温：35℃；
进样量：2μL；
PDA检测器波长：279nm，327nm。
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量：
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78；
待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间。
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
经过测定，该待测物中原儿茶醛的含量为0.16％，通过计算得到丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量分别为0.72％、0.05％、0.17％、0.09％和0.04％，总含量为1.23％。
Claims (9)
1.一种复方丹参滴丸的一测多评检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醛含量；
3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的含量；
其中，步骤2)的测定方法为：
用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醛的峰面积，使用外标一点法或工作曲线法计算原儿茶醛含量；
仪器：选择最高耐受压力大于6000psi或400bar的高效液相色谱仪；
色谱柱：选择亚2μm填料尺寸的色谱柱；
流动相选用如下三种方案中的一种：
a、溶剂A为醋酸盐缓冲溶液，其中含0.3-0.5％乙酸及0.05-0.1％三乙胺–溶剂B为乙腈；
b、溶剂A为0.1-0.3％甲酸水溶液–溶剂B为乙腈；
c、溶剂A为0.1-0.3％醋酸水溶液–溶剂B为乙腈；
梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
①0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
②0～1min，5％-10％B，1～3min，10％–15％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
③0～1min，10％–14％B，1～3min，14％–20％B，3～6min，20％–23％B，6～8min，23％–27％B,8～10min，27％–30％B；
④0～0.5min，8％–12％B，0.5～2.5min，12％–17％B，2.5～5.5min，17％–20％B，5.5～7.5min，20％–23％B,7.5～9.5min，23％–27％B；
⑤0～3min，8％–12％B，3～5min，12％–17％B，5～8min，17％–20％B，8～10min，20％–23％B,10～12min，23％–27％B；
流速：0.36-0.44mL/min；
柱温：25-35℃；
进样量：1-5μL；
PDA检测器波长：279-283nm，327-331nm；或可变波长检测器，波长程序：0～3min，281nm，3～8min，329nm，8～10min，281nm。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，
其中，步骤1)将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸20-30粒，精密称定，于20-30mL量瓶中，加入15-25mL水，超声5-15min，待冷却至室温，定容至20-30mL，过0.2-0.3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液。
3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，
其中，步骤1)将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超声10min，待冷却至室温，定容至25mL，过0.22μm滤膜，得到滤液即为待测试液。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，亚2μm填料尺寸的色谱柱为WatersACQUITY UPLC色谱柱或Dikma Endeavorsil色谱柱。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中外标一点法使用浓度为40μg/mL的原儿茶醛作为对照品，工作曲线法采用浓度范围在10-100μg/mL的至少五个梯度的原儿茶醛作为对照品溶液。
6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，
其中，步骤2)中色谱条件设定如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18
Waters ACQUITY UPLC@BEH C18预柱
流动相：A相，0.2％甲酸水；B相，乙腈；
梯度洗脱程序：0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.36-0.44mL/min；
柱温：25-35℃；
进样量：1-5μL；
PDA检测器波长：281nm，329nm。
7.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，
其中，步骤2)中色谱条件设定如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18 1.7μm,2.1mm i.d.×100mm，
Waters ACQUITY UPLC@BEH C18预柱1.7μm particles,2.1mm i.d.×5mm；
流动相：A相为0.2％甲酸水；B相为乙腈；
梯度洗脱程序：0～1min，8％–12％B，1～3min，12％–17％B，3～6min，17％–20％B，6～8min，20％–23％B,8～10min，23％–27％B；
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃；
进样量：3μL；
PDA检测器波长：281nm，329nm。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，
其中，步骤3)使用对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰位置和含量；
定性方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间为0.55-0.67，3.87-4.73，4.37-5.35，3.11-3.80和3.40-4.163；待测物质保留时间的计算公式为：RTx＝RRTx×RTs
其中，RTx和RTs分别代表待分析物和原儿茶醛的保留时间，RRTx为相对保留时间；
定量方式：原儿茶醛相对于丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为5.91-7.23，3.29-4.02，1.36-1.66，1.36-1.66和3.10-3.79；
待测分析物浓度的计算公式为：
其中，Ax和As分别为待分析物和原儿茶醛的峰面积，Cx和Cs分别为待分析物和原儿茶醛的浓度，RFx为待分析物和原儿茶醛的校正因子。
9.根据权利要求7的检测方法，其特征在于，步骤3)使用对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰位置和含量；
所述相对校正因子和相对保留时间如下：
定性：以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对保留时间分别为0.61，4.30，4.86，3.45和3.78；
定量：以原儿茶醛为单个标定物，丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对校正因子分别为6.57、3.65、1.51、1.51和3.44。
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