CN104165937B - 一种高效液相-高分辨率飞行时间串联质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测血液中降血压、降血糖药物的检测方法，其包括如下步骤：(1)检测目标化合物的确认；(2)样品预处理：采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品；(3)采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法(HPLC-QTOF)进行检测，以保留时间、精确分子量、同位素峰丰度比进行筛查分析；(4)对于第(3)步检测阳性样本进行复核；和/或(5)用HPLC-QTOF进行复检，以保留时间、精确分子量进行确认。本发明根据每种药物在本发明设定的检测条件下，存在不同的保留时间，从而独创性地完成了分段进行检测的方法。本发明全部检测完31种药物所需要的时间可以在20分钟以内。其检测准确性高达95％，优选99％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效液相-高分辨率飞行时间串联质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法。
背景技术
飞行安全是关系国计民生的重大问题，高血压、糖尿病是飞行员常见疾病，是许多失能性疾病的基础疾病，也是飞行员停飞的重要原因。合理使用药物仍然是目前治疗高血压、糖尿病的重要措施，从而预防高血压、糖尿病所致的心、肾、脑、神经系统等并发症，延长飞行员飞行年限；然而降压药、降糖药的不合理使用，可能会导致血压、血糖急剧下降，造成飞行员突发失能。根据《民用航空人员体检合格证管理规则》(CCAR-67FS-R2)的规定，中国民航飞行员收缩压/舒张压持续高于155/95mmHg不合格；患有使用胰岛素控制的糖尿病不合格；使用可能影响安全履行职责的药物控制的糖尿病不合格。根据《空勤人员和空中交通管制员体检鉴定》(AP-67FS-002)的规定，允许飞行员使用的抗高血压药物为噻嗪类利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙通道阻滞剂或β受体阻滞剂，同时也规定了飞行员首次或更换抗高血药物，应经至少3至4周的地面观察，血压控制良好，无症状，无所使用药物的不良反应，方能荷药飞行。AP-67FS-002同时还规定，允许飞行员使用的口服降糖药物包括双胍类，或单独使用的α-糖苷酶抑制剂，不能服用磺脲类药物。初次口服降血糖药物后，经地面观察至少60日，证实其病情得到控制，无所服用药物的不良反应。因此，严格遵守民航法规规定，科学合理使用降血压、降血糖药物，是保证飞行员健康，避免药物不良反应影响飞行安全的前提。
为了掌握飞行员糖尿病、高血压的真实患病情况及服药情况，避免因高血压、糖尿病引起飞行员突发失能；同时，为了更准确掌握目前飞行员使用降血压、降血糖药物种类、用量等情况，具体分析当前常用药物在飞行中使用的有效性、安全性，对我国飞行员安全使用相关药物进行评估和分析，需要对中国民航飞行员进行药物专项检查。
目前有相关的文献报道，如高效薄层色谱法测定血液中氨氯地平的药代动力学研究(“Detectionanddeterminationoftotalamlodipinebyhighperformancethin-layerchromatography:ausefultechniqueforpharmacokineticstudies”，K.K.Pandya,等，JournalofChromatographyB,667(1995)315-320，下称文献1)；胶束电动色谱法测定血清样品中格列齐特等6种常用抗高血压药物(“Determinationofantihyperglycemicdrugsinnanomolarconcentrationlevelsbymicellarelectrokineticchromatographywithnon-ionicsurfactant”，VítˇezslavMaier,等，JournalofChromatographyA,1216(2009)4492–4498，下称文献2)；高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定以猴的空白血液为样品基质中二甲双胍等7种常用降血糖药物(“Multi-componentplasmaquantitationofanti-hyperglycemicpharmaceuticalcompoundsusingliquidchromatography–tandemmassspectrometry”，MingWang等，JournalofChromatographyB,856(2007)318–327，下称文献3)，以马的空白血浆为样品基质中格列吡嗪等10种降血糖药物(“Detectionofanti-diabeticsinequineplasmaandurinebyliquidchromatography–tandemmassspectrometry”，EmmieN.M.Hoa,,等，JournalofChromatographyB,811(2004)65–73，下称文献4)，以及血浆样品中包括降糖降压药物在内的55种心血管治疗药物(“DevelopmentofanLC–MS/MSmethodforthequantitationof55compoundsprescribedincombinedcardiovasculartherapy”，OskarGonzalez，等，JournalofChromatographyB,879(2011)243–252，下称文献5)；超高效液相色谱质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定血清中辛伐他汀和阿托伐他汀等(“Ultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometricdetectioninclinicalanalysisofsimvastatinandatorvastatin”，LucieNovákováa,,等，JournalofChromatographyB,877(2009)2093–2103，文献6)。
但上述文献中，文献1和2采用的方法灵敏度较低，消耗样本量大；文献3和文献4采用的是猴血浆或者马血浆为空白基质，与人体的空白血液基质还是有差异，不能真实的反映目标药物在人体内受到的血液基质影响；而且文献4在样品预处理时采用液-液萃取法，提取过程复杂、费时；另外，这2篇文献所检测的降血糖药物种类较少，一些临床常用的药物如二甲双胍没有涉及。文献5检测的心血管药物种类多，其中包括临床常用的降糖降压药物；预处理采用甲醇沉淀蛋白法，方法简单快速；但采用的是液相色谱质谱法，部分目标化合物检测限和定量限相比本实验方法偏高。文献6虽然也采用超高效液相色谱质谱法，但检测药物就2种，种类少，而且样品预处理采用的是固相萃取法，提取过程复杂、费时。
国内外常用的降血压、降血糖药物种类有所不同，现有技术不能涵盖中国常用的药物种类。此外，由于受检对象多(除3万多现役飞行员外，还用于招收飞行学生、外籍飞行员和军转民飞行员))，检测时间有限(影响飞行员取得体检合格证)，生物样本量少，检测目标化合物多，现有方法无法满足上述要求。因此，本实验室旨在建立一种样品处理简便、高灵敏、高准确性的能够同时测定人血浆中临床上常用的11种降糖药物、19种降压药物和1种降脂药物的超高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法，用来满足飞行员体内降糖降压药物的筛查检测需要。
因此，目前尚缺乏可用于飞行员的用药情况的快速易行，灵敏可靠，具有良好的重现性和准确性的检测血液常见降血压、降血糖药物的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，旨在提供了一种采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测血液中常见降血压、降血糖药物的方法，以更准确掌握使用降血压、降血糖药物种类、用量等情况，尤其涉及对我国飞行员安全使用相关药物进行评估和分析，以确定当前常用降血压、降血糖药物在飞行中使用的有效性、安全性。
本发明通过如下技术方案实现：
一种高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测血液中降血压、降血糖药物的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法(HPLC-QTOF)进行检测，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认。
根据本发明，所述HPLC-QTOF采用全扫描模式检测，检测精确分子量和/或同位素丰度比，提高准确度。
根据本发明，所述流动相选自乙酸铵水溶液和乙腈溶液，优选其含量比为(40～60):(60～40)，优选60：40。
根据本发明，所述药物为选自如下的31种药物：
11种降糖药物：二甲双胍(Metformin)、格列美脲(Glimepiride)、瑞格列奈(Repaglinide)、格列喹酮(Glurenor)、罗格列酮(Rosiglitazone)、西他列汀(Sitagliptin)、吡格列酮(Pioglitazonehyrochloride)、格列吡嗪(Glipizide)、格列齐特(Gliclazide)、格列本脲(Glybenzcyclamide)、那格列奈(Nateglinide)；
19种降压药物：氨氯地平(Amlodipin)、厄贝沙坦(Irbesartan)、硝苯地平(Nifedipine)、培哚普利(Perindopril)、吲哒帕胺(Indapamide)、依那普利(Enalaprilmaleate)、拉贝诺尔(Labetalol)、尼卡地平(Nicardipine)、拉西地平(Lacidipine)、尼群地平(Nitrendipine)、非洛地平(Felodipine)、福辛普利(Fosinopril)、坎地沙坦酯(Candesartancilextetil)、贝那普利(Benazepril)、缬沙坦(Valsartan)、维拉帕米(Verapamil)、氯沙坦(Losartan)、阿替洛尔(Atenolol)、地尔硫卓(Diltiazem)；
1种降脂药：阿托伐他汀(Atorystatin)。因常与高血压药物组成复方制剂，故也列入检测范围。
上述药物的选择是根据《中国高血压防治指南2010》、《中国2型糖尿病防治指南(2010年版)》推荐的降血压、降血糖药物目录，并征求临床医生、临床药师、航空医师、航空体检医师的意见后，综合药物是否吸收入血、入血后的活性代谢产物标准品能否购买到等情况后进行的确认。
根据本发明，所述检测方法的具体步骤如下：
仪器：液相色谱-高分辨飞行时间-串联质谱联用仪(如BrukerQ-TOFMS)
色谱柱：XBridgeTMC18(2.1×150mm，5μm)；
流动相：0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-0.1％甲酸的乙腈溶液(60:40)
离子源：电喷雾离子源；正离子方式检测。
扫描方式：全扫描，扫描范围50amu～600amu；
干燥气(DryGas)7.0L/min；干燥温度150-250℃，优选200℃。
根据本发明，所述检测方法还包括如下步骤：
对于HPLC-QTOF检测阳性样本进行复核：对于筛查检测阳性样本，处理浓缩后进行高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测，以保留时间、一对母离子/子离子对进行筛查分析。或者以保留时间、两对母离子/子离子对(优选还以丰度比和/或响应值增加)进行复核。
根据本发明，所述检测方法还包括如下步骤：
对UPLC-MS/MS的复核结果进行复检：用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法(HPLC-QTOF)进行复检，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认。
在本发明的优选实施方式中，本发明提供了一种高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测血液中31种常见降血压、降血糖药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)检测目标化合物的确认
根据《中国高血压防治指南2010》、《中国2型糖尿病防治指南(2010年版)》推荐的降血压、降血糖药物目录，并征求临床医生、临床药师、航空医师、航空体检医师的意见后，综合药物是否吸收入血、入血后的活性代谢产物标准品能否购买到等情况后，我们确立了31种药物作为检测目标化合物，分别是：
11种降糖药物：二甲双胍、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈；
19种降压药物：氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、培哚普利、吲哒帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、阿替洛尔、地尔硫卓；
1种降脂药：阿托伐他汀。因常与高血压药物组成复方制剂，故也列入检测范围。
(2)样品预处理：采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品，优选乙腈。
(3)检测：采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法(HPLC-QTOF)进行检测，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行筛查分析；
优选液相条件为：仪器：液相色谱-高分辨飞行时间-串联质谱联用仪(如BrukerQ-TOFMS)；色谱柱：XBridgeTMC18(2.1×150mm，5μm)；所述流动相选自乙酸铵水溶液和乙腈溶液，优选其含量比为(40～60):(60～40)，优选60：40；优选地，流动相：0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-0.1％甲酸的乙腈溶液(60:40)；离子源：电喷雾离子源；正离子方式检测；扫描方式：全扫描，扫描范围50amu～600amu；干燥气(DryGas)7.0L/min；干燥温度150-250℃，优选200℃。
优选地，所述检测方法还包括如下步骤(4)和/或(5)：
(4)对于第(3)步检测阳性样本进行复核：对于筛查检测阳性样本，处理浓缩后进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、两对母离子/子离子对(优选还以丰度比和/或响应值增加)进行复核；或者对于HPLC-QTOF检测阳性样本，在样品预处理后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、一对母离子对/子离子对及丰度比进行复核；和/或
(5)对第(4)步的结果进行复检：用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法(HPLC-QTOF)进行复检，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认。
根据本发明，步骤(2)中的样品预处理包括将血样进行浓缩处理的步骤。优选地，先将待测抗凝血液离心分离后取上清液至离心管中，加入乙腈混合，再离心分离；取上清液氮气吹干，残渣用乙腈-乙酸铵水溶液溶解离心，取上清液备检。
优选地，所述预处理包括如下步骤：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于60℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，12000rpm离心10min，取上清液备检。
根据本发明，步骤(3)的精确分子量检索，由于同时对31种药物进行扫描，完成一次样本的检测至少需要45分钟以上；而本发明根据每种药物在本发明设定的检测条件下，存在不同的保留时间，从而独创性地完成了分段进行检测的方法。本发明全部检测完31种药物所需要的时间可以在20分钟以内，优选15分钟以内。其检测准确性高达95％，优选99％以上，甚至由于精确分子量的检测方法，本发明的检测准确度可以为100％。
根据本发明，所述31种药物的保留时间如下表1所示。所述31种药物的精确分子量如下表1第2栏所示。
本发明步骤(3)中，根据保留时间和精确分子量的同时匹配初步确定所检测药物，从而显示为阳性。
表1.血液中常见降压药、降糖药的HPLC-QTOF分析参数
其中，干燥气为7.0L/min，干燥温度为200℃，CE为碰撞能量，IE为离子能量。
由于不同的检测条件，各化合物的保留时间不同；不同的样品处理方法和检测条件，其检测限(或检出限)也不同，所以本发明上述表格以及下述表格中列出的保留时间和检测限(或检出限)是与本实验优化获得的检测方法相对应的，也是判别待测样品阳性与否的依据。其中检测限为某特定方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或量。它是判断建立的检测方法灵敏与否的重要参考指标。
本发明中，丰度比是最大的离子峰(M+)作为基峰(100％)，其他离子峰与该离子峰的强度百分比。而这些离子丰度比或者同位素丰度比是根据图谱比较获得的。根据本发明，所述步骤(4)的复核步骤中，以保留时间、两对母离子/子离子对进行复核，优选保留时间、两对母离子/子离子对、丰度比和/或响应值增加进行复核。
根据本发明，所述步骤(4)复核步骤中，对于HPLC-QTOF检测阳性样本，在样品预处理后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、一对母离子对/子离子对进行复核，优选以保留时间、一对母离子对/子离子对和丰度比进行复核。
根据本发明，所述步骤(4)的复核条件如下：液相条件为：ACQUITYUPLCHSSC18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)，流动相为含0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-含0.1％甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min；柱温30℃；质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV。
根据本发明，在采用一对母离子对/子离子对的复核方法中，所述样品进行预处理步骤中，所述有机溶剂优选为乙腈。优选地，先将待测抗凝血液离心分离后取上清液至离心管中，加入乙腈混合，再离心分离；取上清液备检。
根据本发明，所述样品处理步骤具体包括：取待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600uL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液备检。根据本发明，所述一对母子/子离子对的参数如下表2所示：
表2、31种降压药、降糖药的UPLC-MS/MS复核定性分析参数
本发明中，所述响应值是指在色谱仪器分析中,组分通过检测器时所给出的信号的大小。物质的响应值取决于物质的性质和浓度,同一含量的不同物质由于其理化性质的不同在同种检测器上会产生不同的响应值。在本发明，采用检测限或者检出限作为响应值的评价标准。
本发明中，母离子裂解时会产生很多的碎片离子(子离子)，在优化质谱条件时选择信号最好，稳定性最高的1个或者多个子离子(称为子离子对)进行检测结果的评价，这样目标化合物的检测信号就会越好，分辨率越高干扰越小，检测结果的准确性越高。
根据本发明的另一优选方案，所述步骤(4)复核步骤中，对于HPLC-QTOF检测阳性样本，在样品预处理后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、两对母离子对/子离子对(优选还以丰度比和/或响应值增加)进行复核。
根据本发明，所述步骤(4)复核步骤的预处理包括如下步骤：筛查阳性抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清于60℃水浴中氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液备检。
根据本发明，所述相对离子丰度比的最大允许误差如表3所示。
表3、相对离子丰度比的最大允许相对误差(％)
根据本发明，所述两对母离子对/子离子对如表4第3栏所示。
根据本发明，所述保留时间如表4第3栏所示。
优选地，所述复核方法包括，将同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核组内。基于该原则，所述分组方法可以有很多种。
根据本发明，所述复核方法分为如下五组：
第一组的药物包括：二甲双胍、罗格列酮、氨氯地平、吲哒帕胺、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
第二组的药物包括：阿替洛尔、依那普利、贝那普利、厄贝沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酯；
第三组的药物包括：培哚普利、维拉帕米、格列吡嗪、缬沙坦、格列本脲、拉西地平；
第四组的药物包括：拉贝洛尔、地尔硫卓、氯沙坦、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平；
第五组的药物包括：西他列汀、比格列酮、格列齐特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮。
根据本发明，所述分组方法如下表4所示。
表4、血液中常见降压药、降糖药的UPLC-MS/MS复核定性分析参数
根据本发明，所述复核方法还可以分为如下五组：
第一组的药物包括：阿替洛尔、罗格列酮、贝那普利、厄贝沙坦、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
第二组的药物包括：二甲双胍、依那普利、氨氯地平、吲哒帕胺、瑞格列奈、坎地沙坦酯；
第三组的药物包括：培哚普利、地尔硫卓、氯沙坦、缬沙坦、格列本脲、拉西地平；
第四组的药物包括：拉贝洛尔、维拉帕米、格列吡嗪、阿托伐他汀、那格列奈、格列喹酮；
第五组的药物包括：西他列汀、比格列酮、格列齐特、尼卡地平、格列美脲、非洛地平。
当然，将结构相近或者保留时间相近的物质分在不同的组进行测定的方法还可以为其他情形。本发明并不限于上述明确列举的情形。
本发明中，所述步骤(5)的复检方法如步骤(3)所示。优选地，除预处理以外，其他全部方法与步骤(3)相同。所述预处理如下：复检时，取筛查阳性血浆样品200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心5min，取上清液备检。
根据本发明，所述复检方法中，如果待测样本中检出的色谱峰保留时间与空白血浆添加对照品的色谱峰保留时间比较，相差小于±0.1min；并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现目标物分子离子峰，质量数偏差小于5mDa，且同位素峰形匹配良好，则可判断样品中存在这种化合物。
本发明另一方面还提供了一种采用本发明上述检测方法检测血液中31种常见降血压、降血糖药物的方法的确认方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)专属性考察
特异性：(a)选择多个(优选6个)不同来源的人空白血浆样品，确定内源性物质是否对目标化合物检测有干扰；(b)确定不同化合物间是否存在相互干扰。
(2)检出限：依据信噪比S/N≥3判定(n＝3)。
(3)样品稳定性：2倍检出限浓度的质控样本(n＝5)；分别考察进样室温(10℃；15h)、冷藏(4℃；7天)、冷冻(-18℃；15天)后的稳定性。
本发明另一目的是提供一种高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测飞行员血液中常见降糖降压药物的方法，包括如下步骤：
(1)收集临床服药患者(优选民航医院飞行员)血液样本，应用建立的高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测方法进行检测，并与实际服药情况进行对比。
(2)对飞行员血液样本采用本发明的降糖降压药物筛查检测，并与《民用航空人员体检合格证管理系统》中记录的飞行员患病情况、服药情况进行对比，以确认是否存在不符合服药要求的情形。
民航相关法规规定，允许飞行员使用的抗高血压药物为噻嗪类利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙通道阻滞剂或β受体阻滞剂。AP-67FS-002同时还规定，允许飞行员使用的口服降糖药物包括双胍类，或单独使用的α-糖苷酶抑制剂，不能服用磺脲类药物。如果飞行员服用民航法规规定外的降糖降压药物即为不符合服药要求；另外，私自服用降糖降压药物未上报民航局的也为不符合服药要求。
本发明具有如下技术效果：
1、我们采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱仪对以上31种化合物进行研究，建立了《血液中31种常见降压、降糖药物的液相色谱-质谱检测方法》，并对方法进行了确证研究，包括专属性、重现性、检出限、样品稳定性等的研究，结果表明该检测方法满足《中华人民共和国药典》(2010年版二部)的相关要求；并经查阅文献和药品说明书等，本方法检出限(n＝3)均低于药物有效血药浓度，满足实际检测的要求。
2.自方法建立以来，本实验室不同的检测人员对3批血浆盲样进行了检测，其中每2名检测人员检测同一份盲样，以便同时进行结果比对和重现性考察。实验结果发现，第1批盲样含有二甲双胍、氯沙坦、贝那普利和氨氯地平；第二批盲样含有格列喹酮、非洛地平和格列齐特；第3批盲样含有厄贝沙坦、拉西地平和缬沙坦。每2名检测人员检测结果一致，检测结果准确。不同检测人员进行盲样检测考核，均得到满意结果，表明检测结果证明重现性良好；对14例临床使用药物的病人血样进行了检测，检测结果与服药情况基本相符；并对185名飞行员血液样本进行了检测，经与《民用航空人员体检合格证管理系统》核对，检测结果与飞行员患病情况、或服药情况相符合。
3.本发明人建立的常见降糖降压药物的高效液相-高分辨飞行时间串联质谱仪，采用乙腈直接沉淀蛋白，样品预处理简单，分析时间仅用10多分钟即可对31种药物进行快速检测；从以上结果可以看出，该方法快速易行，灵敏可靠，具有良好的重现性和准确性，可作为实验室检测标准执行，用于飞行员的用药情况检测。
附图说明
图1中，(a)为人空白血浆样品总离子流图；(b)为二甲双胍、罗格列酮、氨氯地平、吲哒帕胺、硝苯地平、尼群地平和福辛普利的提取离子对色谱图(TIC)。
图2中，(a)为人空白血浆样品总离子流图；(b)为阿替洛尔、依那普利、贝那普利、厄贝沙坦、氯沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酯的提取离子对色谱图(TIC)。
图3中，(a)为人空白血浆样品总离子流图；(b)为培哚普利、维拉帕米、格列吡嗪、缬沙坦、格列本脲、拉西地平的提取离子对色谱图(TIC)。
图4中，(a)为人空白血浆样品总离子流图；(b)为拉贝洛尔、地尔硫卓、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平的提取离子对色谱图(TIC)。
图5中，(a)为人空白血浆样品总离子流图；(b)为西他列汀、比格列酮、格列齐特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮的提取离子对色谱图(TIC)。
图6：血浆浓度为100.0ng/mL的福辛普利提取特征离子色谱图(TIC)
图7：血浆浓度为50.0ng/mL的二甲双胍、西他列汀、拉贝诺尔、依那普利和格列吡嗪提取特征离子色谱图(TIC)。
图8：血浆浓度为25.0ng/mL的培哚普利、拉西地平、格列喹酮、吲哚帕胺、那格列奈和非洛地平提取特征离子色谱图(TIC)。
图9：血浆浓度为10.0ng/mL的罗格列酮、硝苯地平、氨氯地平、厄贝沙坦、阿托伐他汀、地尔硫卓、尼群地平、格列美脲和格列本脲提取特征离子色谱图(TIC)。
图10：血浆浓度为5.0ng/mL的贝那普利、瑞格列奈、坎地沙坦酯、氯沙坦、缬沙坦、吡格列酮、格列齐特和维拉帕米提取特征离子色谱图(TIC)。
图11：血浆浓度为2.0ng/mL的尼卡地平提取特征离子色谱图(TIC)。
图12：人空白血浆样品色谱图(TIC)。
图13：(a)(b)(c)为5位实验室检测人员检测的三批盲样结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。
实施例1建立血液中降糖降压药物检测方法
1.1检测目标化合物的确立及化合物的基本性质
31种常用降血压、降血糖药物相关的化学特性见表5；药物适应症、不良反应、文献报道代谢半衰期、最低检出限、最低定量限见表6-1和6-2。
表5、目标化合物化学性质列表
表6-1、31种药物半衰期、最低检出限、最低定量限列表
表6-2、31种药物适应症、不良反应列表
1.2目标化合物HPLC-QTOF检测仪器方法的建立
1.2.1试剂与仪器
1.2.1.1试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。二甲双胍、氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、吲哒帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、地尔硫卓对照品，纯度≥97％。乙腈(GR)；乙酸铵(GR)；甲酸(优级纯)；去离子水由超纯水仪(Millipore纯水系统)制备。
1.2.1.2仪器
液相色谱-高分辨飞行时间-串联质谱联用仪(BrukerQ-TOFMS)；可调移液器(法国吉尔森)；SIGMA3-18K型台式高速冷冻离心机(德国)；数控恒温水浴氮吹仪SE512J型(北京帅恩科技有限责任公司)；赛多利斯BT25S十万分之一天平(德国)；漩涡混匀器。
1.2.1.3质谱参数
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；检测方式：全扫描，扫描范围50amu～1000amu；干燥气(DryGas)7.0L/min；干燥温度(DryTemp)200℃；IE值：3eV；CE值：3～5eV；二甲双胍、氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、吲哚帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、地尔硫卓的监测离子m/z分别为130.1087、409.1525、429.2397、347.1138、559.2603、491.2289、453.2719、528.2126、358.1204、408.1241、357.1269、446.1834、324.1377、494.1470、318.2063、369.2372、366.0668、377.2057、329.1862、480.2089、456.2362、361.1396、384.0769、564.3012、611.2618、425.2076、436.2349、455.2910、423.1700、415.1540。
1.2.2样品预处理
待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于60℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，12000rpm离心10min，取上清液备检。
1.2.3对照样品制备
同法取空白血浆两份，其中一份添加初筛检出呈阳性化合物的对照品工作液，制成质量浓度为该化合物的5倍最低检测限浓度(见表1)的质控样品，处理步骤同1.2.1，以进行空白对照和添加对照分析。
HPLC-QTOF条件：
色谱柱：XBridgeTMC18(2.1×150mm，5μm)或相当者；
柱温：30℃；
进样量：5μL
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
检测方式：全扫描
碰撞能量(CE)等参数见表1。
流动相参数如下表7所示：
表7
1.2.4结果判定
记录空白添加﹑空白和样品提取物中目标化合物色谱峰的保留时间及分子离子峰，并将相关图谱、数据及时打印或作为电子版本保存。
所述31种药物的HPLC-QTOF检测分析数据如表1所示。
1.3.1UPLC-MS复核检测方法的建立
1.3.1.1原理
本法采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式进行复核检测，以保留时间、一对母离子/子离子对进行筛查分析。对于筛查检测阳性样本，或者以保留时间、两对母离子/子离子对及丰度比、响应值增加进行复核。
1.3.1.2试剂和仪器
1.3.1.2.1试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。二甲双胍、氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、阿托伐他汀、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈、培哚普利、吲哒帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、阿替洛尔、地尔硫卓对照品，纯度≥97％。乙腈(GR)；乙酸铵(GR)；甲酸(优级纯)；去离子水由超纯水仪(Millipore纯水系统)制备。
1.3.1.2.2仪器
超高效液相色谱/三重四级杆质谱仪(TQDUPLC-MS，美国沃特斯有限公司)；可调移液器(法国吉尔森)；SIGMA3-18K型台式高速冷冻离心机(德国)；赛多利斯BT25S十万分之一天平(德国)；漩涡混匀器。
采用Waters公司色谱柱ACQUITYUPLCHSSC18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)；配制31种化合物0.5μg/mL的甲醇溶液，在质谱进样口直接连续进样，使用质谱自动优化功能，分别优化31种化合物的锥孔电压、碰撞能量、氩气压强、筛选离子对等。
1.3.1.3阳性样品复核方法1
对1.2.4结果进行以保留时间、一对母离子/子离子对进行筛查分析。复核检测时，待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清备检。
在复核检测法步骤中，液相条件为：ACQUITYUPLCHSSC18柱(1.8μm×2.1mm×150mm)，流动相为含0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-含0.1％甲酸的乙腈溶液(60:40)，流速0.2mL/min；柱温30℃；质谱条件为：离子源：ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)；液氮气体流速650L/hr，毛细管电压(capillary)3.0KV。
所述31种药物的保留时间、一对母离子对/子离子对、血液中检出限如本发明表2所示。
1.3.1.4阳性样本复核方法2
对1.2.4结果进行以以保留时间、两对母离子/子离子对及丰度比、响应值增加进行复核。处理样品后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、两对母离子/子离子对及丰度比、响应值增加进行复核。复核检测，处理方法如下：取筛查阳性血浆样品200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心5min，取上清液备检。
复核方法分五组，同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。31种药物的质谱参数及保留时间如表3所示。
1.4复检阳性化合物HPLC-QTOF检测仪器方法的建立
该步骤中，除样品预处理方法与第1.2节不同以外，其他方法全部相同。
复检时，取筛查阳性血浆样品200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心5min，取上清液备检。
1.5方法学考察
1.5.1检出限
200μL空白血浆若干份，分别添加31种化合物对照品溶液，制备成质量浓度为100、50、25、10、5、2ng/mL的质控样品(n＝3)，按“1.2.2”项样品预处理方法处理样品后，作HPLC-QTOF检测。按信噪比S/N≥3计(图1～图11)，得到31个化合物的检出限(见表1)。
1.5.2特异性
各取6个不同来源的人空白血浆样品200μL，按如下方法预处理后：复核检测时，取筛查阳性血浆样品200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心5min，取上清液备检。
作HPLC-QTOF检测，得到人空白血浆样品总离子流图；结果与上述1.5.1检出限项下图谱比较，未发现内源性物质对目标化合物检测有干扰(见图12)。
综上所述，根据药典附录中液相色谱-质谱分析检测指导原则以及参考大量的相关科研文献，我们建立了31种常见降血压、降血糖药物的液相色谱质谱检测方法，并考察了方法的特异性、检出限等，结果表明所建方法满足药典指导原则的要求，简单易行、科学稳定可靠，可作为本实验室开展常见降血压、降血糖药物筛查检测的准则。
实施例2本发明的血液降糖降压药物检测方法的应用
为了检验实施例1建立的液相色谱质谱法检测血液样本中降糖降压药物结果的准确性，我们收集了14例民航医院临床病人的血液样本，采用实施例1的血液中常见降血压、降血糖药物HPLC-QTOF检测方法对其进行了降糖降压药物筛查检测。结果见表8。
表8、临床病人血液中降糖降压药物的检测表
从以上结果可以看出，检测结果与医嘱服药资料基本相符，表明所建立的检测降糖降压药物的液相色谱-质谱方法灵敏可靠。
检测方法建立后，本单位配制了3批盲样，对实验室5名检测人员进行了考核。其中每2名检测人员检测同一份盲样，以便同时进行结果比对和重现性考察。实验结果发现，第1批盲样含有二甲双胍、氯沙坦、贝那普利和氨氯地平；第二批盲样含有格列喹酮、非洛地平和格列齐特；第3批盲样含有厄贝沙坦、拉西地平和缬沙坦。每2名检测人员检测结果一致，分别与质量业务办公室核对，检测结果准确。表明5名检测人员有能力进行常见降糖降压药物检测，以及不同的检测人员检测结果的重现性良好(图13)。
另外，我们应用建立的降糖降压药物检测方法对185名飞行员血液样本进行筛查检测，实现了小样本量、简单前处理、在10分钟内对31种药物的快速检测，检测结果经与《民用航空人员体检合格证管理系统》比对，与飞行员的患病情况、或服药情况相符合，表明所建立的检测方法简单易行、准确可靠、实用性强，可作为民航医学中心检验标准执行。
实验室依据《中华人民共和国药典(2010年版)》二部附录XIXB〈药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则〉中规定，并参考相关的药代动力学研究文献，建立了常见的31种降糖降压药物液质检测方法，并进行了方法学验证研究，包括特异性、检出限、稳定性和重现性，结果符合《中华人民共和国药典》(2010年版二部)的相关要求，经查阅文献，本方法检出限(n＝3)均低于药物有效血药浓度，满足实际检测的要求。
Claims (21)
1.一种高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法检测血液中降血压、降血糖药物的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法，即HPLC-QTOF进行检测，所述HPLC-QTOF采用全扫描模式检测，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认，
所述药物选自如下的31种药物：
11种降糖药物：二甲双胍、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈；
19种降压药物：氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、培哚普利、吲哒帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、阿替洛尔、地尔硫卓；
1种降脂药：阿托伐他汀，
检测仪器：液相色谱-高分辨飞行时间-串联质谱联用仪；
所述色谱柱：XBridgeTMC18，条件为2.1×150mm，5μm；
流动相选自乙酸铵水溶液和乙腈溶液，含量比为(40～60):(60～40)。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述流动相选自乙酸铵水溶液和乙腈溶液，含量比为60：40。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下：
检测仪器：液相色谱-高分辨飞行时间-串联质谱联用仪BrukerQ-TOFMS；
所述流动相：0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-0.1％甲酸的乙腈溶液，其含量比为60:40；
离子源：电喷雾离子源；正离子方式检测；
扫描方式：全扫描，扫描范围50amu～600amu；
干燥气7.0L/min；干燥温度150-250℃。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述干燥温度200℃。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
对于HPLC-QTOF检测阳性样本进行复核：对于筛查检测阳性样本，处理浓缩后进行超高效液相色谱-串联质谱法，即UPLC-MS/MS检测，以保留时间、一对母离子/子离子对进行筛查分析；或者以保留时间、两对母离子/子离子对进行复核。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测以保留时间、两对母离子/子离子对以及丰度比和/或响应值增加进行复核。
7.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：
对UPLC-MS/MS的复核结果进行复检：用高效液相-高分辨飞行时间串联质谱法，即HPLC-QTOF进行复检，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)检测目标化合物的确认
11种降糖药物：二甲双胍、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、那格列奈；
19种降压药物：氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、培哚普利、吲哒帕胺、依那普利、拉贝诺尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、坎地沙坦酯、贝那普利、缬沙坦、维拉帕米、氯沙坦、阿替洛尔、地尔硫卓；
1种降脂药：阿托伐他汀；
(2)样品预处理：采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品；
(3)检测：采用HPLC-QTOF进行检测，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行筛查分析；
(4)对于第(3)步检测阳性样本进行复核：对于HPLC-QTOF筛查检测阳性样本，处理浓缩后进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、两对母离子/子离子对进行复核；或者对于HPLC-QTOF筛查检测阳性样本，在样品预处理后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、一对母离子对/子离子对进行复核；和/或
(5)对第(4)步的结果进行复检：用HPLC-QTOF进行复检，以保留时间、精确分子量和/或同位素峰丰度比进行确认。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，
所述步骤(2)中的有机溶剂为乙腈；所述步骤(2)中的样品预处理包括将血样进行浓缩处理的步骤；
所述步骤(3)中的液相条件为：离子源：电喷雾离子源；正离子方式检测；扫描方式：全扫描，扫描范围50amu～600amu；干燥气(DryGas)7.0L/min；干燥温度150-250℃；
所述步骤(4)中，所述UPLC-MS/MS检测以保留时间、两对母离子/子离子对以及丰度比和/或响应值增加进行复核，或者以保留时间、一对母离子对/子离子对以及丰度比进行复核。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的液相流动相：0.1％甲酸的5mM乙酸铵水溶液-0.1％甲酸的乙腈溶液，其含量比为60:40。
11.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述步骤(2)的预处理包括如下步骤：
先将待测抗凝血液离心分离后取上清液至离心管中，加入乙腈混合，再离心分离；取上清液氮气吹干，残渣用乙腈-乙酸铵水溶液溶解离心，取上清液备检。
12.根据权利要求10的方法，其特征在于，
所述预处理包括如下步骤：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液于60℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，12000rpm离心10min，取上清液备检。
13.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述31种药物的保留时间和/或精确分子量如下表1所示：
其中，干燥气为7.0L/min，干燥温度为200℃，CE为碰撞能量，IE为离子能量；
表1.血液中常见降压药、降糖药的HPLC-QTOF分析参数
其中，干燥气为7.0L/min，干燥温度为200℃，CE为碰撞能量，IE为离子能量；
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，
在采用一对母离子对/子离子对的复核方法中，所述样品进行预处理步骤中，先将待测抗凝血液离心分离后取上清液至离心管中，加入乙腈混合，再离心分离；取上清液备检。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述样品处理步骤具体包括：取待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600uL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液备检。
16.根据权利要求8-15任一项的方法，其特征在于，所述一对母子/子离子对的参数如下表2所示：
表2、31种降压药、降糖药的UPLC-MS/MS复核定性分析参数
17.根据权利要求16的方法，其特征在于，所述步骤(4)复核步骤中，对于HPLC-QTOF检测阳性样本，在样品预处理后，进行UPLC-MS/MS检测，以保留时间、两对母离子对/子离子对以及丰度比和/或响应值增加进行复核。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于，所述步骤(4)复核步骤的预处理包括如下步骤：筛查阳性抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入600μL乙腈，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清于60℃水浴中氮气吹干，残渣加入100μL80％乙腈-5mM乙酸铵水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液备检。
19.根据权利要求8-15任一项的方法，其特征在于，所述两对母离子对/子离子对和/或保留时间如表4所示:
表4、血液中常见降压药、降糖药的UPLC-MS/MS复核定性分析参数
20.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述复核方法包括，将同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核组内。
21.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述复核方法分为如下五组：
第一组的药物包括：二甲双胍、罗格列酮、氨氯地平、吲哒帕胺、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
第二组的药物包括：阿替洛尔、依那普利、贝那普利、厄贝沙坦、瑞格列奈、坎地沙坦酯；
第三组的药物包括：培哚普利、维拉帕米、格列吡嗪、缬沙坦、格列本脲、拉西地平；
第四组的药物包括：拉贝洛尔、地尔硫卓、氯沙坦、阿托伐他汀、格列美脲、非洛地平；
第五组的药物包括：西他列汀、比格列酮、格列齐特、尼卡地平、那格列奈、格列喹酮；或
所述复核方法分为如下五组：
第一组的药物包括：阿替洛尔、罗格列酮、贝那普利、厄贝沙坦、硝苯地平、尼群地平、福辛普利；
第二组的药物包括：二甲双胍、依那普利、氨氯地平、吲哒帕胺、瑞格列奈、坎地沙坦酯；
第三组的药物包括：培哚普利、地尔硫卓、氯沙坦、缬沙坦、格列本脲、拉西地平；
第四组的药物包括：拉贝洛尔、维拉帕米、格列吡嗪、阿托伐他汀、那格列奈、格列喹酮；
第五组的药物包括：西他列汀、比格列酮、格列齐特、尼卡地平、格列美脲、非洛地平。
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