CN109917043A - 一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，采用LC‑MS液质联用仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Welch XB‑C18色谱柱，流动相A为体积分数为0.09‑0.11％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为0.45‑0.55mL/min，柱温为35‑45℃，进行梯度洗脱。本发明灵敏度高，准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析方法技术领域，尤其涉及一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法。
背景技术
吲达帕胺为噻嗪样利尿药，二氢吲哚类衍生物，具有利尿作用和钙拮抗作用，为一种新的强效、长效降压药，临床上还用于充血性心力衰竭时水钠潴留的治疗。吲达帕胺可通过阻滞钙内流而松弛血管平滑肌，使外周血管阻力下降，产生降压效应，而其利尿作用则不能解释降压作用，因出现降压作用时的剂量远远小于利尿作用的剂量；吲达帕胺降压时对心排血量、心率及心律影响小或无；长期用药很少影响肾小球滤过率或肾血流量；吲达帕胺通过抑制远端肾小管皮质稀释段再吸收水和电解质而发挥利尿作用。
为了保证用药的安全性进行临床试验，考察药物在人体中的血药浓度，完善药物在人体内的吸收、分布、代谢、排泄情况是非常必要的，而检测方法的准确、快速，可以进一步增加临床试验的准确性，并缩短检测时间，并且由于吲达帕胺的特殊性通常需要检测全血中药物浓度。而普通检测方法主要应用于分离后的血浆，且准确率、效率较低，因此需要提供更加准确高效、全面、快速的检测方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，本发明稳定可靠、灵敏准确，检测周期短，且样品前处理简单，可用于临床试验研究。
本发明提出的一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，采用LC-MS液质联用仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Welch XB-C18色谱柱，流动相A为体积分数为0.09-0.11％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为0.45-0.55mL/min，柱温为35-45℃，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A和流动相B的体积比从70：30匀速渐变至10：90；3-3.5min内，流动相A和流动相B维持体积比为10：90；3.5-4min内，流动相A和流动相B的体积比从10：90匀速渐变至70：30；4-5min内，流动相A和流动相B维持体积比为70：30；
所述质谱条件为：离子源为ESI离子源，检测方式为负离子检测，扫描方式为多反应监测MRM，接口电压为3.0-3.5kV，接口温度为300-375℃，DL温度为200-300℃，加热块温度为400℃，转换打拿极电压为10.0kV，检测器电压为1.0kV，CID气压为230kpa。
优选地，高效液相色谱条件中，色谱柱的规格为50×3.0mm，孔径为3μm。
优选地，高效液相色谱条件中，流动相A为体积分数为0.1％甲酸水溶液。
优选地，高效液相色谱条件中，流速可以为0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54或0.55mL/min。
优选地，高效液相色谱条件中，流速为0.5mL/min。
优选地，高效液相色谱条件中，柱温可以为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃。
优选地，高效液相色谱条件中，柱温为40℃。
优选地，高效液相色谱条件中，进样量为5-20μL。
优选地，高效液相色谱条件中，进样量可以为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μL。
优选地，高效液相色谱条件中，进样量为10μL。
优选地，其具体步骤为：用吲哒帕胺标准品和空白生物基质配制标准曲线样品，进样并绘制标准曲线获得回归方程，取待测溶液进样，通过内标法按回归方程计算吲哒帕胺的血药浓度，其中，待测溶液为待测血浆溶液或/和待测全血溶液。
优选地，空白生物基质为健康人全血经EDTA-K2抗凝的血浆或全血，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
本发明涵盖吲哒帕胺血浆和吲哒帕胺全血两种基质检测分析，本领域技术人员可以根据研究需要，仅检测其中一种基质或者两者均检测。
优选地，内标物为呋塞米。
本发明人对吲哒帕胺标准品和内标物呋塞米的离子对、驻留时间、CE等参数进行优化，优化后的参数如下：
优选地，待测血浆为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血经EDTA-K2抗凝，分离后取血浆，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
优选地，待测全血为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血，经EDTA-K2抗凝后于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
优选地，待测血浆溶液的配制方法为：取待测血浆100μL于2mL离心管中，加入200μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
优选地，待测全血溶液的配制方法为：取待测全血100μL于2mL离心管中，加入100μL水，涡旋30s，加入400μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
优选地，内标工作液的浓度为25ng/mL。
内标工作液的制备方法为：精密称取内标物呋塞米标准品约10.000mg于玻璃样品瓶中，加入甲醇，溶解完全之后得浓度为1.000mg/mL的内标储备液，取适量内标储备液，以甲醇稀释，配制成浓度25ng/mL的内标工作液。
上述水均为纯化水。
与HPLC等技术相比较，本发明选用LC-MS联用技术并开发出适宜的检测条件，使得本发明检测吲哒帕胺时，灵敏度高、准确率好、分析速度快，可以增加检测准确性，并且一些吲达帕胺的缓释制剂，其释放量很小，血药浓度很低，本发明仍具有良好的灵敏度，血浆定量限为1ng/mL，全血定量限为0.5ng/mL，提高了临床试验检测的准确性。
附图说明
图1为标准曲线血浆样品的液质联用谱图。
图2为标准曲线全血样品的液质联用谱图。
图3为待测血浆溶液的液质联用谱图。
图4为待测全血溶液的液质联用谱图。
图5为吲达帕胺的血浆标准曲线。
图6为吲达帕胺的全血标准曲线。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，采用岛津LCMS-8045仪器检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Welch XB-C18色谱柱，流动相A为体积分数为0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为0.5mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，洗瓶溶液为甲醇、异丙醇、水体积比为1：1：1的混合溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A和流动相B的体积比从70：30匀速渐变至10：90；3-3.5min内，流动相A和流动相B维持体积比为10：90；3.5-4min内，流动相A和流动相B的体积比从10：90匀速渐变至70：30；4-5min内，流动相A和流动相B维持体积比为70：30；
所述质谱条件为：离子源为ESI离子源，检测方式为负离子检测，扫描方式为多反应监测MRM，接口电压为3.0kV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，转换打拿极电压为10.0kV，检测器电压为1.0kV，CID气压为230kpa；
吲哒帕胺标准品和内标物呋塞米的离子对、驻留时间、CE等参数如下：
溶液配制：
内标工作液：精密称取内标物呋塞米标准品约10.000mg于玻璃样品瓶中，加入甲醇，溶解完全之后得浓度为1.000mg/mL的内标储备液，取适量内标储备液，以甲醇稀释，配制成浓度25ng/mL的内标工作液。
标准曲线溶液的配制方法如下：
1.标准品储备液的配制：精密称取吲哒帕胺标准品10.000mg于玻璃样品瓶中，加入甲醇，溶解完全之后得浓度为1.000mg/mL的吲哒帕胺储备液，命名为SS-A。
2.血浆标准曲线工作溶液的配制：取标准品储备液用甲醇稀释，配制成浓度为20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、5000ng/mL的一系列血浆标准曲线工作溶液。
3.全血标准曲线工作溶液的配制：取标准品储备液用甲醇稀释，配制成浓度为10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL、3200ng/mL、4000ng/mL的一系列标准曲线工作溶液。
配制标准曲线样品：
4.标准曲线血浆样品：取上述血浆标准曲线工作溶液各10μL加入到190μL空白生物基质(空白人血浆)中得到浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、250ng/mL的一系列标准曲线样品；取上述各标准曲线样品100μL于2mL离心管中，加入200μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
5.标准曲线全血样品：取上述全血标准曲线工作溶液各10μL加入到200μL空白生物基质(空白人全血)中得到浓度为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的一系列标准曲线样品；取上述各标准曲线样品100μL于2mL离心管中，加入100μL水，涡旋30s，加入400μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
空白生物基质为健康人全血经EDTA-K2抗凝的血浆或全血，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
待测血浆为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血经EDTA-K2抗凝，分离后取血浆，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
待测全血为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血，经EDTA-K2抗凝后于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
6.待测血浆溶液：取待测血浆100μL于2mL离心管中，加入200μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
7.待测全血溶液：取待测全血100μL于2mL离心管中，加入100μL水，涡旋30s，加入400μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
具体步骤为：用吲哒帕胺标准品和空白生物基质配制标准曲线样品，进样并绘制标准曲线获得回归方程，取待测溶液进样，通过内标法按回归方程计算吲哒帕胺的血药浓度，其中，待测溶液为待测血浆溶液和待测全血溶液。
典型图谱见图1-4，图1为标准曲线血浆样品的液质联用谱图；图2为标准曲线全血样品的液质联用谱图；图3为待测血浆溶液的液质联用谱图；图4为待测全血溶液的液质联用谱图。
图5为实施例1中吲达帕胺的血浆标准曲线；其中，各血浆样品的浓度X(ng/mL)为横坐标，各标准品峰面积与内标物峰面积比值Y为纵坐标，用加权(1/X2)最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程为y＝0.275973x-0.00318272，R2为0.9975347，线性范围为1-250ng/mL，定量限为1.000ng/mL，本发明的灵敏度高。
图6为实施例1中吲达帕胺的全血标准曲线；其中，各全血样品的浓度X(ng/mL)为横坐标，各标准品峰面积与内标物峰面积比值Y为纵坐标，用加权(1/X2)最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程为y＝2.80370x+0.000135868，R2为0.9946432，线性范围为0.5-200ng/mL，定量限为0.5000ng/mL，本发明的灵敏度高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，采用LC-MS液质联用仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Welch XB-C18色谱柱，流动相A为体积分数为0.09-0.11％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为0.45-0.55mL/min，柱温为35-45℃，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0-3min内，流动相A和流动相B的体积比从70：30匀速渐变至10：90；3-3.5min内，流动相A和流动相B维持体积比为10：90；3.5-4min内，流动相A和流动相B的体积比从10：90匀速渐变至70：30；4-5min内，流动相A和流动相B维持体积比为70：30；
所述质谱条件为：离子源为ESI离子源，检测方式为负离子检测，扫描方式为多反应监测MRM，接口电压为3.0-3.5kV，接口温度为300-375℃，DL温度为200-300℃，加热块温度为400℃，转换打拿极电压为10.0kV，检测器电压为1.0kV，CID气压为230kpa。
2.根据权利要求1所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，高效液相色谱条件中，色谱柱的规格为50×3.0mm，孔径为3μm。
3.根据权利要求1或2所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，高效液相色谱条件中，流动相A为体积分数为0.1％甲酸水溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，高效液相色谱条件中，流速为0.5mL/min。
5.根据权利要求1-4任一项所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，高效液相色谱条件中，柱温为40℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，高效液相色谱条件中，进样量为5-20μL；优选地，高效液相色谱条件中，进样量为10μL。
7.根据权利要求1-6任一项所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，其具体步骤为：用吲哒帕胺标准品和空白生物基质配制标准曲线样品，进样并绘制标准曲线获得回归方程，取待测溶液进样，通过内标法按回归方程计算吲哒帕胺的血药浓度，其中，待测溶液为待测血浆溶液或/和待测全血溶液。
8.根据权利要求7所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，内标物为呋塞米；优选地，空白生物基质为健康人全血经EDTA-K2抗凝的血浆或全血，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得；优选地，待测血浆为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血经EDTA-K2抗凝，分离后取血浆，于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得；优选地，待测全血为服用吲哒帕胺制剂后的人的全血，经EDTA-K2抗凝后于-80℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
9.根据权利要求7或8所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，待测血浆溶液的配制方法为：取待测血浆100μL于2mL离心管中，加入200μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得；优选地，待测全血溶液的配制方法为：取待测全血100μL于2mL离心管中，加入100μL水，涡旋30s，加入400μL内标工作溶液，涡旋30s，14000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，加100μL水混匀即得。
10.根据权利要求9所述吲哒帕胺血药浓度定量分析方法，其特征在于，内标工作液的浓度为25ng/mL。
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