CN109932458A - 一种检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱‑串联质谱方法，属于兽药残留检测分析领域，包括样品前处理方法和液相色谱‑串联质谱方法。本方法采用固相萃取小柱净化的方法，缩短了组织样品的提取时间，有机试剂的使用量减少，该方法操作简单，回收率较高，成本较低，完善了安普霉素的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及兽药残留检测分析领域，特别是涉及样品前处理方法技术结合液相色谱-串联质谱直接测定肠内容物中的安普霉素浓度的分析方法的建立。
背景技术
安普霉素(Apramycin)属于新型的氨基糖苷类药物，其抗菌谱广，抗菌活性强，现在被临床广泛应用于预防和治疗沙门氏菌病和大肠杆菌。由于安普霉素难以穿透肠壁，一般情况下其口服制剂血药浓度较低，但是当治疗消化道感染性疾病时，虽然药物在血清中游离浓度较低，但经口服后可直接抵达靶组织，因此对消化道细菌有较强的抗菌作用，所以分析靶组织的药动学数据对临床治疗的应用更有实际意义。
目前大多都是对血浆中的安普霉素进行检测，肠内容物由于获取条件有限，前处理方法繁琐，还未有相关研究报道。常用的安普霉素检测方法有微生物分析法、高效液相色谱法等，传统的微生物分析法方法难以定量且灵敏度低。高效液相色谱法因为安普霉素没有紫外吸收的特性，必须进行衍生后才可以检测，由于衍生过程繁琐，样品前处理过程较复杂，限制了该方法的应用。本发明建立了一套完整的液相色谱-串联质谱的方法，测定猪回肠内容物中的安普霉素浓度，定量限可达0.05μg/mL，灵敏度较高，分析速度快，峰型也较好，本法具有操作简便、快速准确、重复性高等特点，适用于猪回肠内容物中的安普霉素浓度的检测。
发明内容
本发明的目的在于减少肠内容物样品的前处理时间和提高分析灵敏度，提供一种检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱方法，该方法操作简便快捷，灵敏度高，分析速度快，干扰少，重复性好。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：包括提取和纯化两个步骤，
提取：准确称取1g回肠内容物置于4mL离心管中，14000r/min离心5分钟，取400μL上清液加入400μL的4％的H3PO4溶液调节酸碱度。
纯化：取OasisHLB固相萃取小柱，依次用3-5mL的甲醇和3-5mL的水活化固相萃取柱，取备用液过柱，弃去流出液，用800μL5％甲醇水溶液进行淋洗，用50μL的乙腈：甲醇溶液进行洗脱，洗脱两次，合并洗脱液，洗脱液于30℃水浴下氮气吹干，用初始流动相1mL复溶，即得待测样品溶液；
(2)液相色谱-串联质谱检测
取待测样品溶液10μL进行液相色谱-串联质谱的检测，液相色谱条件是：检测仪器：超高效液相色谱串联三重四极杆质谱，质谱柱为WatersHILIC质谱柱，100mm×2.1mm(i.d,),粒径1.7μm；采用流动相进行梯度洗脱：A相为100mmol/L含0.1％甲酸的乙酸铵溶液，B相为乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃，梯度洗脱程序及各时间流动相体积比为表1所示，
表1流动相梯度方案
质谱条件为：离子化方式电喷雾电离，三重四极杆串联质谱；扫描方式：ESI+；检测模式：多反应监测模式(MRM)；气帘气：30L/min，雾化气：65L/min,辅助雾化气：60L/min，离子源温度：550℃，喷雾电压：5500V，离子信息见表2所示。
表2安普霉素多反应监测离子情况
进一步地，所述乙腈：甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1:1。
本发明公开了以下技术效果：
本发明建立了一种回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱的方法。
本方法采用固相萃取小柱净化的方法，缩短了组织样品的提取时间，有机试剂的使用量减少，该方法操作简单，回收率较高，成本较低。
本发明的意义在于提供了一种检测回肠内容物中安普霉素的检测方法，完善了安普霉素的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为猪肠内容物空白样品质谱图；
图2为添加定量限浓度(0.5μg/mL)的回肠内容物样品质谱图；
图3为安普霉素标准曲线；
图4为安普霉素工作曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)样品前处理：包括提取和纯化两个步骤，
提取：准确称取1g回肠内容物置于4mL离心管中，14000r/min离心5分钟，取400μL上清液加入400μL的4％的H3PO4溶液调节酸碱度。
纯化：取OasisHLB固相萃取小柱，依次用3-5mL的甲醇和3-5mL的水活化固相萃取柱，取备用液过柱，弃去流出液，用800μL5％甲醇水溶液进行淋洗，用50μL的体积比为1:1的乙腈：甲醇溶液进行洗脱，洗脱两次，合并洗脱液，洗脱液于30℃水浴下氮气吹干，用初始流动相1mL复溶，即得待测样品溶液；
(2)液相色谱-串联质谱检测
取待测样品溶液10μL进行液相色谱-串联质谱的检测，液相色谱条件是：检测仪器：超高效液相色谱串联三重四极杆质谱，质谱柱为WatersHILIC质谱柱，100mm×2.1mm(i.d,),粒径1.7μm；采用流动相进行梯度洗脱：A相为100mmol/L含0.1％甲酸的乙酸铵溶液，B相为乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃，梯度洗脱程序及各时间流动相体积比为表1所示，
表1流动相梯度方案
质谱条件为：离子化方式电喷雾电离，三重四极杆串联质谱；扫描方式：ESI+；检测模式：多反应监测模式(MRM)；气帘气：30L/min，雾化气：65L/min,辅助雾化气：60L/min，离子源温度：550℃，喷雾电压：5500V，离子信息见表2所示。
表2安普霉素多反应监测离子情况
(3)方法的考核参数及结果
特异性和专一性：图1为猪肠内容物空白样品质谱图，图2为添加定量限浓度(0.5μg/mL)的回肠内容物样品质谱图。出峰附近没有杂峰干扰，峰型尖锐，分离度好，可以满足分析要求。
灵敏度：取空白肠内容物，添加药物使肠内容物中的药物浓度为0.05、0.1和0.2μg/mL，按照样品前处理方法处理样品上样检测，每个浓度设置5个重复。当信噪比(S/N)大于等于3时对应浓度为最低检测限，当信噪比(S/N)大于等于10时对应浓度为最低定量限，S/N为3时所确定的检测限为0.02μg/mL，S/N为10时确定的定量限为0.05μg/mL。
标准曲线：取适量安普霉素标准储备液，用流动相依次稀释成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.5、2、4、6、25μg/mL的标准工作液，用液相色谱-串联质谱检测。每种浓度每天重复测定5次，重复操作5天。将所得峰面积均值与对应浓度作线性回归，绘制标准曲线并得到线性回归方程和相关系数。如图3所示，标准曲线方程为y＝10.79532x+41.231，在0.5μg/mL–25μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R为0.9963。
工作曲线：取0.5g回肠内容物，加入适宜浓度的标准溶液，使各样品中药物浓度达到0.05、0.1、1、5、25μg/mL，按照样品前处理方法进行处理，液相色谱-串联质谱检测。将所得峰面积均值与对应浓度作线性回归，计算回肠内容物中工作曲线的回归方程和相关系数。如图4所示，工作曲线方程为y＝10.79532x+41.23098，在0.5μg/mL–25μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R为0.99628。
准确度和精密度：在0.5g回肠内容物中加入适宜浓度的安普霉素标准溶液，使药物浓度达到0.05、0.1和5μg/mL覆盖定量范围的高、中、低三个浓度，按样品处理方法制备样品后供液相色谱-串联质谱检测。同一天内每个浓度重复5次，取平均值，计算日内变异系数；每个浓度重复5天，计算日间变异系数。
安普霉素在回肠内容物中的回收率和精密度见表3。在空白内容物中添加0.05μg/mL，0.1μg/mL，0.2μg/mL的安普霉素时其回收率在87.9％～90.4％，日间相对标准偏差在4.3％～5.8％，符合国家标准对分析方法精密度和准确度的要求。
表3安普霉素在回肠内容物中的回收率和日间相对标准偏差
以上实验结果表明：本发明所建方法成功应用于肠内容物中安普霉素的测定，回收率和变异系数均能满足国家标准对分析方法精密度和准确的要求，灵敏度高，操作简便，实验时间短，能较好的提高工作效率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：包括提取和纯化两个步骤，
提取：准确称取1g回肠内容物置于4mL离心管中，14000r/min离心5分钟，取400μL上清液加入400μL的4％的H3PO4溶液调节酸碱度。
纯化：取Oasis HLB固相萃取小柱，依次用3-5mL的甲醇和3-5mL的水活化固相萃取柱，取备用液过柱，弃去流出液，用800μL 5％甲醇水溶液进行淋洗，用50μL的乙腈：甲醇溶液进行洗脱，洗脱两次，合并洗脱液，洗脱液于30℃水浴下氮气吹干，用初始流动相1mL复溶，即得待测样品溶液；
(2)液相色谱-串联质谱检测
取待测样品溶液10μL进行液相色谱-串联质谱的检测，液相色谱条件是：检测仪器：超高效液相色谱串联三重四极杆质谱，质谱柱为Waters HILIC质谱柱，100mm×2.1mm(i.d,),粒径1.7μm；采用流动相进行梯度洗脱：A相为100mmol/L含0.1％甲酸的乙酸铵溶液，B相为乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃，梯度洗脱程序及各时间流动相体积比为表1所示，
表1流动相梯度方案
质谱条件为：离子化方式电喷雾电离，三重四极杆串联质谱；扫描方式：ESI+；检测模式：多反应监测模式；气帘气：30L/min，雾化气：65L/min,辅助雾化气：60L/min，离子源温度：550℃，喷雾电压：5500V，离子信息见表2所示。
表2安普霉素多反应监测离子情况
2.根据权利要求1所述的检测猪回肠内容物中安普霉素的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于，所述乙腈：甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1:1。
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