CN115326960B - 一种同时检测人血浆中8种抗癫痫药物及1种活性代谢物浓度的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测人血浆中8种抗癫痫药物及1种活性代谢物浓度的分析方法，具体涉及左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉考沙胺、奥卡西平、托吡酯、卡马西平、丙戊酸钠、吡仑帕奈以及奥卡西平的活性代谢物10，11‑二氢‑10‑羟基卡马西平。本检测方法仅需100μL血浆样品，采用乙腈进行蛋白沉淀处理后，采用高效液相色谱串联质谱(HPLC‑MS/MS)多反应监测和正、负离子模式扫描分析进行定量检测。本发明的检测方法，样品前处理快速简便，8种抗癫痫药物及1种活性代谢物在各自线性范围内线性关系良好，准确度和精密度良好，专属性强，稳定性高，符合生物样品的分析要求，满足常用抗癫痫药物在人血浆中的检测要求，适用于抗癫痫药物常规临床治疗药物监测。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种基于HPLC-MS/MS技术同时检测人血浆中8种抗癫痫药物及1种活性代谢物浓度的分析方法，其中，8种抗癫痫药物分别为：1.左乙拉西坦；2.拉莫三嗪；3.拉考沙胺；4.奥卡西平；5.托吡酯；6.卡马西平；7.丙戊酸钠；8.吡仑帕奈；以及1种活性代谢物为10，11-二氢-10-单羟基卡马西平。
背景技术
癫痫是以脑神经元过度放电导致反复性、发作性和短暂性的中枢神经系统功能失常为主要特征的慢性脑部疾病，在儿童和青少年人群中发病率较高。癫痫治疗以药物为主，包括如丙戊酸钠、卡马西平在内的传统抗癫痫药物，以及奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、托吡酯、吡仑帕奈等的新型抗癫痫药物。多数抗癫痫药物的药动学存在明显个体差异，不同患者在给药后血药浓度差异较大；同时，部分抗癫痫药物间或抗癫痫药物与其他药物间存在相互作用，也会对血药浓度和疗效产生明显的影响，因此，通过治疗药物监测患者体内的抗癫痫药物血药浓度，可以为抗癫痫药物的个体化给药方案提供重要帮助和指导意义。
目前用于定量人血浆中抗癫痫药物浓度的方法包括紫外分光光度法、高效液相色谱法等。这些方法存在前处理步骤复杂耗时、定性不够准确、定量不够灵敏等问题。高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术越来越广泛应用于药物、食品、环境、临床检测等多个领域。HPLC-MS/MS具有灵敏度和准确度高，选择性和特异性强等特点，在应用于临床检测时，HPLC-MS/MS的检测能力优于高效液相色谱法等。因此，提供一种灵敏度高，且可以同时检测多种抗癫痫药物的HPLC-MS/MS分析方法，对癫痫患者的临床合理用药的指导和帮助具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种同时检测人血浆中8种抗癫痫药物和1种活性代谢物浓度的分析方法；本发明的检测方法，样品前处理快速、便捷，检测方法灵敏度和准确度高，适用于临床常规检测抗癫痫药物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种同时检测人血浆中8种抗癫痫药物和1种活性代谢物浓度的分析方法，所述8种抗癫痫药物为左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉考沙胺、奥卡西平、托吡酯、卡马西平、丙戊酸钠、吡仑帕奈，所述1种活性代谢物为10，11-二氢-10-羟基卡马西平，内标物分别为左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、托吡酯-氘12、吡仑帕奈-氘5和异丙嗪；
包括如下步骤：
采用HPLC-MS/MS检测经过前处理的血浆样品中的8种抗癫痫药物和1种活性代谢物浓度，通过液相色谱将8种抗癫痫药物和1种活性代谢物与血浆样品基质分离，利用内标物进行内标法定量，以待测物峰面积与相应内标物峰面积之比为纵坐标，以标准曲线血浆样品中待测物的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算血浆中8种抗癫痫药物和1种活性代谢物的浓度。
进一步地，所述高效液相串联质谱的液相色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱，3.5-5μm，2.1×100mm；
流速：0.2-0.4mL/min；
流动相：流动相A为含0.1-1％甲酸和2-10mM乙酸铵的水溶液；流动相B为含0.1-1％甲酸的乙腈溶液；
柱温：30-40℃；
采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱；
进样量：2-5μL；
所述梯度洗脱过程如下：流动相A和流动相B的体积比保持95:5，持续1或2min；流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至50:50，该过程可持续2-6min；流动相A和流动相B的体积比保持50:50，持续2-4min；流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速渐变至95:5，该过程可持续0.1-2min；流动相A和流动相B的体积比保持95:5，持续1或2min；每个样品采集时间为6.1-16分钟。
进一步地，所述高效液相串联质谱的质谱条件为：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测，和正、负离子模式扫描；正离子模式下，左乙拉西坦的离子对m/z 171→126，左乙拉西坦-氘6的离子对m/z 177→74，拉莫三嗪的离子对m/z 256→145、拉莫三嗪-13C3的离子对m/z 259→145、拉考沙胺的离子对m/z251→108、奥卡西平的离子对m/z 253→180、卡马西平离子对m/z 237→194、吡仑帕奈的离子对m/z 350→219，吡仑帕奈-氘5内标的离子对m/z 355→220，10，11-二氢-10-羟基卡马西平离子对m/z 255→237，以及异丙嗪的离子对m/z 285→198。扫描时间为100ms，毛细管电压为5500V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15psi；第二离子源气体为15psi；气帘气为15psi；
负离子模式包含：托吡酯、托吡酯-氘12和丙戊酸钠；托吡酯的离子对为338→78、托吡酯-氘12的离子对为350→78，丙戊酸钠的离子对为143→143，扫描时间为100ms，毛细管电压为-4500V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15psi；第二离子源气体为15psi；气帘气为20psi。
进一步地，血浆样品前处理的步骤按照以下方法进行：
取血浆样品100μL于1.5mL离心管中，向其中加入400-900μL乙腈和1.5-3μL混合内标工作液，涡旋2min后，在4℃，14000rpm离心15min，取上清液，待进样分析。
进一步地，所述混合内标工作液按照以下方法制备：精密称取左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、吡仑帕奈-氘5、托吡酯-氘12和异丙嗪，于5mL离心管中，加入乙腈溶液使标准品溶解制得浓度为1mg/mL的储备液；取适量上述储备液，配制成含1000ng/mL的左乙拉西坦-氘6、含500ng/mL的拉莫三嗪-13C3、含200ng/mL的吡仑帕奈-氘5、含1000ng/mL的托吡酯-氘12和含200ng/mL的异丙嗪的混合内标工作液，存于-20℃冰箱储存备用。
进一步地，所述标准曲线血浆样品按照以下方法制备：使用乙腈稀释抗癫痫药物和活性代谢物储备液，配制多个浓度的标准曲线工作液和质控工作液，取100μL标准曲线工作液和质控工作液，加入400μL空白血浆基质混合，制成标准曲线血浆样品和质控血浆样品，其中左乙拉西坦的标准曲线浓度为40，100，200，1000，5000，10000，20000ng/mL，拉莫三嗪的标准曲线浓度为4，10，20，100，500，1000，2000ng/mL，拉考沙胺的标准曲线浓度为20，50，100，500，2500，5000，10000ng/mL，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准曲线浓度为200，500，1000，5000，25000，50000，100000ng/mL，奥卡西平的标准曲线浓度为5，12.5，25，125，625，1250，2500ng/mL，托吡酯的标准曲线浓度为40，100，200，1000，5000，10000，20000ng/mL，卡马西平的标准曲线浓度为20，50，100，500，2500，5000，10000ng/mL，丙戊酸钠的标准曲线浓度为2，5，10，50，250，500，1000μg/mL，吡仑帕奈的标准曲线浓度为2，5，10，50，250，500，1000ng/mL；用抗癫痫药物、活性代谢物和相应的内标的峰面积比为Y轴，标准曲线血浆样品的浓度为X轴，绘制标准曲线，得到相应的线性回归方程。
进一步地，所述空白血浆为不含抗癫痫药物及活性代谢物的空白血浆。
进一步地，相应的内标如下：左乙拉西坦的内标为左乙拉西坦-氘6，拉莫三嗪的内标为拉莫三嗪13C3，托吡酯、丙戊酸钠的内标为托吡酯-氘12，吡仑帕奈的内标为吡仑帕奈-氘5，拉考沙胺、10，11-二氢-10-羟基卡马西平、奥卡西平、卡马西平的内标为异丙嗪。
与现有技术相比，本发明存在以下技术效果：
采用本发明提供的检测方法可以简单、便捷、准确和灵敏地检测人血浆中8种抗癫痫药物和1种活性代谢物浓度。本发明的定量下限低，检测范围宽，且灵敏度高。相关系数(r2)大于0.99，三种质控浓度下和LLOQ的准确度偏差＜14.4％，批内批间精密度RSD在LLOQ＜19.8％，在三种质控样品浓度下＜14.6％，回收率为88.4-113％，RSD在4.33-14.9％。
样品在室温放置24小时，-20℃放置180天，以及反复冻融3次均保持稳定。因此，本方法的专属性、精密度、准确度、线性和稳定性等均符合生物样品的分析要求，灵敏度高，可以用于临床抗癫痫药物及其活性代谢物的治疗药物监测。
附图说明
图1为本发明实施例中空白血浆的典型色谱图(TIC，总离子流图；POS，正离子模式；NEG，负离子模式)；
图2为本发明实施例中空白血浆加入8种抗癫痫药物，1种活性代谢物及其内标物标准品的典型色谱图(CBZ，卡马西平；LCS，拉考沙胺；LEV，左乙拉西坦；LTG，拉莫三嗪；MHD，10，11-二氢-10-单羟基卡马西平；OXC，奥卡西平；TPM，托吡酯；PER，吡仑帕奈；PMZ，异丙嗪；VPA，丙戊酸钠)；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
1.主要仪器
岛津HPLC系统，SCIEX QQQ 5500质谱系统，Analyst色谱工作站(Version1.7.1)，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(3.5μm,2.1×100mm)色谱柱；
低温高速冷冻离心机；
漩涡混合器；
分析天平；
冷柜(Thermo Fisher)；
Millipore超纯水装置(Direct Q,Millipore Ltd,Molsheim,France)
2.空白血浆、试剂和对照品
本发明所用空白血浆均来自于上海市血液中心；甲醇(HPLC级，Merck)、乙腈(HPLC级，Merck)、甲酸(HPLC级，Sigma-Aldrich)、水为超纯水，异丙醇(HPLC级，Merck)；左乙拉西坦(Toronto Research Chemicals，L331500)、左乙拉西坦-氘6(Toronto ResearchChemicals，L331503)；拉莫三嗪(Toronto Research Chemicals，L173250)；拉莫三嗪-13C3(Toronto Research Chemicals，L173252)；拉考沙胺(98％，Aladdin，L125374)；10,11-二氢-10-羟基卡马西平(Toronto Research Chemicals，D449135)；奥卡西平(≥98％，Aladdin，O104504)托吡酯(Toronto Research Chemicals，T540250)；托吡酯-氘12(Toronto Research Chemicals，T540252)；卡马西平(≥98％，Aladdin，D129539)；丙戊酸钠(98％，罗恩，R050216)；吡仑帕奈(TLC，P181001)、吡仑帕奈-氘5(TLC，P181002)。
3.色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(3.5μm，2.1×100mm)；
流速：0.4mL/min；
柱温：40℃；
流动相：流动相A为含0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；
采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱。梯度洗脱过程如表1，每个样品采集时间为16分钟，进样体积为3μL。
表1流动相梯度洗脱条件
4.质谱条件
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测和正负离子模式扫描；8种抗癫痫药物和1种活性代谢物及其内标物的相应质谱参数见表2。正离子模式参数为：质谱扫描时间为100ms，毛细管电压为5500V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15psi；第二离子源气体为15psi；气帘气为15psi。负离子模式参数为：扫描时间为100ms，毛细管电压为-4500V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15psi；第二离子源气体为15psi；气帘气为20psi。
表2 8种抗癫痫药物和1种活性代谢物及其内标物的质谱参数
【实施例1】实验过程
本实施例提供了对照品储备液、标准曲线血浆样本和质控血浆样本、混合内标工作液的配制方法以及血浆样品前处理的方法：
1.对照品储备液的配制
(1)待测物储备液的配制：
精密称取左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉考沙胺、奥卡西平、托吡酯、卡马西平、丙戊酸钠、吡仑帕奈和10，11-二氢-10-羟基卡马西平，加入乙腈溶液使标准品溶解制得浓度为1mg/mL的储备液，见表3；
表3 9种待测物储备液的配制
(2)内标物储备液的配制：
精密称取左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、吡仑帕奈-氘5、托吡酯-氘12和异丙嗪，于5mL离心管中，加入乙腈溶液使标准品溶解制得浓度为1mg/mL的储备液，见表4；
表4 5种内标物储备液的配制
2.标准曲线血浆样本和质控血浆样本的配制：
使用乙腈稀释上述抗癫痫药物储备液，配制成含100000ng/mL的左乙拉西坦、含10000ng/mL的拉莫三嗪、含50000ng/mL的拉考沙胺、含500000ng/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平、含12500ng/mL的奥卡西平、含100000ng/mL的托吡酯、含50000ng/mL的卡马西平、含5mg/mL的丙戊酸钠，和含5000ng/mL的吡仑帕奈的混合工作液，将混合混合工作液梯度稀释为7个浓度工作液SW1-SW7和低中高3个浓度的质控工作液，见表5，存于-20℃冰箱储存备用。
将标准曲线工作液SW1-SW7和质控工作液各取100μL，加入400μL空白血浆混合，制成标准曲线血浆样品和质控血浆样品，标准曲线血浆样品线性范围和质控血浆样品浓度见表5。
表5标准曲线血浆样品线性范围和质控血浆样品浓度
3.混合内标工作液的配制：
取适量上述内标储备液，配制成含1000ng/mL的左乙拉西坦-氘6、含500ng/mL的拉莫三嗪-13C3、含200ng/mL的吡仑帕奈-氘5、含1000ng/mL的托吡酯-氘12和含200ng/mL的异丙嗪的混合内标工作液，存于-20℃冰箱储存备用。
4.血浆样品的前处理：
取血浆样品100μL于1.5mL离心管中(空白样品和内标空白样品取100μL空白血浆)，向其中加入400μL乙腈和1.5μL混合内标工作液(空白样品加入1.5μL乙腈替代)，涡旋2min后，在4℃，14000rpm离心15min，取上清液，待LC-MS/MS进样分析。
【实施例2】方法学验证
1.线性
以待测物(8种抗癫痫药物和1种活性代谢物)和相应内标物的峰面积比值为纵坐标，对标准曲线血浆样品中的待测物浓度(x,ng/mL)作线性回归方程。回归方程的相关系数r大于0.99，参见表6所示，抗癫痫药物和活性代谢物在各自线性范围内线性良好，满足定量要求。
表6抗癫痫药物的线性范围，线性系数和线性方程
2.专属性
取空白血浆(不含任何对照品和内标)100μL按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法进行前处理后测定，将空白血浆的色谱图与加标空白血浆进行对比，参见图1-图2，确认空白血浆中无内源性杂质的干扰。
3.准确度和精密度
按质控血浆样本制备方法配制5批次质控血浆样品，分别取LLOQ，LQC、MQC、HQC质控血浆样本100μL于1.5mL离心管中，按照实施例2中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，结果计算平均值、标准差和相对标准差。
结果显示：抗癫痫药物在三种质控浓度下和LLOQ的准确度偏差＜14.4％，批内批间精密度RSD在LLOQ＜19.8％，在三种质控样品浓度下＜14.6％，见表7。结果表明：该方法的精密度和准确度良好，符合分析要求。
表7抗癫痫药物的批内和批间准确度和精密度
4.提取回收率
分别取LQC、MQC、HQC质控血浆样本，按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法进行前处理后测定，另取相应浓度的标准工作溶液进样测定。以血样处理后的药物峰面积与相应浓度对照品溶液进样的药物峰面积的比值计算提取回收率。参见下表8所示，抗癫痫药物各浓度的质控血浆样本的平均提取回收率在88.4-113％，RSD％＜14.9％。
表8 8种抗癫痫药物和1种活性代谢物的回收率(n＝5)
5.稳定性
(1)室温稳定性实验
取质控血浆样本LQC和HQC于室温放置24小时，按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，各浓度的质控血浆样本在室温放置24小时后测定与即时测定的结果相比，偏差＜14.9％，见表9。
(2)冻融实验
取质控血浆样本LQC和HQC于-20℃放置，24小时后常温下使其融化，该过程重复3次，按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，与即时测定结果相比较。结果显示偏差＜14.5％，见表9。
(3)长期稳定性实验
取质控血浆样本LQC和HQC，在-20℃中放置180天后，按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法对质控血浆样本进行前处理后测定，各浓度的质控血浆样本测定与即时测定的结果相比，偏差＜13.5％，见表9。
表9抗癫痫药物的稳定性
6.基质效应
取空白血浆样本，按照实施例1中血浆样品前处理和测定的方法对空白血浆样本进行前处理后得空白血浆基质，以该基质配制为低中高质控样品的样本，和相应浓度的以流动相配制的对照品溶液，同时测定。结果显示基质效应符合要求。见表10。
表10抗癫痫药物的基质效应
综上所述，本发明提供了采用HPLC-MS/MS技术检测人血浆中的8种抗癫痫药物和1种活性代谢物浓度的方法，其专属性、精密度、准确度、线性、稳定性、回收率和基质效应等均符合生物样品的分析要求，该方法灵敏度高，前处理方法简单、便捷、成本低廉，可以用于临床抗癫痫药物的治疗药物监测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种同时检测人血浆中8种抗癫痫药物及1种活性代谢物浓度的分析方法，其特征在于，所述抗癫痫药物为左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉考沙胺、奥卡西平、托吡酯、卡马西平、丙戊酸钠、吡仑帕奈，所述活性代谢物为10，11-二氢-10-羟基卡马西平，内标物分别为左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、托吡酯-氘12、吡仑帕奈-氘5和异丙嗪；
包括如下步骤：
采用HPLC-MS/MS检测经过前处理的血浆样品中的抗癫痫药物浓度和活性代谢物浓度，通过液相色谱将抗癫痫药物和活性代谢物与血浆样品基质分离，利用稳定同位素内标物和异丙嗪进行内标法定量，以抗癫痫药物、活性代谢物峰面积与相应内标物峰面积之比为纵坐标，以标准曲线血浆样品中抗癫痫药物、活性代谢物的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算血浆中抗癫痫药物和活性代谢物的浓度；
其中，液相色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱，3.5-5 μm，2.1 × 100 mm；
流速：0.2-0.4 mL/min；
流动相：流动相A为含0.1-1%甲酸和2-10 mM乙酸铵的水溶液；流动相B为含0.1-1%甲酸的乙腈溶液；
柱温：30-40℃；
采用流动相A和流动相B不同体积混合，进行梯度洗脱；
进样量：2-5 μL；
所述梯度洗脱过程如下：流动相A和流动相B的体积比保持95:5，持续1或2 min；流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至50:50，该过程可持续2-6 min；流动相A和流动相B的体积比保持50:50，持续2-4 min；流动相A和流动相B的体积比由50:50匀速渐变至95:5，该过程可持续0.1-2 min；流动相A和流动相B的体积比保持95:5，持续1或2 min；每个样品采集时间为6.1-16分钟。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，质谱条件包括：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测，和正负离子模式扫描；正离子模式包含：左乙拉西坦、左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪、拉莫三嗪-13C3、拉考沙胺、奥卡西平、卡马西平、吡仑帕奈、吡仑帕奈-氘5、10，11-二氢-10-羟基卡马西平以及异丙嗪；左乙拉西坦的离子对m/z 171→126，左乙拉西坦-氘6的离子对m/z 177→74，拉莫三嗪的离子对m/z 256→145、拉莫三嗪-13C3的离子对m/z 259→145、拉考沙胺的离子对m/z 251→108、奥卡西平的离子对m/z 253→180、卡马西平离子对m/z 237→194、吡仑帕奈的离子对m/z 350→219，吡仑帕奈-氘5内标的离子对m/z355→220，10，11-二氢-10-羟基卡马西平离子对m/z 255→237，以及异丙嗪的离子对m/z285→198；扫描时间为100 ms，毛细管电压为5500 V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15 psi；第二离子源气体为15 psi；气帘气为15 psi；
负离子模式包含：托吡酯、托吡酯-氘12和丙戊酸钠；托吡酯的离子对为338→78、托吡酯-氘12的离子对为350→78，丙戊酸钠的离子对为143→143，扫描时间为100 ms，毛细管电压为-4500 V；离子源温度为550℃；第一离子源气体为15 psi；第二离子源气体为15 psi；气帘气为20 psi。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，人血浆的前处理具体步骤为：
取血浆样品100 μL于1.5 mL离心管中，向其中加入400-900 μL乙腈和1.5-3 μL混合内标工作液，涡旋2 min后，在4℃，14000 rpm下离心15 min，取上清液，待进样分析。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述混合内标工作液中为左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、吡仑帕奈-氘5、托吡酯-氘12和异丙嗪。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述混合内标工作液按照以下方法制备：精密称取左乙拉西坦-氘6、拉莫三嗪-13C3、吡仑帕奈-氘5、托吡酯-氘12和异丙嗪，于5mL离心管中，加入乙腈溶液使标准品溶解制得浓度为1 mg/mL的储备液；取适量所述储备液，配制成含1000 ng/mL的左乙拉西坦-氘6、含500 ng/mL的拉莫三嗪-13C3、含200 ng/mL的吡仑帕奈-氘5、含1000 ng/mL的托吡酯-氘12和含200 ng/mL的异丙嗪的混合内标工作液，存于-20℃冰箱储存备用。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述标准曲线血浆样品按照以下方法制备：使用乙腈稀释抗癫痫药物储备液，配制成含100000 ng/mL的左乙拉西坦、含10000ng/mL的拉莫三嗪、含50000 ng/mL的拉考沙胺、含500000 ng/mL的10，11-二氢-10-羟基卡马西平、含12500 ng/mL的奥卡西平、含100000 ng/mL的托吡酯、含50000 ng/mL的卡马西平、含5 mg/mL的丙戊酸钠，和含5000 ng/mL的吡仑帕奈的混合工作液，存于-20℃冰箱储存备用；取混合工作液，梯度稀释为标准曲线工作液SW1-SW7，和质控工作液，取所述标准曲线工作液和质控工作液100 μL，与400 μL空白血浆基质混合，制成标准曲线血浆样品和质控血浆样品，其中左乙拉西坦的标准曲线浓度为40，100，200，1000，5000，10000，20000 ng/mL，拉莫三嗪的标准曲线浓度为4，10，20，100，500，1000，2000 ng/mL，拉考沙胺的标准曲线浓度为20，50，100，500，2500，5000，10000 ng/mL，10，11-二氢-10-羟基卡马西平的标准曲线浓度为200，500，1000，5000，25000，50000，100000 ng/mL，奥卡西平的标准曲线浓度为5，12.5，25，125，625，1250，2500 ng/mL，托吡酯的标准曲线浓度为40，100，200，1000，5000，10000，20000 ng/mL，卡马西平的标准曲线浓度为20，50，100，500，2500，5000，10000 ng/mL，丙戊酸钠的标准曲线浓度为2，5，10，50，250，500，1000 μg/mL，吡仑帕奈的标准曲线浓度为2，5，10，50，250，500，1000 ng/mL；用抗癫痫药物、活性代谢物及其相应的内标的峰面积比为Y轴，标准曲线血浆样品的浓度为X轴，绘制标准曲线，得到相应的线性回归方程。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述空白血浆为不含抗癫痫药物及活性代谢物的空白血浆。
8.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，左乙拉西坦的内标为左乙拉西坦-氘6，拉莫三嗪的内标为拉莫三嗪13C3，托吡酯、丙戊酸钠的内标为托吡酯-氘12，吡仑帕奈的内标为吡仑帕奈-氘5，拉考沙胺、10，11-二氢-10-羟基卡马西平、奥卡西平、卡马西平的内标为异丙嗪。
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