CN107328871B - Uplc-ms/ms联用检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度 - Google Patents
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Abstract
本文涉及UPLC‑MS/MS联用检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度。本文提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度的方法，其中所述方法采用含甲酸的甲酸铵水‑甲酸乙腈作为流动相进行。本发明的方法的特异性好、灵敏度高，血浆样品中奥希替尼在2～500ng·ml‑1和脑脊液样品中0.5～20ng·ml‑1范围内线性较好，已经应用于临床药代动力学样本的检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测药物浓度的方法。具体而言，本发明涉及通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆和/或脑脊液中奥希替尼(AZD9291)的药物浓度的方法。
背景技术
引言
肺癌作为全球范围发病率和死亡率最高的肿瘤之一，每年有180万的新发病例以及150万的死亡病例[1]。在肺癌患者疾病进展中，有约40％-50％的患者进展到脑转移。脑转移转移包括了脑实质转移和脑膜转移。有脑转移的肺癌患者通常有更差的生存质量，影响了患者的总生存时间[2]。
表皮生长因子受体广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。大量的临床试验证实吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和埃克替尼等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在PFS、生活质量以及耐受性方面与传统化疗相比均具有显著优势，奠定了EGFR-TKI在EGFR基因敏感突变阳性晚期NSCLC治疗中的地位[3-5]。EGFR基因敏感突变的发生率具有明显的种族差异，高加索晚期肺腺癌患者只有17％，而我国患者却高达50.2％[6]，意味着我国有更多的患者可以接受EGFR-TKI治疗。同时，研究结果也表明一代和二代的EGFR-TKI的治疗脑转移的患者中取得了很好的疗效[7]。然而，EGFR-TKI治疗过程中的耐药是普遍存在的问题，T790M突变是发生耐药最主要的原因。奥希替尼(AZD9291)是一种新型的三代的EGFR-TKI药物，用于治疗EGFR T790M突变的非小细胞肺癌患者[8]。奥希替尼(AZD9291)的结构不同于所有其它目前已经批准用于临床的EGFR-TKIs。最近的研究也证实了其在脑转移患者中的疗效。在AUR3的临床试验中，144例具有脑转移的患者，接受奥西他滨的患者的无疾病进展生存期的中位时间要长于接受铂类加培美曲塞治疗的患者[9]。
检测血液或其他生物样本中的药物浓度是药动学、药效学研究和临床治疗的基础。用于检测血浆药物浓度的方法应当具备高灵敏度、能够快速获得结果和能够使用少量样品进行。然而，由于血液中存在包括磷脂、蛋白等多种组份，检测易受基质效应等各种因素的影响。如何最大可能减少基质效应，尽可能获得血液中药物的准确浓度，是本领域必须进行深入研究的课题。
HPLC法是目前检测血药浓度常用的方法，应用范围广泛。但是，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低，并不适用于高通量的生物样品分析。
超高效液相色谱质谱联用(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC-MS/MS)法提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。然而，UPLC-MS/MS对流动相，色谱柱，样品前处理，质谱接口，数据采集系统都提出了特别的要求。尽管对转换方法进行了一些研究，传统的高效液相色谱HPLC的条件不能直接应用于UPLC-MS/MS，需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择、质谱条件设置等各项条件进行大量试验，才能实现UPLC-MS/MS快速检测分析。例如，周新等人的研究(HPLC与UPLC色谱条件转换方法研究，分析试验室，第27卷第4期，2008年4月)表明直接将HPLC条件应用于UPLC，不能达到对待测物质分离分析的目的；而且质谱检测与色谱检测不同，对于流动相组成、流速等多种方面需要额外的注意，因此对实验条件包括例如流动相选择等进行具体深入研究才能获得分离状况良好的UPLC-MS/MS方法。
目前，一些采用液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem massspectrometry，LC-MS/MS)技术测定血浆样本中奥希替尼的方法有报道。到目前为止，只有两篇测定了人血浆的浓度，且使用的样本前处理方法为盐析液液萃取法[11-12]，并且没有测定在人脑脊液中奥希替尼浓度的方法学报道。本研究旨在建立灵敏、快捷的超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)方法检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度，为奥希替尼的临床药代动力学研究提供支持。
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发明内容
发明人已经建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱(ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)技术检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度的方法。本发明的方法具有的优点包括例如样本处理简单、快捷、灵敏度高、回收率高、基质效应小等。
在一些实施方案中，本发明提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的浓度的方法，其中所述方法可以采用含甲酸的甲酸铵水-甲酸乙腈作为流动相进行。在一些实施方案中，本发明的方法也可以采用甲醇作为流动相进行。发明人已经发现使用甲醇作为流动相可获得更好的响应，但是基线噪音也相应增高，而且目标化合物的信号较高，存在较为严重的残留。在一些实施方案中，本发明的方法也可以采用乙腈和异丙醇(例如体积比在30/70～70/30范围，或体积比在40/60～60/40范围，或体积比为50/50)作为洗脱液。已经发现采用乙腈和异丙醇作为强洗脱液改善了残留问题。在一些实施方案中，本发明的流动相中可以加入甲酸(例如浓度范围为0.05％-1％，浓度范围为0.1％-0.9％，浓度范围为0.15％-0.8％，浓度范围为0.2％-0.7％，浓度范围为0.3％-0.6％，浓度为0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等)。已经发现在流动相中加入甲酸，能够改善残留，获得良好的峰形。在一些实施方案中，本发明的方法可以采用含甲酸的甲酸铵水-甲酸乙腈作为流动相进行分析时。已经发现采用含甲酸的甲酸铵水-甲酸乙腈作为流动相时，洗脱能够快速、充分分离待测物质，获得良好的峰形。在一些实施方案中，已经显示在作为流动相的乙腈中加入甲酸，能够改善残留，获得良好的峰形。在一些实施方案中，已经显示采用含甲酸的甲酸乙腈作为流动相获得了降低的基线噪音，减少了残留。
在一些实施方案中，本发明的方法采用的含甲酸的甲酸铵水-甲酸乙腈流动相的体积比选自以下范围：含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(95/5，v/v)-含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(5/95，v/v)，含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)，含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(50/50，v/v)。在一些实施方案中，本发明的方法采用洗脱梯度进行。在一些实施方案中，本发明的方法采用洗脱梯度包括含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)作为流动相进行。在一些实施方案中，本发明的流动相中的加入的甲酸的浓度范围可以为0.05％-1％，浓度范围可以为0.1％-0.9％，浓度范围可以为0.15％-0.8％，浓度范围可以为0.2％-0.7％，浓度范围可以为0.3％-0.6％，例如加入的甲酸的浓度为0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。在一些实施方案中，本发明的流动相中的甲酸铵水浓度范围可以为0.5-50mM，浓度范围可以为0.8-40mM，浓度范围可以为1-30mM，浓度范围可以为2-20mM，浓度范围可以为3-25mM，浓度范围可以为4-50mM，浓度范围可以为5-10mM，例如加入的甲酸铵水的浓度可以为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM等。
在一些实施方案中，本发明的方法中采用的流动相为0.1％甲酸10mM甲酸铵水-0.5％甲酸乙腈。在一些实施方案中，所述流动相采用上述体积比进行。在一些实施方案中，本发明的方法采用洗脱梯度包括含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸铵水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)作为流动相进行。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性，向流动相中加入改性剂等。已经观察到采用所述流动相进行洗脱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中，本发明的方法采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)作为分析柱进行。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。在本发明中，发明人发现ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)能够实现奥希替尼良好分离和峰型。因此，已经观察到采用ACQUITY UPLC BEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)作为分析柱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中，本发明的方法可以采用帕唑帕尼为内标进行。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。在一些实施方案中，发明人已经显示帕唑帕尼能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。
在一些实施方案中，本发明的方法采用蛋白沉淀法进行前处理。发明人已经发现通过液液萃取包括盐析液液萃取法进行样品前处理时，操作繁琐耗时，提取回收率低，并且检测的灵敏度电较低，不能满足临床药代动力学中大样本检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的浓度的要求。本发明的研究结果显示在本发明的条件下能够采用蛋白沉淀法进行样本前处理，并且获得令人惊讶的高回收率，从而可以避免繁琐耗时的液液萃取过程。在本发明中，可以通过例如甲醇或乙腈进行蛋白沉淀处理。优选地，在本发明的条件下可以采用乙腈进行蛋白沉淀。已经发现使用甲醇作为流动相可获得更好的响应，但是基线噪音也相应增高，而且目标化合物的信号较高，存在较为严重的残留。在一些实施方案中，本发明的方法能够获得提高的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达80％以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达85％以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达90％以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达95％以上的回收率。在一些实施方案中，本发明能够得令人吃惊的高达99％的提取回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得的提取率能够高达99％，并且能够获得高的灵敏度和避免基质效应。在一些实施方案中，待测人血浆和/或脑脊液样品通过蛋白沉淀法前处理后，通过纯化水进行稀释。在一些实施方案中，待测人血浆和/或脑脊液样品通过蛋白沉淀法前处理后，通过乙腈进行稀释。在一些实施方案中，待测人血浆和/或脑脊液样品通过蛋白沉淀法前处理后，通过乙腈水进行稀释。在一些实施方案中，待测人血浆和/或脑脊液样品通过蛋白沉淀法如乙腈蛋白沉淀法前处理后，通过乙腈水进行稀释进行稀释至接近流动相流动相比例的溶剂比例。在一些实施方案中，可以采用50％乙腈水进行稀释。在一些实施方案中，可以稀释至选自下述的溶剂比例：水∶乙腈(95/5，v/v)-水∶乙腈(5/95，v/v)或水∶乙腈(90/10，v/v)-水∶乙腈(10/90，v/v)。在一些实施方案中，还可以在稀释中加入甲酸以获得良好的峰形。在一些实施方案中，发明人发现蛋白沉淀后加入乙腈水进行稀释，优选接近流动相比例的溶剂比例，可以获得更好的峰形，并减小残留，尤其能够获得提高的灵敏度。
在一些实施方案中，本发明的方法具有可接受的基质效应。在一些实施方案中，本发明的方法具有降低的基质效应。
在一些实施方案中，本发明的方法具有提高的灵敏度。在一些实施方案中，本发明的方法中，血浆样品中奥希替尼在2～500ng·ml-1和脑脊液样品中0.5～20ng·ml-1范围内线性较好。
在一些实施方案中，本发明的方法中所述流动相采用0.1-0.8ml/min的流速进行，优选采用0.2-0.50ml/min的流速进行。
在一些实施方案中，本发明的方法可以采用梯度洗脱或等度洗脱进行。在一些实施方案中，本发明的方法通过梯度洗脱进行。在一些实施方案中，本发明的方法通过流动相为A：0.1％甲酸10mM甲酸铵水；B：0.5％甲酸乙腈，洗脱梯度为：0-1.0min，90％A，1.0-3.0min，90％B，3.0min-3.5min。
在一些实施方案中，血浆样品前处理采用乙腈蛋白沉淀，经乙腈水进一步稀释后用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱，通过0.1％甲酸10mM甲酸铵水；B：0.5％甲酸乙腈为流动相进行分离。
本发明的方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证，所述方法已经成功应用于临床药代动力学样本的检测。
附图说明
图1：奥希替尼(左)和内标(右)的分子结构和二级质谱图。
图2：空白血浆、含内标的空白血浆和LLOQ样品的特征性色谱图。
图3：空白脑脊液、含内标的空白脑脊液和LLOQ样品的特征性色谱图。
具体实施方式
在本发明的方法中，可以考虑以下列优选的条件进行。所述方法包括以乙腈蛋白沉淀处理血浆和脑脊液的样品，液相条件选用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流动相为A：0.1％甲酸10mM甲酸铵水；B：0.5％甲酸乙腈，0.3mL·min-1梯度洗脱。质谱方法采用电喷雾电离，正离子多反应监测模式，监测离子对：奥希替尼m/z 500.38→71.88和内标帕唑帕尼m/z 438.21→357.18。发明人按照2015年《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行了方法学的考察，检测了受试者血浆和脑脊液中奥西替尼的药物浓度，初步验证方法的适用性。结果表面，血浆样品中奥希替尼在2～500ng·ml-1和脑脊液样品中0.5～20ng·ml-1范围内线性较好，r＞0.99，血浆和脑脊液样品批间和批内精密度范围分别为3.9％～9.3％和3.0％～9.7％，准确度范围分别为-13.4％～2％和-9.7％～3.1％；血浆奥希替尼和内标的相对提取回收率分别为102％，104％和101％，脑脊液中提取回收率为106％，95％和102％，基质效应可接受。血浆样品室温放置4h，4℃进样器放置12h均稳定。检测了受试者的血浆样品浓度为105.13±37.7ng/mL，脑脊液浓度为1.60±0.4ng/mL，血脑屏障渗透率为1.47±0.3％。发明人已经证明本研究建立的奥希替尼检测方法灵敏度高、重复性好，可以满足奥希替尼治疗非小细胞肺癌患者血浆和脑脊液中药物浓度生物样品定量分析的要求。
材料与方法
1仪器与试剂
I-Class超高效液相色谱仪(美国waters公司)；Xevo TQ-S mirco三重四级杆质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾离子源(ESI)；ACQUITY UPLCBEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；赛多利斯BT 25S十万分之一电子分析天平(德国)；
奥希替尼(纯度99％)和内标帕唑帕尼(纯度98％)标准品从北京建强伟业科技公司购买，乙腈(美国Fhisher公司，HPLC级)，异丙醇(美国Fhisher公司，HPLC级)，甲酸(美国Fhisher公司，HPLC级)，甲酸铵(美国Sigma Fluka公司，HPLC级)；实验用水为MILLI-QDirect 8超纯水处理系统(美国密理博公司)所制纯化水。空白的EDTA-K2血浆样品来源于健康受试者，人工脑脊液(批号：59-7316，美国Harvard Apparatus公司)。
2液质条件
液相条件：ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱，柱温设为35℃，流动相为A：0.1％甲酸10mM甲酸铵水；B：0.5％甲酸乙腈，洗脱梯度为：0-1.0min，90％A，1.0-3.0min，90％B，3.0min-3.5min，90％A流速设为0.3ml·min-1，脑脊液检测时间为3.5min，血浆同样的洗脱条件洗脱3次，检测时间为7.5min，进样量为2μL。
质谱条件：选用电喷雾电离，正离子、MRM模式。奥希替尼和内标主要生成[M+H]+准分子离子峰，MRM监测的离子对分别为：500.38＞71.88，438.21＞357.18(二级质谱扫描图见图1)。奥希替尼的碰撞能(CE)为20V，内标的CE为30V，两种化合物的毛细管电压为1.03KV，锥孔电压34V，150℃离子源温度和350℃脱溶剂气温度。
图1显示了奥希替尼(左)和内标(右)的分子结构和二级质谱图。
3.标准品溶液的配制
分别称量奥希替尼两份，内标1份，根据标准品纯度和分子式计算出称得的标准品中奥希替尼和内标的含量，加入相应体积的DMSO，配置成浓度为500ug·mL-1的标准品和内标的储备液。
以乙腈将奥希替尼储备液，稀释为20，50，100，500，1000，2000and 5000ng/ml的血浆标准曲线工作液，及40，400和4000ng/ml的质控工作溶液。5，15，20，50，100和200ng/ml的脑脊液标准曲线工作液，及10，40和160ng/ml的质控工作溶液。同时，使用乙腈将内标储备液稀释为100ng/ml(脑脊液)和500ng/ml(血浆)两种浓度的工作溶液。
以上溶液均置于-20℃保存备用。
4样品的前处理
2.0mL Ep管中加入20μL内标工作液和10μL工作液，常温吹干，加入100μL空白血浆后涡旋混匀30s，12000rpm离心5min，再加入400μL乙腈涡旋混匀30s，12000rpm离心15min，吸取20μL上清液加入180μL50％乙腈水稀释(脑脊液)，吸取20μL上清液加入380μL 50％乙腈水稀释(血浆)涡旋30s，12000rpm离心5min，取90μL上清进样检测。
5方法学考察内容
根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
6.临床试验样本适用性实验
入选了1例非小细胞肺癌的女性患者，53岁，伴有脑膜转移，具有显示EGFR19号外显子突变。口服奥希替尼每天80mg一次。采集脑脊液和相应的配对的全血样本。静脉血和脑脊液采集后立即3000rpm，4℃离心10min，上层血浆和脑脊液分装后冻存于-80℃冰箱中。通过检测1例20mg·m2-1剂量组受试者血药浓度，初步验证检测方法的适用性。
结果与讨论
1特异性
以6个个体的空白血浆分别配制空白样品、含内标的空白样品以及低定量下限(Lower Limit Of Quantitation，LLOQ)浓度的样品。三种样品经前处理后进样检测获得谱图(特征性谱图如图2、图3)。如图所示，奥希替尼和内标的保留时间分别为：1.08和1.03min。在保留时间附近均未见有干扰峰，LLOQ浓度时信噪比均大于10。
图2显示了空白血浆、含内标的空白血浆和LLOQ样品的特征性色谱图。
图3显示了空白脑脊液、含内标的空白脑脊液和LLOQ样品的特征性色谱图。
2标准曲线
10μL标准曲线工作液加20μL内标工作液在2.0mL Ep管中，常温吹干，再加入100μL空白血浆，配置2，5，10，50，100，200and 500ng/ml的血浆标准曲线，及4，40和400ng/ml的质控溶液。0.5，1.5，2，5，10和20ng/ml的脑脊液标准曲线，及1，4和16ng/ml的质控溶液。考察三个批次的标准曲线，用1/x2加权线性回归计算标准曲线。奥希替尼2～500ng·mL-1和0.5～20g·mL-1范围线性良好，相关系数r均大于0.99。
3精密度和准确度
LLOQ、低、中、高质控浓度样品各5个，经处理后进样检测。通过测得浓度的相对标准偏差(RSD％)和准确度偏倚(Bias％)考察1个检测批内以及多个检测批间的精密度和准确度。奥希替尼3个浓度的批内和批间RSD％和Bias％均在15％以内，LLOQ浓度均在20％以内，方法定量的精密度和准确度较好，符合指导原则的要求(见表1)。
表1奥希替尼血浆和脑脊液批内和批间精密度和准确度
4基质效应和提取回收率
对照组(SET1)样品的制备：于2.0ml离心管中加入100uL纯水，再加入奥希替尼浓度分别为4ng/mL，400ng/mL(血浆)和1ng/ml，16ng/ml(脑脊液)的质控混合工作液10uL，以及内标溶液20uL，精密加入400ul乙腈，涡旋混匀，于12000rpm离心15min，吸取20μL上清液180μL50％乙腈水稀释(脑脊液)，加入380μL 50％乙腈水稀释(血浆)涡旋30s，12000rpm离心，5min，吸取90uL上清液加入到进样瓶中，取2uL进行LC-MS/MS分析。每浓度制备3份样品，记录色谱图，记录奥希替尼峰面积(A)，计算其平均值As，记录各组内标峰面积(B)，求其平均值(Bs)。
对照组(SET2)样品的制备：2.0ml的Ep管中精密加入100uL6个不同个体空白血浆和6个不同瓶装的人工脑脊液，加入400uL乙腈，涡旋振荡30s，于12000rpm离心15min，取全部上清于新的Ep管中，再加入10uL浓度为4ng/mL，400ng/mL(血浆)和1ng/ml，16ng/ml(脑脊液)质控样品，再精密加入内标溶液20uL，涡旋混匀后，吸取20μL上清液180μL 50％乙腈水稀释(脑脊液)，加入380μL 50％乙腈水稀释(血浆)涡旋30s，12000rpm离心，5min，吸取90uL上清液加入到进样瓶中，取2uL进行LC-MS/MS分析。记录色谱图，记录各浓度奥希替尼的峰面积Am，求其平均值Am′，记录所有浓度中的内标峰面积Bm，求其平均值Bm′。
实验组(SET3)样品的制备：按“血浆样品标准曲线”测定方法配制成血浆和脑脊液浓度分别为4ng/mL，400ng/mL和1ng/ml，16ng/ml的低、高两种不同浓度的血浆样本各6份，按“2.4血浆样品的处理”项下操作，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图。记录各浓度样品的奥希替尼的峰面积Ai，记录所有内标峰面积Bi，
将Ai、Bi和Am′、Bm′代入下式即可求得奥希替尼和内标的相对提取回收率(RR％)：
奥希替尼：RR％＝Ai/Am′×100％；
内标：RR％＝Bi/Bm′×100％；
将Am、Bm和As、Bs代入下式即可求得奥希替尼和内标基质因子(MF％)：
奥希替尼：MF％＝Am/As×100％；
M1：MF％＝Bm/Bs×100％；
待测物与内标的基质因子之比为内标归一化基质因子(MF’％)，6个个体内标归一化基质因子CV应小于15％。
表2奥希替尼和内标基质效应和提取回收率
5稳定性
5.1室温稳定性
低、高质控样品5份，避光置于室温4h，处理后进样检测，以新鲜配制的标准曲线进行定量，考察血浆样品的室温稳定性。
5.24℃稳定性
低、高质控各5份处理后置于4℃冰箱中12h，12h后以新鲜制备的标准曲线定量。奥希替尼在处理后溶液中进样器4℃放置12h稳定。
表3奥希替尼稳定性数据
6临床应用
入选了1例非小细胞肺癌的女性患者，53岁，伴有脑膜转移，具有显示EGFR19号外显子突变。口服奥希替尼每天80mg一次。于开始服药后第一周、第五周、第七周和第15周采集一次脑脊液和相应的配对的全血样本。共采集了4次脑脊液和全血样本。检测了患者的血浆和脑脊液的药物浓度，并计算了血脑屏障透过率，结果见表4，血浆中药物浓度为105.13±37.7ng/mL，脑脊液药物浓度为1.47±0.4ng/mL，脑脊液浓度比血浆浓度渗透率为1.47±0.3％.结果显示，脑脊液中的浓度低于血浆中的药物浓度。同时，显示血浆药物浓度和脑脊液中的药物浓度呈正相关。比较了一代的TKI药物厄洛替尼的血脑屏障透过率为2.0±0.5％[14]，吉非替尼的血脑屏障透过率为1.3±0.7％[15]，该例患者的渗透率居于两者之间，但是由于我们实验目前只纳入了1例患者，对于奥希替尼的血脑屏障透过率的研究，还需要扩大样本量进行验证。
表4血浆和脑脊液中的药物浓度
讨论
EGFR-TKI对于具有EGFR敏感突变的患者具有很好的疗效。但是一代和二代EGFR-TKI药物治疗过程中的耐药是普遍存在的问题，T790M突变是发生耐药最主要的原因。奥希替尼是一种新型的三代的EGFR-TKI药物，用于治疗EGFR T790M突变的非小细胞肺癌患者的治疗[8]。最近的研究也证实了其在脑转移患者中的疗效。在AUR3的临床试验中，144例具有脑转移的患者，接受奥西他滨的患者的无疾病进展生存期的中位时间要长于接受铂类加培美曲塞治疗的患者[9]。故建立奥希替尼血药浓度和脑脊液浓度的检测方法对于奥希替尼的临床研究具有重要意义。
在方法建立的过程中，标准品存在严重的残留，开始使用甲醇作为流动相可获得更好的响应，但是基线噪音也相应增高，而且目标化合物的信号较高，存在较为严重的残留。为了结果残留问题，研究者将强洗脱液改为了50％乙腈和异丙醇，并在其加入0.2％甲酸，残留有改善，标准曲线最高点后的空白样品残留峰面积高达LLOQ的1/3。同时由于色谱峰存在拖尾。替换为乙腈蛋白沉淀，并最终使用乙腈蛋白沉淀后加入50％乙腈水进行稀释，处理后样品的溶剂组成可以影响目标化合物的峰形和残留情况。接近流动相比例的溶剂比例，可以获得更好的峰形，并减小残留。
目前并未有关于人血浆和/或脑脊液中奥希替尼检测的方法报道，已有研究者使用了液相联用检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的检测，其使用的是盐析液液萃取的前处理方法，相较于本发明人开发的使用的蛋白沉淀的前处理方法，该方法样本处理简单、快捷，且具有良好的重复性，适合大通量的临床样品检测。并且目前没有人脑脊液中奥希替尼的检测方法的报道。
根据1例临床样本的实验结果，初步分析了奥希替尼的血脑屏障透过率，但是由于该方法只用于了1例患者的研究。对于奥希替尼的真正的血脑屏障透过率还需要再下一步的研究中，入组更多的患者进行验证。本研究首次建立的用UPLC-MS/MS检测人血浆和/或脑脊液和人脑脊液中奥希替尼方法，灵敏、稳定且重复性好，可较好的应用于奥希替尼的临床药代动力学研究生物样品的检测。
Claims (5)
1.通过超高效液相色谱串联质谱法测定人血浆或脑脊液中奥希替尼的浓度的方法，其中所述方法采用含浓度为0.1％-0.3％的甲酸的乙腈和异丙醇作为流动相进行，其中乙腈和异丙醇的体积比在40/60～60/40范围，其中待测人血浆或脑脊液样品通过蛋白沉淀法进行前处理，其中所述前处理为加入乙腈，涡旋、离心，吸取上清液，加入50％乙腈水稀释，再次涡旋、离心，取上清进样检测。
2.权利要求1所述的方法，其中流动相中甲酸的浓度为0.2％。
3.权利要求1所述的方法，其中流动相中乙腈和异丙醇的体积比为50/50。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用ACQUITY UPLC BEH C18,50mm×2.1mm,1.7μm作为分析柱进行。
5.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用帕唑帕尼为内标进行。
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