CN113325106B - 基于特征性肽段检测人血浆中特瑞普利单抗药物浓度的液相色谱串联质谱方法 - Google Patents

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Abstract

本文涉及基于特征性肽段检测人血浆中特瑞普利单抗药物浓度的液相色谱串联质谱方法。本文提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定特瑞普利单抗浓度的方法，其中所述方法采用ASGYTFTDYEMHWVR作为特征性肽段进行测定。本发明的方法简单、快捷，开发周期短，具有良好的重复性。

Description

基于特征性肽段检测人血浆中特瑞普利单抗药物浓度的液相 色谱串联质谱方法
技术领域
本发明涉及检测药物浓度的方法。具体而言，本发明涉及通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定特瑞普利单抗(Toripalimab) 的药物浓度的方法。
背景技术
引言
程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1，PD-1)及其配体(programmed cell death protein ligand-1，PD-L1)是一对免疫共刺激分子，PD-1主要表达于活化的T细胞表面，而肿瘤细胞通过表达其配体 PD-L1与PD-1结合进而抑制T细胞的激活，抑制机体的抗肿瘤免疫应答反应，实现免疫逃逸[1]。针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体药物能阻断PD-L1 与PD-1的结合，进而增强免疫细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞的免疫清除，该类药物在多种恶性肿瘤中已展示出较好的临床疗效反应和生存获益，目前已被FDA批准用于治疗多种类型的肿瘤。特瑞普利单抗 (Toripalimab或JS001)是上海君实生物医药科技股份有限公司研制开发的人源化抗PD-1单克隆抗体药物，已于2018年12月17日获得国家药品监督管理局有条件批准上市，用于治疗既往标准治疗失败的局部进展或转移性黑色素瘤[2]。JS001单药以及联合化疗或靶向药物治疗恶性肿瘤的多项临床试验正在进行中，但定量检测JS001的完整方法学文章尚未被报道，仅有几篇文章提及应用电化学发光免疫分析法(Electrical chemiluminescent immunoassay，ECLIA)对其检测[3-5]。但ECLIA法具有一定的局限性，如获得特异的抗原或抗体周期较长、样本稀释倍数较高、线性范围较窄(一般不到两个数量级)、精密度差、易受基质干扰、存在交叉反应等。
因此，本领域需要提供能够定量检测患者血浆中特瑞普利单抗的药物浓度的改善的方法。
[参考文献]
[1]Fife BT，Pauken KE.The role of the PD-1pathway in autoimmunity andperipheral tolerance[J].Ann N Y Acad Sci.2011Jan； 1217：45-59.
[2]Keam SJ.Toripalimab：First Global Approval.Drugs.2019 Apr；79(5)：573-578.
[3]Yang JL，Dong LH，Yang S，et al.Safety and clinical efficacy oftoripalimab，a PD-1mAb，in patients with advanced or recurrent malignancies ina phase I study.Eur J Cancer.2020May；130：182—192.
[4]Wei XL，Ren C，Wang FH，et al.A phase I study of toripalimab，an anti-PD-1antibody，in patients with refractory malignant solid tumors.Cancer Commun(Lond).2020Aug；40(8)：345-354
[5]Tang BX，Yan XQ，Sheng XN，et al.Safety and clinical activity with ananti-PD-lantibody JS001in advanced melanoma or urologic cancer patients. JHematol Oncol.2019Jan 14；12(1)：7.
发明内容
发明人通过深入研究，已经建立了超高效液相色谱串联质谱(ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， UPLC-MS/MS)技术检测人血浆中特瑞普利单抗的药物浓度的方法。采用本发明的方法的检测结果表明特瑞普利单抗及其同位素内标的特征性肽段出峰均较好，不受基质中其他杂质的干扰，特瑞普利单抗的定量准确、可靠，能够用于接受特瑞普利单抗治疗患者的药物浓度监测。
因此，在一些实施方案中，本文提供以下各项：
1.通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定特瑞普利单抗浓度的方法，其中所述方法采用ASGYTFTDYEMHWVR作为特征性肽段进行测定。
2.项目1所述的方法，其中所述方法用于测定来自人受试者的血浆样品中的特瑞普利单抗浓度。
3.项目1或2所述的方法，采用内标法对特瑞普利单抗进行定量，其中所述方法采用内标CKASGYTFTDYEMHWVR进行。
4.项目3所述的方法，其中所述内标通过同位素进行标记，例如对肽段C末端精氨酸R进行同位素标记，例如通过精氨酸(R)的C和N元素进行同位素标记。在本发明的UPLC-MS/MS方法中，利用内标法测定以及同位素标记方法可以采用本领域已知的方法进行，例如可以对内标的氨基酸进行C和N元素标记。在本发明的一些实施方案中，可以对内标的C末端精氨酸(R)的C和N元素进行同位素标记R*(13C6，15N4)合成内标标准品。
5.项目2-4中任一项所述的方法，其中所述血浆样品通过前处理获得待测样品上清液。
6.项目5所述的方法，其中待测血浆样品进行前处理，例如进行变性、还原、烷基化、酶解、淬灭和离心，获得待测样品上清液。在本发明的 UPLC-MS/MS方法中，可以采用本领域已知的方法进行样品前处理。例如，可以采用已知的方法对血浆样品进行变性、还原、烷基化、酶解和淬灭处理，离心后取上清进样。例如，所述样品前处理可以采用已知的变性剂(例如Rapigest SF Surfactant)，变性缓冲液(例如NH4HCO3缓冲液)、还原剂 (例如二硫苏糖醇)，烷基化剂(例如碘乙酰胺)，酶溶液(例如胰蛋白酶溶液)，淬灭剂(例如三氟乙酸)进行。
7.项目1-6中任一项所述的方法，其中所述方法采用甲酸水-甲酸乙腈作为流动相进行。
8.项目1-7中任一项所述的方法，其中所述方法通过梯度洗脱进行。
9.项目1-8中任一项所述的方法，其中所述流动相采用0.1-0.8ml/min 的流速进行，例如采用0.2-0.50ml/min的流速进行。在本发明的 UPLC-MS/MS方法中，可以采用任何适当的流动相和流速进行，例如采用甲酸水-甲酸乙腈作为流动相进行，例如流动相A相为0.1％甲酸水，B相为0.1％甲酸乙腈，以0.3mL/min流速进行。
10.项目1-9中任一项所述的方法，其中所述方法采用ACQUITY UPLC Peptide BEHC18，
Figure BDA0003093656170000041
(2.1mm×150mm，1.7μm)作为分析柱进行。在本发明的UPLC-MS/MS方法中，可以采用任何适当的分析柱进行，例如，可以采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，
Figure BDA0003093656170000042
(2.1mm×150mm， 1.7μm)作为分析柱进行。
附图说明
图1：数据库中筛选与特瑞普利单抗重链(A)和轻链(B)序列相似性最高的蛋白。
图2：特瑞普利单抗特征性肽段二级质谱图。
图3：空白样品(A)、含内标的样品(B)以及LLOQ样品(C)中特瑞普利单抗(下)和内标(上)的特征性色谱图。
图4：特瑞普利单抗特征性肽段的标准曲线。
图5：受试者接受特瑞普利单抗注射液(3mg/kg)第5次给药后第15 天的血样检测色谱图。
具体实施方式
1.概述
为了建立超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定特瑞普利单抗浓度的方法，发明人首先对特瑞普利单抗进行了研究。生物样品复杂成分可能会严重干扰待测样品中的单抗药物的准确定量，获得能够代表待测单抗的特征性肽段特别重要。所选择的肽段需要具备稳定性(例如避免容易发生修饰的肽段)、特异性、减少样品成分干扰等。发明人对特瑞普利单抗酶解后各种肽段进行了筛选，获得了特征性肽段 ASGYTFTDYEMHWVR，然后基于该特征性肽段合成延长同位素内标 CKASGYTFTDYEMHWVR*。血浆样品经过变性、还原、烷基化、酶解和淬灭过程，离心后取上清进样。液相条件选用ACQUITY UPLC Peptide BEHC18，
Figure BDA0003093656170000043
(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱，流动相为A：0.1％甲酸水以及B：0.1％甲酸乙腈，以0.3mL/min流速进行梯度洗脱。质谱方法采用电喷雾电离，正离子多反应监测模式监测离子对：特征性肽段的m/z 621.61→742.835，内标的m/z 624.947→747.839。按照FDA和CFDA指导要求对该方法进行方法学验证。并检测了受试者血浆中JS001的药物浓度，初步验证方法的临床适用性。结果显示：血浆样品中的特瑞普利单抗在5.0375～201.5μg/mL范围具有较好的线性，r2＞0.98；其高、低浓度的批间和批内准确度和精密度分别为-11.26～8.31％和1.98～6.68％，定量下限的批间和批内的准确度和精密度分别为-19.97～-14.46％和4.03～ 10.56％；血浆样品在室温放置1小时、-80℃保存29天以及冻融三次条件下均保持稳定，血浆样品经处理后在8℃进样器保存52小时仍保持稳定；该方法检测了多次给药的3mg/kg剂量组受试者血样，色谱图展示特瑞普利单抗的特征性肽段出峰较好，定量不受血浆基质中其他物质的干扰，其检测浓度为9.89μg/mL。因此，本研究建立特瑞普利单抗单抗的检测方法开发周期较短、操作简便、重复性较好，可用于检测接受特瑞普利单抗治疗的恶性肿瘤患者血浆中药物浓度。
2材料与方法
2.1标准品与试剂
特瑞普利单抗注射液标准品由上海君实生物医药科技股份有限公司提供，延长同位素内标标准品由北京中科亚光生物科技有限公司合成 (CKASGYTFTDYEMHWVR*(13C6，15N4)，纯度为99.26％)。ProteinWorksTM High Digest Ambient Kit和ReductionAlkylation Kit均购自美国Waters公司，胰蛋白酶美国Sigma-Aldrich公司，色谱级乙腈、甲醇和异丙醇均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，LC-MS级甲酸购自日本TCI公司，实验用水为屈臣氏蒸馏水。空白的EDTA-K2血浆样品来源于健康志愿者。
2.2仪器设备
液相色谱仪：ACQUITYUPLC I class(美国Waters科技有限公司)
质谱仪：Xevo TQ-S micro(美国waters科技有限公司)
处理软件：Masslynx4.1(美国waters科技有限公司)
色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，
Figure BDA0003093656170000051
(2.1mm×150mm， 1.7μm)(美国waters科技有限公司)
其它仪器：赛多利斯BT-25S十万分之一电子分析天平(德国)
Thermo LEGEND MiCRO21R低温高速离心机(德国)
Thermo ST 16R高速冷冻离心机(德国)
海门其林贝尔LX-200迷你离心机(中国江苏)
海门其林贝尔QL-901漩涡混匀器(中国江苏)
新苗H·SWX-420BS电热恒温水温箱(中国上海)
各量程Eppendorf移液器(德国)
2.3特瑞普利单抗酶解后特征性肽段以及内标的确定
由于单克隆抗体的分子量较大(＞100kD)，远超出质谱的定量范围 (2-2048D)，因此需要将特瑞普利单抗酶解成分子量较小的肽段，然后从酶解的肽段中选择灵敏度较高、不受内源性干扰且稳定性较好的特征性肽段，然后将该特征性肽段进行同位素标记，合成延长同位素内标，利用内标法定量检测特征性肽段进而间接反映特瑞普利单抗的水平。
(1)蛋白水平比对：在Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 的blastp(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins)中提交特瑞普利单抗的一级序列(分别提交重链和轻链的蛋白序列)，与数据库中蛋白序列进行比对，筛选与特瑞普利单抗相似性最高的蛋白。与重链相似性最高的蛋白为：人物种的immunoglobulingamma-1heavy chain，与轻链相似性最高的蛋白为：人物种的immunoglobulin kappalight chain(图1)。
(2)理论酶解：将特瑞普利单抗重链(轻链)和步骤(1)找到的相似性最高的数据库蛋白序列提交到Expasy网站 (http：//web.expasy.org/sim/)，进行序列比对，寻找最佳非交叉序列。然后将对齐的序列粘贴到NotePad中，在胰蛋白酶的酶切位点K、R处进行手动酶解，初步得到候选特征性肽段。
(3)肽段水平比对：将筛选的特征性肽段在数据库中进行比对，去除受内源性干扰的肽段。
其中步骤(2)和(3)筛选特征性肽段参照以下原则：尽量避免肽段中含有不稳定氨基酸残基，比如易发生氧化的甲硫氨酸(M)和半胱氨酸 (C)，易发生脱酰胺基反映的天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)，当无其他可用的候选特征性肽段时，可以考虑含有这些氨基酸的肽段，同时需要对其稳定性进行考察。肽段长度最好为10-20个氨基酸，避免数目太少难以保证特异性，太长可能会超出三重四极杆检测器的上限。最后，为确保筛选的肽段适合方法的开发，需要用实际的基质样品被酶解后上机检测，评价候选肽段的稳定性以及是否受内源性基质干扰等，确定最佳的替代肽段。最终在重链包含互补决定区(complementarydetermining region，CDR) 区筛选出2个特征性肽段：ASGYTFTDYEMHWVR(缩写用ASG代替)和QAPIHGLEWIGVIESETGGTAYNQK(缩写用QAP代替)，他们包含 CDR1和CDR2区域的序列，见表1。
(4)上机检测：与空白血浆样品相比，实验样品中未检测到QAP肽段特异性的信号峰，可能由于该肽段分子量较大不适合检测，或在样品处理过程中被修饰、降解等，因此不再考虑该肽段。对ASG肽段进行评估，结果展示具有较好的特异性和稳定性，因此选作特瑞普利单抗的特征性肽段。ASG肽段母离子的单同位素分子量为1862.8，主要带三价态的离子，因此质荷比m/z为621.6，其子离子主要带二价(图2)。其中m/z 621.6 →742.8、621.6→692.3、621.6→618.7这三对离子对信号较高，线性拟合也较好，R2＞0.98，故选择信号最高的m/z 621.6→742.8用于定量监测，其余两对用于辅助分析。
(5)内标的确定：在ASG肽段的左侧延长2个氨基酸长度，并用稳定同位素标记肽段C末端精氨酸(R)上的C和N原子，进而合成延长的同位素内标标准品CKASGYTFTDYEMHWVR*(13C6，15N4)，其母-子离子反应对为m/z 624.→747.8(表1)。在空白基质中加入内标上机检测，内标色谱图展示具有较好的色谱分离。
2.4液质条件
2.4.1色谱条件
色谱柱温度和进样器温度分别设置为60℃和8℃，样品进样体积为3 μL，流动相A相为0.1％甲酸水，B相为0.1％甲酸乙腈，流速：0.3mL/min，进行梯度洗脱：0-1min，15％B；1-10min，15％-25.5％B；10-10.5min， 25.5％-80％B；10.5-11min，80％B；11-19min，80-15％B。
2.4.2质谱条件
电喷雾离子源(ESI)正离子模式，MRM多离子反应检测，离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流量850L/Hr，气帘气流量 50L/Hr，毛细管电压0.5kV，特瑞普利单抗特征性肽段和同位素内标的锥孔电压和碰撞能分别为35V，15V。特征性肽段母离子的单同位素分子量为1862.814(图3)，带三价态的离子m/z为621.610；其子离子的单同位素分子量为1484.661，带二价态离子m/z为742.835；故特瑞普利单抗特征性肽段的母子离子反应对为m/z 621.610→742.835，其对应同位素内标的母子离子反应对为m/z 624.947→747.839。
2.5内标储备液和工作液的制备
取延长同位素内标对照品精密称量，以(0.1甲酸0.1％血浆)20％乙腈水为溶剂溶解，配制成内标浓度为1mg/mL的储备液，再以(0.1甲酸 0.1％血浆)20％乙腈水进行系列稀释至10μg/mL的工作液。置于-20℃保存备用。
2.6标准曲线和质控样品的制备
取4℃保存的特瑞普利单抗注射液，以人空白血浆进行系列稀释至 201.5，100.75，50.375，20.15，10.075和5.0375μg/mL(标准曲线样品)，以及161.2，80.6和8.06μg/mL(质控样品)。
2.7血浆样品前处理
(1)变性：精密量取血浆样品35μL加入2.0mL的Ep管中，依次精密加入45μLdigestion buffer(缓冲液，50mM NH4HCO3)和16μL Rapigest SF Surfactant(变性剂，7mg/mL)，涡旋混匀30s。在电热恒温水温箱中80℃孵育10min。
(2)还原：将变性后的样品从水温箱取出，室温平衡5min。然后加入16μLReduction agent(还原剂，70mM二硫苏糖醇)，涡旋混匀30s。在水温箱中60℃孵育20min。
(3)烷基化：将还原后的样品从水温箱取出，室温平衡5分钟。加入24μLAlkylation agent(烷基化剂，142mM碘乙酰胺)，涡旋混匀30s。室温避光孵育30min。
(4)酶解：在烷基化后的样品中入10μL内标溶液(10μg/mL)，然后加入24μLtrypsin solution(胰蛋白酶溶液，0.8mg/mL)，涡旋混匀30s。在水温箱中45℃孵育2h。
(5)淬灭：在酶解后的样品中加入4μL digestion inactivation agent(淬灭剂，20％三氟乙酸溶液)，涡旋混匀30s。在45℃水温箱中孵育15min。
(6)离心：将淬灭后的样品放入低温高速离心机中，14000rpm，10℃条件下离心15min。
(7)装瓶：取上清80μL装入进样小瓶。最终3μL样品量进入 LC-MS/MS系统测定人血浆中特瑞普利单抗的浓度。
2.8方法学验证
参照2018年版FDA《Guidance for industry：bioanalytical method validation2018)》及2015年版《中国药典》中《9012生物样品定量分析方法指导原则》，对建立的方法进行验证，包括方法的选择性、标准曲线和低定量下限、残留效应、精密度与准确度、基质效应、稳定性及稀释可靠性。
2.9临床适用性
特瑞普利单抗的I期临床试验(NCT02836834)是一个单中心、非盲、剂量递增和剂量扩展的临床研究，主要评估药物的安全、耐受性、药物代谢动力学、药效学、免疫原性，和药物的抗肿瘤活性。通过静脉注射(IV) 每两周给药一次的方式，用于治疗经标准治疗失败的晚期或复发的恶性肿瘤成年患者。采集临床全血样本，3500rpm，离心10min，上层血浆分装后冻存于-80℃冰箱中。通过检测1例接受3mg/kg剂量组受试者血药浓度，初步验证检测方法的适用性。
3结果
3.1选择性
分别取6个不同健康人的空白血浆35μL，除不加内标外，按“2.7血浆样品前处理”操作，然后进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品的色谱图(图3A)。
分别取6个不同健康人的空白血浆35μL，按“2.7血浆样品前处理”操作，然后进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品+内标对照品的色谱图 (图3B)。
将特瑞普利单抗注射液分别用6个不同健康人的空白血浆进行系列稀释，配制成浓度均为5.0375μg/mL的6个血浆样品，然后分别取35μL，按“2.7血浆样品前处理”操作，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆样品+ 特瑞普利单抗(5.0375μg/mL)+内标对照品的色谱图(图3C)。
3.2标准曲线和低定量下限
取空白血浆将特瑞普利单抗注射液进行系列稀释，配制成相当于血浆中特瑞普利单抗浓度为201.5，100.75，50.375，20.15，10.075和 5.0375μg/mL的血浆样品(6个浓度的标准曲线样品)。分别取配制的标曲样品35μL，然后按“2.7血浆样品前处理”操作。以特瑞普利单抗浓度与内标浓度比值(X)为横坐标，特瑞普利单抗与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法(W＝1/X2)进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。结果表明特瑞普利单抗在5.0375～201.5μg/mL浓度范围内线性关系良好(表1，图4)。
3.3残留效应
通过在定量上限(ULOQ)进样后，进样空白样品考察残留效应。定量上限样品中特瑞普利单抗和内标在空白样品中的残留分别不应超过低定量下限(LLOQ)中特瑞普利单抗响应的20％，内标的5％(表2)。
3.4精密度和准确度
配制血浆特瑞普利单抗浓度为161.2，80.6和8.06μg/mL的高、中、低3个浓度的样品，以及5.0375μg/mL的LLOQ，每个浓度制备6份，作为一批精密度和准确度样品，分别按“2.7血浆样品前处理”操作，测定三批精密度和准确度样品，至少两天完成。计算药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天拟合的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间的精密度和准确度。精密度和准确度分别用RSD和RE表示，其绝对值小于15％为合格，LLOQ的RE和RSD绝对值小于20％为合格(表3)。
3.5基质效应
将特瑞普利单抗注射液分别用6个不同健康人的空白血浆进行系列稀释，配制成血浆特瑞普利单抗浓度为161.2和8.06μg/mL的高、低两个水平的血浆样品各6份，按上述“2.7血浆样品前处理”同样操作，进行 LC-MS/MS分析，根据拟合的标准曲线计算6个不同来源空白血浆配制的高、低水平的特瑞普利单抗的浓度，其回算浓度与标示值的偏差均在±15％范围内即为合格，表明不同来源个体的血浆基质不影响特瑞普利单抗的定量(表4)。
3.6稳定性
配制低、高浓度质控样品(161.2和8.06μg/mL)各5份，将样本置于不同的保存条件，然后由新鲜配制的标准曲线进行定量，考察特瑞普利单抗的稳定性。每一浓度的均值与标示浓度的偏差均在±15％范围内即为合格(表5)。
3.6.1室温1h稳定性
将质控样品置于室温1h保存，考察血浆样品在室温放置1h的室温稳定性。
3.6.2-80℃保存稳定性
将质控样品，置于-80℃冰箱保存29天，考察血浆样品在-80℃保存 29天的稳定性。
3.6.3三次冻融稳定性
将质控样品，每一浓度重复五个样本，置于-80℃冰箱保存。至少保存 24h后，从-80℃冰箱取出放置室温平衡，然后将样品放回冰箱，完成第一个冻融循环；至少保存12h后，将样本从-80度冰箱取出室温平衡，然后将样品放回冰箱，完成第二个冻融循环；然后将样本放回-80℃冰箱保存，至少保存12h后，将样本从-80度冰箱取出室温平衡，第三个冻融循环完成，考察血浆样品冻融三次的稳定性。
3.6.4进样器8℃保存稳定性
将处理好的质控样品置于进样器8℃保存52h，考察血浆样品在进样器8℃保存52h的稳定性。
3.7稀释可靠性
用空白基质配制浓度超过定量上限(ULOQ)的质控样品，然后用空白基质稀释该样品，每个稀释因子至少配制5个重复样品。然后按“2.7血浆样品前处理”操作，以新鲜配制的标准曲线进行定量，其准确度和精密度应在±15％内(表6)。
4临床应用
特瑞普利单抗的I期临床试验(NCT02836834)入组患者为经标准方案治疗失败的晚期或复发的恶性肿瘤患者，然后接受特瑞普利单抗单抗注射液静脉滴注，每两周给药一次。收集1例多次给药的3mg/kg剂量组受试者第5次给药后第15天的血样，应用该方法检测其血浆中特瑞普利单抗的浓度，验证方法的适用性。结果显示，特瑞普利单抗和内标的特征性肽段出峰均较好，定量不受血浆基质中其他物质的干扰，其检测浓度为 9.89μg/mL(图5)。
表1.特瑞普利单抗的候选特征性肽段
Figure BDA0003093656170000131
表2.特瑞普利单抗的三批次标准曲线
Figure BDA0003093656170000132
表3.特瑞普利单抗和内标的残留效应
Figure BDA0003093656170000141
表4.特瑞普利单抗的批间和批内的精密度和准确度
Figure BDA0003093656170000142
表5.特瑞普利单抗的基质效应(n＝6)
Figure BDA0003093656170000143
Figure BDA0003093656170000151
表6.特瑞普利单抗在不同保存条件下的稳定性(n＝5)
Figure BDA0003093656170000152
表7.特瑞普利单抗稀释5倍可靠性(n＝5)
Figure BDA0003093656170000153
5讨论
本研究建立了快速、灵敏的UPLC-MS/MS检测方法，对人体血浆中特瑞普利单抗浓度进行定量检测。目前无关于人血浆中特瑞普利单抗浓度检测的方法报道，已有研究提及应用电化学发光法检测人血浆中特瑞普利单抗浓度，但该方法前期需要较长时间筛选和合成特异的抗原或抗体，方法开发周期较长，且可能存在非特异性结合进而干扰检测结果；本发明人开发的UPLC-MS/MS方法较简单、快捷，方法开发周期较短，且具有良好的重复性。该方法的开发流程为：首先经过理论和实际上机检测筛选特瑞普利单抗酶解物中特征性肽段，确定特征性肽段后，合成其延长同位素内标标准品；然后在空白基质中加入特瑞普利单抗完整蛋白的注射液，经历变性、还原和烷基化后，再加入同位素内标溶液，经历酶解、淬灭和离心，最后取上清进入LC-MS/MS系统，检测ASGYTFTDYEMHWVR，用内标法定量特征性肽段的浓度间接反映人血浆中特瑞普利单抗的浓度。根据已检测的1例临床病人样本结果，特瑞普利单抗和其同位素内标的特征性肽段出峰均较好，不受基质中其他杂质的干扰，特瑞普利单抗的定量准确、可靠。
综上，本研究首次建立了UPLC-MS/MS检测人血浆中特瑞普利单抗浓度的方法，该方法具有较好的可靠性和重复性，可用于接受特瑞普利单抗治疗患者的药物浓度监测。

Claims (11)

1.一种通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定特瑞普利单抗浓度的方法，其中所述方法采用ASGYTFTDYEMHWVR作为特征性肽段进行测定。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法用于测定来自人受试者的血液样品中的特瑞普利单抗浓度，其中所述血液样品选自全血、血清和血浆。
3.权利要求1或2所述的方法，采用内标法对特瑞普利单抗进行定量，其中所述方法采用内标CKASGYTFTDYEMHWVR进行。
4.权利要求3所述的方法，其中所述内标通过同位素进行标记，对肽段C末端精氨酸(R)的C和N元素进行同位素标记。
5.权利要求2所述的方法，其中所述血浆样品通过前处理获得待测样品上清液。
6.权利要求5所述的方法，其中所述前处理包括变性、还原、烷基化、酶解、淬灭和离心过程。
7.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用甲酸水-甲酸乙腈作为流动相进行。
8.权利要求1或2所述的方法，其中流动相采用0.1-0.8ml/min的流速进行。
9.权利要求8所述的方法，其中所述流动相采用0.2-0.50ml/min的流速进行。
10.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括梯度洗脱步骤。
11.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18,
Figure FDA0003647155540000011
(2.1mm×150mm,1.7μm)作为分析柱进行。
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