CN113341012B - 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用，属于代谢物检测技术领域。所述方法包括：基于LC‑MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；其中，所述前处理方法包括向待测样品中加入维生素C。本发明通过优化前处理方法，从而实现对同型半胱氨酸、叶酸、5‑甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸等7种物质的准确检测，该方法可以应用于临床同型半胱氨酸代谢通路上重要代谢物的检测项目，有助于给出受试者体内上述代谢物的真实浓度的真实水平，非常有助于临床或实验室使用，对于高同型半胱氨酸血症的预防或治疗具有重要指导意义，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于代谢物检测技术领域，具体涉及同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，主要是在甲硫氨酸(methionine，Met)代谢过程中生成的，在体内的代谢途径有3种：①同型半胱氨酸与丝氨酸在胱硫醚β合成酶催化下，以维生素B6为辅酶，生成胱硫醚，胱硫醚在胱硫醚γ裂合酶作用下，最终生成半胱氨酸(cysteine，Cys)；②同型半胱氨酸在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，以维生素B12为辅酶，以甲基四氢叶酸为甲基供体，甲基化生成甲硫氨酸；③同型半胱氨酸直接释放到细胞外液。由以上代谢途径可知，影响同型半胱氨酸代谢的因素有很多，包括前体物质、酶、辅助因子等，这些在同型半胱氨酸代谢通路上的必需因子通过影响代谢途径从而可能导致同型半胱氨酸在血中蓄积，形成高同型半胱氨酸血症。比如，在第2种代谢途径中，正常生理情况下，同型半胱氨酸经过一系列酶的参与及辅助，最终代谢为甲硫氨酸，如果代谢辅酶维生素B12缺乏，会使同型半胱氨酸代谢受阻，在血中浓度升高，从而形成高同型半胱氨酸血症，对人体造成一定的损伤。
我国高同型半胱氨酸血症发病率较高，其中轻度患者的发病率占正常人群的5％-7％。同型半胱氨酸血症与心血管疾病、高血压、脑卒中、慢性肾脏病、肿瘤、痴呆等疾病的发生发展均有一定的关联性，可作为这些疾病的独立危险指标或重要危险指标，也可用于人体健康风险评估。据流行病学调查表明，我国成人血中同型半胱氨酸水平均值为13-14μmol/L，男性高于女性，而美国人群血中同型半胱氨酸水平均值为9.4μmol/L，我国人群要高出40％-50％，可见我国人群同型半胱氨酸水普遍处于较高水平。Hcy含量与遗传因素、营养因素、年龄性别、疾病以及药物使用等因素有关，如Hcy代谢途径上控制5-甲基四氢叶酸还原酶活性的MTHFR基因如果发生突变，则酶活性会降低或失活，可导致代谢通路受阻，血中Hcy蓄积，导致高同型半胱氨酸血症；体内Hcy水平与微量营养素的摄入有关，血中维生素B6、维生素B12摄入不足，其Hcy水平越高，尤其我国烹饪习惯造成的日常维生素缺乏现象很普遍，是我国人群Hcy平均水平高于美国的原因之一；据研究，年龄的增长与血Hcy水平呈正相关，男性普遍高于女性，这可能与内分泌激素有关。这些影响因素是预防或治疗高同型半胱氨酸血症的重要突破口。
由上述可知，在一种或多种因素的影响下，人体Hcy升高，使得细胞、组织及器官发生病变，从而对人体健康造成严重影响。Hcy升高是人体代谢异常的结果，代谢通路上涉及的7种重要代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸，它们的含量变化，可在一定程度上反应Hcy水平的变化，把它们作为检测指标，通过检测并控制这些代谢物处于合适的水平范围内，可有效预防疾病发生或控制高同型半胱氨酸血症病情发展。在2020年《高同型半胱氨酸血症诊疗专家共识》中指出，推荐开展与同型半胱氨酸相关的检测指标，以明确同型半胱氨酸升高的原因，进而指导临床精准干预治疗，实现有效预防和精准医疗的目的。因此，仅检测同型半胱氨酸一项指标，已不能满足目前临床需求，需要多种指标联合检测，对Hcy代谢通路上各代谢物进行综合评估，科学指导临床制订个体化诊疗方案，对高同型半胱氨酸血症的预防或治疗具有重要指导意义。
临床或实验室的诊断方法有高效液相色谱法、光谱法、微生物法、化学发光法、放射酶免疫法以及酶比色法等。上述的传统检测方法操作过程繁琐复杂，且灵敏度和特异性不足，尤其是对基质复杂且含量较低的内源性物质，检测效果不理想，无法满足检测需要。高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)具有灵敏度高、特异性强、准确性好、通量高等特点，可同时对pg～μg级别的不同水平物质同时检测，检测范围广，不受结构类似物的影响，并且样品用量少、分析时间短，是目前临床上理想的首选方法。
发明人发现，目前能够同时检测同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸等7种物质的HPLC-MS/MS方法未有报道，仅有检测其中一种或几种报道。由于血清基质复杂，与待测物理化性质相似的内源性物质非常多，会影响结果的灵敏度和准确性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用。本发明通过优化前处理方法，从而实现对同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸等7种物质的准确检测，具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法，所述代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸中，所述方法包括：基于LC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；
其中，所述前处理方法中包括向待测样品中加入维生素C，从而有效提高5-甲基四氢叶酸的稳定性。所述维生素C浓度控制为10～30μg/mL，优选为20μg/mL。
所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
进一步的，所述检测方法中还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控。
具体的，校准品工作液制备方法可以包括：采用含1～6％BSA(优选为5％)的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加上述物质混标，并使用基质溶液进行稀释得不同浓度梯度的溶液，作为校准品工作液。
所述物质包括同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸。需要说明的是，维生素C作为保护剂，并不参与定量。
采用高和低两个水平的质控品进行质控；
具体的，使用同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸和维生素C终浓度分别为25μmol/L、10ng/mL、25ng/mL、50μmol/L、40ng/mL、5ng/mL、50μmol/L、20μg/mL作为高控，使用同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸和维生素C终浓度分别为10μmol/L、4ng/mL、10ng/mL、20μmol/L、16ng/mL、2ng/mL、20μmol/L、20μg/mL作为低控。
所述前处理方法还包括：将加入维生素C的待测样品与同位素内标工作液混合，离心，取上清液进行上机检测。
所述同位素内标工作液制备方法为：将上述各代谢物的同位素内标原料加入提取液中溶解即得。
其中，各代谢物的同位素内标原料包括Hcy-D4、FA-13C5、5MT-13C-D3、Met-D3、PLP-D3、VB12-13C7和Cys-13C3。
所述提取液为含有HCl的异丙醇与三氯乙酸(TCA)的混合溶液；进一步的，所述提取液中还含有二硫苏糖醇(DTT)，所述DTT浓度控制为10～20μg/mL，优选为15μg/mL。通过加入DDT，能够显著提高同型半胱氨酸的检出性，且对其他待测代谢物无显著影响。
所述LC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：含1‰甲酸1mM甲酸铵的水溶液，流动相B相：含1‰甲酸1mM甲酸铵的甲醇溶液；
流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为30～45℃(优选为40℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；
梯度洗脱方式具体为：0-1min 1％流动相B，1-2min升至98％流动相B，2-5min维持98％流动相B，5-5.5min将至1％流动相B，5.5-7min维持1％流动相B，停止。
质谱条件包括：
正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。离子源参数喷雾电压4000V，离子传输管温度350℃，蒸发温度350℃，鞘气50arb，辅气10arb。
MRM质谱参数如下所示：
本发明的第二个方面，提供同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的试剂盒，所述试剂盒包括：同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸中的任意一种或多种标准品；
Hcy-D4、FA-13C5、5MT-13C-D3、Met-D3、PLP-D3、VB12-13C7和Cys-13C3中的任意一种或多种作为同位素内标原料；
稀释液包括含1～6％BSA(优选为5％)的生理盐水；
提取液包括含有HCl的异丙醇与三氯乙酸(TCA)的混合溶液；进一步的，所述提取液中还含有二硫苏糖醇(DTT)，所述DTT浓度控制为10～20μg/mL，优选为15μg/mL；
所述试剂盒中还含有维生素C。
本发明的第三个方面，提供上述方法和/或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
a)同型半胱氨酸代谢通路研究；
b)高同型半胱氨酸血症的防治。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案通过优化前处理方法并结合LC-MS/MS测定同型半胱氨酸代谢通路上7种重要代谢物，并从线性、灵敏度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等多方面对上述7种代谢物在血清中的测定方法进行了充分的验证。该方法可以应用于临床同型半胱氨酸代谢通路上重要代谢物的检测项目，有助于给出受试者体内上述代谢物的真实浓度的真实水平，非常有助于临床或实验室使用，对于高同型半胱氨酸血症的预防或治疗具有重要指导意义，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中7种代谢物的色谱图(同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，目前能够同时检测同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸等7种物质的HPLC-MS/MS方法未有报道，仅有检测其中一种或几种报道。由于血清基质复杂，与待测物理化性质相似的内源性物质非常多，会影响结果的灵敏度和准确性，所以需要对血清样本进行净化处理，以降低基质效应对检测结果的影响。
有鉴于此，本发明经研发发现，上述7种代谢物，除了VB12，其它物质的logP常数均小于1，可见易溶于水，极性强，而VB12的logP常数为6.63，具有较强的非极性。但是存在的主要问题是：①5-甲基四氢叶酸不稳定，容易氧化降解，如何保证稳定性？②维生素B6(PLP)带磷酸基团，易电离，且在质谱中不稳定容易脱掉磷酸基团，如何改进？③VB12在血清中含量低，仅为pg级别，如何提高灵敏度？且与其它几个代谢物极性差异较大，如何同时提取？④Hcy检测时需要加入还原剂DTT，DTT的加入对其它物质检测是否有影响？
通过对上述问题的深入研究，本发明对前处理方法进行了优化，具体如下：
1)维生素C由于其自身结构具有极易被氧化的特点，常被用作抗氧化剂，代替其它物质优先被氧化，从而保护其它物质不被氧化，并且使用时安全性好。对比了血清样本中加入20μg/mL维生素C和不加入维生素C的5MT峰面积，如表1所示。发现加入维生素C组，7天内血清中5MT变化不显著，含量较稳定，而未加入维生素C组，3天时已发生明显降解，至7天时降解已达到75％，可见维生素C的加入对维持5MT稳定性有明显效果。
表1血清样本中加入维生素C和不加入维生素C的峰面积对比表
2)维生素B6也是5’磷酸吡哆醛，简称PLP，含有1个磷酸基团，容易发生电离，使得待测物以电离和非电离两种形式存在，峰型不好，所以需要加酸抑制其电离，使其以非电离一种形式存在。PLP在酸性条件下的pKa为1.68，所以通过加入一定量0.1mol/L HCl溶液，使其pH值控制在pKa±2范围之外，峰型稳定且平滑尖锐，峰型改善。此外还发现，HCl的加入，也可防止PLP的磷酸基团在质谱中脱落，可能原因是在高温高电压的离子源内，PLP物质结构易发生断裂，而HCl的加入，一方面加速PLP离子化，提高了离子化效率，另一方面以盐酸盐的形式存在，利于结构稳定。
3)VB12在人体内含量非常低，常规的蛋白沉淀方法，会对样品浓度造成一定程度的稀释，虽然蛋白沉淀后可进行氮吹浓缩，但蛋白沉淀溶剂一般沸点较高，造成氮吹时间过长，不利于临床推广使用。用含5％异丙醇20％TCA作为沉淀蛋白沉淀剂，与血清样本等体积混合，离心后取上清直接进样分析。与对照组乙腈沉淀蛋白法进行了对比，如表2所示，其中乙腈沉淀蛋白后需要氮吹浓缩，复溶后上机检测。发现实验组比对照组峰面积高约70％，而且实验组前处理时间比对照组至少短0.5小时。沉淀剂中20％TCA用于沉淀血清蛋白，而异丙醇作为双极性溶剂，一方面可促进血清蛋白沉淀，另一方面利于脂溶性较强的VB12溶解。
表2不同蛋白沉淀方法的峰面积对比表
| 分析物 | 血清加入浓度 | 对照组 | 实验组 |
| VB12 | 10ng/mL | 22368 | 37890 |
4)提取液加入还原剂二硫苏糖醇(DTT)，加入后浓度为15μg/mL，进行血清样品前处理，上机检测，观察峰面积。与对照组未加DTT对比，如表3所示，对于Hcy，对照组和实验组信号差异很大，对照组的Hcy基本无检出，需经过DTT对二硫键还原后，在实验组方可检出，同时通过峰面积比较，发现DTT对其它物质的信号影响不大，两组无显著差异。
表3提取液中加入DTT和不加入DTT的峰面积对比表
| 分析物 | 血清加入浓度 | 对照组(未加DTT) | 实验组(加DTT) |
| Hcy | -- | 585 | 37890 |
| FA | 20ng/mL | 25362 | 26501 |
| 5MT | 20ng/mL | 32133 | 32899 |
| Met | 20μmol/L | 56691 | 55989 |
| PLP | 20ng/mL | 44952 | 45235 |
| VB12 | 10ng/mL | 41885 | 42362 |
| Cys | 20μmol/L | 148133 | 150236 |
本发明的又一具体实施方式中，LC-MS/MS检测条件为：
色谱条件：流动相A：含1‰甲酸1mM甲酸铵的水溶液；流动相B：含1‰甲酸1mM甲酸铵的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0-1min 1％流动相B，1-2min升至98％流动相B，2-5min维持98％流动相B，5-5.5min将至1％流动相B，5.5-7min维持1％流动相B，stop，如表1。流速0.4mL/min，进样量5μL，柱温：40℃。
质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。离子源参数喷雾电压4000V，离子传输管温度350℃，蒸发温度350℃，鞘气50arb，辅气10arb。MRM质谱参数如表5所示。
本发明的又一具体实施方式中，提供同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的试剂盒，所述试剂盒包括：同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸中的任意一种或多种标准品；
Hcy-D4、FA-13C5、5MT-13C-D3、Met-D3、PLP-D3、VB12-13C7和Cys-13C3中的任意一种或多种作为同位素内标原料；
稀释液包括含1～6％BSA(优选为5％)的生理盐水；
提取液包括含有HCl的异丙醇与三氯乙酸(TCA)的混合溶液；进一步的，所述提取液中还含有二硫苏糖醇(DTT)，所述DTT浓度控制为10～20μg/mL，优选为15μg/mL；
所述试剂盒中还含有维生素C。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法和/或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
a)同型半胱氨酸代谢通路研究；
b)高同型半胱氨酸血症的防治。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法，包括如下步骤：
前处理方法：
1)200uL血清样本加入20μg/mLVC，混匀后备用。
2)校准品工作液配制：用含5％BSA的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加混标，使得Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys、VC终浓度分别为50μmol/L、20ng/mL、50ng/mL、100μmol/L、80ng/mL、10ng/mL、100μmol/L、20μg/mL。采用含5％BSA的生理盐水为稀释液依次对上述混标液按1:1等比稀释，共6个浓度梯度，作为校准品工作液。备注：VC作为保护剂，不参与定量。取配制好的各浓度校准品工作液500μL分装于1.5mL冻干瓶中，放置于冷冻干燥机内，-55℃预冻4h再进行梯度升温，从第一次升温时进行抽真空，制备成干粉，于-20℃保存备用。使用时，从冰箱取出并放于室温下平衡15-20min，然后分别加入500μL纯水，混匀备用。
3)质控配制：用含5％BSA的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加混标，使得Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys、VC终浓度分别为25μmol/L、10ng/mL、25ng/mL、50μmol/L、40ng/mL、5ng/mL、50μmol/L、20μg/mL作为高控，使得Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys、VC终浓度分别为10μmol/L、4ng/mL、10ng/mL、20μmol/L、16ng/mL、2ng/mL、20μmol/L、20μg/mL作为低控。备注：VC作为保护剂，不参与定量。取配制好的质控品溶液500μL分装于1.5mL冻干瓶中，放置于冷冻干燥机内，-55℃预冻4h再进行梯度升温，从第一次升温时进行抽真空，制备成干粉，于-20℃保存备用。使用时，从冰箱取出并放于室温下平衡15-20min，然后分别加入500μL纯水，混匀备用。
4)提取液配制：配制含15μg/mL DTT、0.01mol/L HCl的5％异丙醇20％TCA溶液。
5)用提取液配制内标工作液，备用。
6)向1.5mL离心管中加入100uL的血清样本(已加VC)，再加入100uL内标工作液，涡旋5min；
7)12000r/min离心5min；
8)取上清液100uL加入96孔进样板中；
9)覆上铝箔封膜，供色谱进样分析；
10)校准品和质控品的前处理方法与样品一致。
上机检测
LC-MS/MS检测条件为：
色谱条件：C18柱，2.1*100mm,3μm流动相A：含1‰甲酸1mM甲酸铵的水溶液；流动相B：含1‰甲酸1mM甲酸铵的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0-1min 1％流动相B，1-2min升至98％流动相B，2-5min维持98％流动相B，5-5.5min将至1％流动相B，5.5-7min维持1％流动相B，stop，如表4。流速0.4mL/min，进样量5μL，柱温：40℃。
表4梯度洗脱程序
| 时间(min) | A相比例(％) | B相比例(％) |
| 0-1 | 99 | 1 |
| 1-2 | 2 | 98 |
| 2-5 | 2 | 98 |
| 5-5.5 | 99 | 1 |
| 5.5-7 | 99 | 1 |
| 7 | stop | stop |
质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。离子源参数喷雾电压4000V，离子传输管温度350℃，蒸发温度350℃，鞘气50arb，辅气10arb。MRM质谱参数如表5。
表5 MRM质谱参数
性能验证：
1、结果计算：首先以校准品浓度为横坐标，以校准品与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性方程y＝bx+a，将样品与内标的峰面积比代入方程，计算样品中各分析物浓度。
用数据处理软件对数据处理，所得标曲线性为：Hcy：y＝0.9901x-0.3255，R2＝0.9928，FA：y＝0.9770x+0.1241，R2＝0.9812，5MT：y＝0.9856x+0.3011，R2＝0.9903，Met：y＝0.9958x+0.2344，R2＝0.9919，PLP：y＝0.9833x+0.3323，R2＝0.9849，VB12：y＝0.9759x-0.1203，R2＝0.9788，Cys：y＝0.9912x+0.3120，R2＝0.9949。R2≥0.95，满足线性要求。
2、定量下限
根据信噪比≥10，重复性Cv≤20％，准确性偏差15％作为定量下限指标的判定标准，当样品中含有表6所示的各分析物浓度时，重复测试10次，经过样品预处理和上机检测，分析后的数据可满足以上判断标准。
表6定量下限
2、精密度
将2个水平质控品以及临床患者样品，各重复检测10次，连续检测3天，各获得30个检测数据，计算重复性CV，各分析物结果为4.6％-8.3％不等。其中VB12由于含量比较低，所以CV比较大，但在CV≤15％的可接受范围内，不会影响结果判读。
3、基质效应
以混合实验法评估基质效应，即待测分析物混标Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys浓度分别为15μmol/L、5ng/mL、20ng/mL、25μmol/L、20ng/mL、1ng/mL、25μmol/L的纯溶液和生物基质样品以及二者1:1混合液，以内标校正，分别处理后进样分析，计算相对基质效应。如果1:1混合液的信号比值与纯溶液和生物基质样品信号比值的均值差异低于20％，则认为基质效应可接受。实验结果为偏差为5.7％-13.7％不等，在可接受范围内。
4、回收率
向临床血清样本中添加相同体积不同浓度的各标准品溶液，使得Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys加入浓度分别为30μmol/L、15ng/mL、30ng/mL、50μmol/L、40ng/mL、5ng/mL、50μmol/L作为回收样本一，使得Hcy、FA、5MT、Met、PLP、VB12、Cys加入浓度分别为10μmol/L、5ng/mL、10ng/mL、20μmol/L、10ng/mL、2ng/mL、20μmol/L作为回收样本二，每个浓度重复测试3次，取3次均值与理论值进行比较，计算回收率，结果为88.5％-103.1％不等，满足85％-115％的判断标准。
5、稳定性试验
校准品、质控品干粉在2-8℃条件下保存30天，在-20℃条件下保存60天，性能仍然良好，通过定期取样观察，计算观察数据的变异系数Cv，在此条件下Cv均小于10％。由此可见，校准品、质控品在干粉状态下，可提高稳定性，利于保存运输。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法，所述代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸，其特征在于，所述方法包括：基于LC-MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；
其中，所述前处理方法包括向待测样品中加入维生素C；
所述前处理方法还包括：将加入维生素C的待测样品与同位素内标工作液混合，离心，取上清液进行上机检测；
所述同位素内标工作液制备方法为：将上述各代谢物的同位素内标原料加入提取液中溶解即得；
各代谢物的同位素内标原料包括Hcy-D4、FA-13C5、5MT-13C-D3、Met-D3、PLP-D3、VB12-13C7和Cys-13C3；
所述提取液为含有HCl的异丙醇与三氯乙酸的混合溶液；所述提取液中还含有二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇浓度控制为10～20μg/mL；
所述LC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：
液相色谱条件包括：
采用梯度洗脱，流动相A相：含1‰甲酸1mM甲酸铵的水溶液，流动相B相：含1‰甲酸1mM甲酸铵的甲醇溶液；
流动相流速为0.3～0.5ml/min；柱温为30～45℃；进样量1～10μL；
梯度洗脱方式具体为：0-1min 1％流动相B，1-2min升至98％流动相B，2-5min维持98％流动相B，5-5.5min将至1％流动相B，5.5-7min维持1％流动相B，停止；
质谱条件包括：
正离子电喷雾离子化的多离子反应监测，离子源参数喷雾电压4000V，离子传输管温度350℃，蒸发温度350℃，鞘气50arb，辅气10arb。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素C浓度控制为10～30μg/mL；所述二硫苏糖醇浓度为15μg/mL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述维生素C浓度为20μg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.4ml/min；柱温为40℃；进样量为5μL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血液样品为血清。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测方法中还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控；
校准品工作液制备方法包括：采用含1～6％BSA的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加上述代谢物混标，并使用基质溶液进行稀释得不同浓度梯度的溶液，作为校准品工作液；
采用高和低两个水平的质控品进行质控。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述BSA的浓度为5％。
9.权利要求1-8任一项所述方法在同型半胱氨酸代谢通路研究的应用。
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