CN115436536B - 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒 - Google Patents

同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115436536B
CN115436536B CN202211074868.7A CN202211074868A CN115436536B CN 115436536 B CN115436536 B CN 115436536B CN 202211074868 A CN202211074868 A CN 202211074868A CN 115436536 B CN115436536 B CN 115436536B
Authority
CN
China
Prior art keywords
homocysteine
sample
biochemical
metabolism related
biochemical metabolism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211074868.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115436536A (zh
Inventor
雒琴
肖冰心
栗琳
王春静
贾子强
张红
江伟
周立
丁亮
王丽君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd
Beijing Haosi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd
Beijing Haosi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd, Beijing Haosi Biotechnology Co ltd filed Critical Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211074868.7A priority Critical patent/CN115436536B/zh
Publication of CN115436536A publication Critical patent/CN115436536A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115436536B publication Critical patent/CN115436536B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法及基于该方法的检测试剂盒，涉及生化代谢标志物检测技术领域。所述检测方法将待测样品和同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准溶液分别用HPLC‑MS/MS进行检测，得到色谱图和质谱图；随后将得到的色谱图和质谱图进行处理，对18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行定性和定量分析，分别得到待测样品中的18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的含量。所述检测方法可同时检测18种高同型半胱氨酸血症相关标志物，并能够排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的技术优势。

Description

同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方 法的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生化代谢标志物检测技术领域，尤其是涉及一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法及基于该方法的检测试剂盒。
背景技术
高同型半胱氨酸血症是一组常见的代谢病，包括遗传性和非遗传性两大类。在遗传性高同型半胱氨酸血症中，胱硫醚β-合成酶缺乏症、亚甲基四氢叶酸还原酶缺乏症和蛋氨酸腺苷转移酶缺乏症表现为单纯高同型半胱氨酸血症，而钴胺素代谢障碍则可导致甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症。非遗传性因素包括钴胺素、叶酸、维生素B6、甜菜碱缺乏等，也可以引起程度不同的高同型半胱氨酸血症。临床诊疗中，针对不同病因导致的高同型半胱氨酸血症，需采用不同方法进行个体化治疗，早期诊治，绝大部分患者预后良好。
目前常见的高同型半胱氨酸血症所涉及标志物检测方法为免疫法或液相色谱-串联质谱法。免疫检测法应用免疫学理论，以抗原或抗体测定样品的含量。然而，免疫法灵敏度高特异性强，但精密度差，耗费人力，操作时间长，不适宜做单个标本和急诊标本。而液相色谱-串联质谱法，由于琥珀酸和甲基丙二酸互为同分异构体，液相色谱-串联质谱法是利用目标物的质荷比来进行筛选的，同分异构体因分子量相同、分子结构相似，单纯利用质荷比无法实现区分。因此，无法实现甲基丙二酸和干扰物同分异构体琥珀酸的分离检测。
因此，研究开发出一种可同时检测18种高同型半胱氨酸血症相关标志物，并能够排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物浓度的HPLC-MS/MS检测方法，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，所述同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法可同时检测18种高同型半胱氨酸血症相关标志物，并能够排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的技术优势。
本发明的第二目的在于提供一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，所述检测方法包括：
(a)提供检测样本以及同型半胱氨酸生化代谢相关标志物，随后将检测样本以及同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行预处理，得到待测样本和同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准工作溶液；
所述同型半胱氨酸生化代谢相关标志物包括同型半胱氨酸(Hcy，homocysteine)、甲硫氨酸(Met，methionine)、胱硫醚(Cth，cystathionine)、半胱氨酸(Cys，cysteine)、丝氨酸(Ser，Serine)、甘氨酸(Gly，glycine)、精氨酸(Arg，arginine)、胆碱(Cho，Choline)、甜菜碱(Bet，betaine)、二甲基甘氨酸(DMG，dimethylglycine)、肌酐(Cre，creatinine)、非对称二甲基精氨酸(ADMA，asymmetric dimethylglycine)、对称二甲基精氨酸(SDMA，symmetric dimethylglycine)、甲基丙二酸(MMA，methylmalonic acid)、吡哆酸(VB6，Pyridoxic acid)、核黄素(VB2，Riboflavin)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF，5-methyltetrahydrofolic-acid)、叶酸(VB9，folic acid)；
(b)将待测样品和同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准溶液分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；
(c)将得到的色谱图和质谱图进行处理，对18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行定性和定量分析，分别得到待测样品中的18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的含量。
本申请提供的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，所述检测方法可同时检测18种高同型半胱氨酸血症相关标志物，并能够排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的技术优势。
进一步的，所述检测样本包括人血清、血浆、尿液中的任意一种。
进一步的，所述检测样本预处理的方法包括：
将检测样本加入内标准品溶液后混匀，随后离心，分离上清，得到待测样本。
进一步的，所述同型半胱氨酸生化代谢相关标志物预处理的方法包括：
分别将18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物加入内标准品溶液后混匀，随后离心，分离上清，得到同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准工作溶液；
进一步的，所述内标准品溶液的制备方法为：
将同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的同位素内标原料加入溶剂中溶解即得；
优选地，所述溶剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的质量比优选为1～9:9～1；
优选地，所述溶剂中还含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐、VC、柠檬酸，其中：溶剂中三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为1～10mg/mL；VC的浓度为0.1～10mg/mL；柠檬酸的浓度为0.1～10mg/mL。
进一步的，所述检测方法还包括采用同型半胱氨酸生化代谢相关标志物作为质控品进行质控的步骤。
作为一种优选的实施方式，所述HPLC-MS/MS检测样本的制备包括以下步骤：
1)蛋白沉淀：精密移取50μL校准品和质控品，以及血清样本，分别加入100μL内标准品，涡旋混匀3-5分钟；混匀后于4℃，4000～10000g离心5-10分钟，分离上清；
2)转移：转移100μL上清液至一干净的96孔V型板中；
3)质谱检测：将封紧的96孔U型板置于液相色谱串联质谱仪中，进行检测。
需要说明的是，本申请HPLC-MS/MS检测样本还需满足以下要求：
1、样本类型：本试剂盒适用于人血清样本，样本量要求≥0.5mL。
2、样本采集和制备：
推荐采用无添加物的采血管进行样本采集，采血时应严格登记，标记无误，确保每个样本的信息准确。样本采集后2℃～8℃储存，并于4小时内离心分离上清。
3、样本储存及运输：
已采集的样本，室温(10℃～30℃)储存不超过6h；2℃～8℃条件下储存不超过72h；-20℃±5℃条件下可稳定放置5天；样本制备后于8℃-10℃条件下可稳定放置20h。
运输样本时，必须按照有关临床样本及感染物质运输规定进行包装并添加标签。样本可以在冰袋或者干冰中运输，运输时间不要超过上述相应温度下储存时间的限制。
4、干扰：
溶血、脂血会影响样本的检测结果，采血时需引起注意。
5、注意事项：
样本使用前应恢复至室温(10～30℃)，并彻底混匀。
标准品、质控品、样本避免反复冻融超过3次。
进一步的，所述HPLC-MS/MS检测的色谱条件为：
需要说明的是，本申请采用流动相A为0.1％甲酸含20mM甲酸铵水溶液，流动相B为50％乙腈水溶液的HPLC-MS/MS检测的色谱条件；
相比于，现有的流动相A为含0.1％FA、20mM甲酸铵的水溶液，流动相B为含0.1％FA、25％甲基叔丁基醚、75％乙腈溶液的HPLC-MS/MS检测的色谱条件，由于甲基叔丁基醚挥发性强，味道刺鼻，有轻度麻醉的作用，不适宜在临床实验室推广的问题，本申请HPLC-MS/MS检测色谱条件具有环保性强的优势。
进一步的，所述HPLC-MS/MS检测的质谱条件为：
进一步的，所述步骤(c)对色谱图和质谱图进行处理的方法为：
选取任一同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的色谱图和质谱图，以该同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的标准工作溶液的浓度为自变量xi，以相应浓度标准品和内标的峰面积比值均值为因变量yi，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r；
当校准曲线的r≥0.990时，将质控品的信号强度带入回归方程，获得质控样品浓度；
当质控品的测定结果在允许范围内时，将待测样本的信号强度带入回归方程，获得待测样本中的目标物浓度。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测试剂盒，所述试剂盒包括：
同型半胱氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、胆碱、甜菜碱、二甲基甘氨酸、肌酐、非对称二甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸、甲基丙二酸、吡哆酸、核黄素、5-甲基四氢叶酸和叶酸中的一种或多种标准品；
Cre-d3、Arg-13C6、Hcy-d4、Cys-13C3、Met-d3、Bet-d9、Cho-d9、DMG-d6、Ser-13C3、Gly-13C2、15N、VB2-13C6、VB9-d5、5-MTHF-d5、VB6-d3、MMA-d4、Cth-d4、SDMA-d6、ADMA-d6中的一种或多种作为同位素内标原料；
稀释液为0.01M的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐、VC、柠檬酸；其中：磷酸盐缓冲液中三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为5mg/mL；VC的浓度为1mg/mL；柠檬酸的浓度为1mg/mL。
上述技术方案利用HPLC-MS/MS检测方法对18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行检测，并从线性、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对上述18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物在血清中的测定方法进行充分验证，所述检测方法可同时检测18种高同型半胱氨酸血症相关标志物，并能够排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的技术优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的甲基丙二酸和甲基丙二酸内标色谱图；
图2为本发明实施例1提供的吡哆酸和吡哆酸内标色谱图；
图3为本发明实施例1提供的甘氨酸和甘氨酸内标色谱图；
图4为本发明实施例1提供的丝氨酸和丝氨酸内标色谱图；
图5为本发明实施例1提供的肌酐和肌酐内标色谱图；
图6为本发明实施例1提供的同型半胱氨酸和同型半胱氨酸内标色谱图；
图7为本发明实施例1提供的甲硫氨酸和甲硫氨酸内标色谱图；
图8为本发明实施例1提供的精氨酸和精氨酸内标色谱图；
图9为本发明实施例1提供的半胱氨酸和半胱氨酸内标色谱图；
图10为本发明实施例1提供的核黄素和核黄素内标色谱图；
图11为本发明实施例1提供的叶酸和叶酸内标色谱图；
图12为本发明实施例1提供的5-甲基四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸内标色谱图；
图13为本发明实施例1提供的甜菜碱和甜菜碱内标色谱图；
图14为本发明实施例1提供的二甲基甘氨酸和二甲基甘氨酸内标色谱图；
图15为本发明实施例1提供的非对称二甲基精氨酸和非对称二甲基精氨酸内标色谱图；
图16为本发明实施例1提供的对称二甲基精氨酸和对称二甲基精氨酸内标色谱图；
图17为本发明实施例1提供的胱硫醚和胱硫醚内标色谱图；
图18为本发明实施例1提供的胆碱和胆碱内标色谱图；
图19为本发明实施例1提供的血清样本检测色谱图；
图20为本发明实施例5提供的琥珀酸和甲基丙二酸的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
注：本申请下述实施例中所使用的试剂盒的主要组成成分如下表1所示。
表1：试剂盒的主要组成：
本试剂盒未提供，但检测需要的物品如表2所示：
表2：本试剂盒未提供，但检测需要的物品：
本申请下述实施例中所使用的仪器包括：
仪器型号 仪器序列号
质谱仪 AB SCIEX TRIPLE QUADTM 4500MD
液相色谱仪 SHIMADZU LC-20AD XR
氮气发生器 Sciway氮气发生器(S18YYBN-225)
涡旋振荡器 Thermo LP Vortex Mixer(GCKT18112)
实施例1
制备同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的标准曲线：
(1)根据试剂盒提供的系列浓度工作溶液，采用血清加标方式配制标准曲线，具体为：
1、蛋白沉淀：精密移取50μL试剂盒提供的系列浓度工作溶液，分别加入100μL内标准品，涡旋混匀3-5分钟；混匀后于4℃，4000～10000g离心5-10分钟，分离上清；
2、转移：转移100μL上清液至一干净的96孔V型板中；
3、质谱检测：将封紧的96孔U型板置于液相色谱串联质谱仪中，进行HPLC-MS/MS检测。
所述HPLC-MS/MS检测的检测参数为：
离子源参数：负离子模式(0-1.4min)：
正离子模式(1.4-5.5min)：
切换阀设置：
时间(min) 切换阀位置
0 进废液
0.7 进质谱
4.7 进废液
所述HPLC-MS/MS检测的色谱条件为：
所述HPLC-MS/MS检测的质谱条件为：
所述18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物及其内标的色谱图如下：
图1为本实施例提供的甲基丙二酸和甲基丙二酸内标色谱图；其中，图1中(A)为甲基丙二酸色谱图，图1中(B)为甲基丙二酸内标色谱图；
图2为本实施例提供的吡哆酸和吡哆酸内标色谱图；其中，图2中(A)为吡哆酸色谱图，图2中(B)为吡哆酸内标色谱图；
图3为本实施例提供的甘氨酸和甘氨酸内标色谱图；其中，图3中(A)为甘氨酸色谱图，图3中(B)为甘氨酸内标色谱图；
图4为本实施例提供的丝氨酸和丝氨酸内标色谱图；其中，图4中(A)为丝氨酸色谱图，图4中(B)为丝氨酸内标色谱图；
图5为本实施例提供的肌酐和肌酐内标色谱图；其中，图5中(A)为肌酐色谱图，图5中(B)为肌酐内标色谱图；
图6为本实施例提供的同型半胱氨酸和同型半胱氨酸内标色谱图；其中，图6中(A)为同型半胱氨酸色谱图，图6中(B)为同型半胱氨酸内标色谱图；
图7为本实施例提供的甲硫氨酸和甲硫氨酸内标色谱图；其中，图7中(A)为甲硫氨酸色谱图，图7中(B)为甲硫氨酸内标色谱图；
图8为本实施例提供的精氨酸和精氨酸内标色谱图；其中，图8中(A)为精氨酸色谱图，图8中(B)为精氨酸色谱图；
图9为本实施例提供的半胱氨酸和半胱氨酸内标色谱图；其中，图9中(A)为半胱氨酸色谱图，图9中(B)为半胱氨酸内标色谱图；
图10为本实施例提供的核黄素和核黄素内标色谱图；其中，图10中(A)为核黄素色谱图，图10中(B)为核黄素内标色谱图；
图11为本实施例提供的叶酸和叶酸内标色谱图；其中，图11中(A)为叶酸色谱图，图11中(B)为叶酸内标色谱图；
图12为本实施例提供的5-甲基四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸内标色谱图；其中，图12中(A)为5-甲基四氢叶酸色谱图，图12中(B)为5-甲基四氢叶酸内标色谱图；
图13为本实施例提供的甜菜碱和甜菜碱内标色谱图；其中，图13中(A)为甜菜碱色谱图，图13中(B)为甜菜碱内标色谱图；
图14为本实施例提供的二甲基甘氨酸和二甲基甘氨酸内标色谱图；其中，图14中(A)为二甲基甘氨酸色谱图，图14中(B)为二甲基甘氨酸内标色谱图；
图15为本实施例提供的非对称二甲基精氨酸和非对称二甲基精氨酸内标色谱图；其中，图15中(A)为非对称二甲基精氨酸色谱图，图15中(B)为非对称二甲基精氨酸内标色谱图；
图16为本实施例提供的对称二甲基精氨酸和对称二甲基精氨酸内标色谱图；其中，图16中(A)为对称二甲基精氨酸色谱图，图16中(B)为对称二甲基精氨酸内标色谱图；
图17为本实施例提供的胱硫醚和胱硫醚内标色谱图；其中，图17中(A)为胱硫醚色谱图，图17中(B)为胱硫醚内标色谱图；
图18为本实施例提供的胆碱和胆碱内标色谱图。其中，图18中(A)为胆碱色谱图，图18中(B)为胆碱内标色谱图；
(2)校准标样和质控样品中的分析物浓度将以分析物与内标的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法以分析物的浓度(x)与峰面积比(y)进行线性回归，所得的回归方程(y＝ax+b)即为标准曲线。评价3条标准曲线，每天1条标准曲线，计算线性回归的相关系数r，并计算校准品的浓度与标示浓度的相对偏差。
所述18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的线性点浓度如表1、2所示：
表1：
表2：
连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果如表3所示：
表3：
(3)利用上述步骤(1)中HPLC-MS/MS检测的方法和参数对血清样本进行检测，具体检测图谱如图19所示。
图19为本实施例提供的血清样本检测色谱图；在图19中1.4min有一条竖线，0-1.4min是负离子采集模式，1.4-5.5min是正离子采集模式。
实施例2精密度评价:
根据试剂盒提供的质控溶液，每个浓度平行制备6份，分别计算测定值的平均值和标准差SD；每天制备和检测1次，以当天新制备标准曲线换算质控品浓度，连续3天，通过计算相对标准差(RSD)来评价批内批间精密度，通过相对偏差(RE)来评价批内批间准确度。结果得到以连续3天的精密度准确度实验数据，在低、高浓度下，批内精密度RSD均小于15，批间精密度RSD均小于15，精密度准确度评价满足方法学要求。
实施例3基质效应:
通过评价目标化合物在有基质和无基质中的信号值来评价基质效应。分别添加试剂盒中不同浓度水平的标准溶液到基质和纯溶剂，通过比较基质存在下目标化合物(内标)的信号强度与不含基质目标化合物(内标)的信号强度评价基质效应，最终通过内标归一化的基质因子来评价基质效应，计算公式如下：
内标归一化的基质因子＝(基质存在下分析物峰面积/内标峰面积)/(基质不存在下分析物峰面积/内标峰面积)；
基质效应结果表明，混合样本的响应值(待分析物/内标)与临床样本和标准溶液响应均值的差异小于20，说明内标与分析物的基质效应接近，可以补偿样品中分析物可能出现的基质效应，则基质效应不影响最终的准确定量分析，基质效应考察满足方法学评价要求。
实施例4稳定性评价：
将血清样品在不同储存条件(室温/-20℃冻融/-20℃储存/进样器)下放置一定的时间后进行检测，用新鲜配制的标准曲线换算浓度，计算浓度检测结果差异。实验结果表明，血清样本中VB2冻融5次、室温放置6小时、4度放置3天、进样器放置20小时合格；VB9因本身信号低，样本稳定性结果变异大，无法准确评价稳定性；胆碱Cho冻融5次、室温放置6小时、4度放置3天、进样器放置24小时合格；二甲基甘氨酸DMG冻融5次、室温放置8小时、4度放置3天、进样器放置24小时合格；剩余目标物冻融5次、室温放置8小时、4度放置5天、进样器24小时稳定性均合格。
实施例5
利用本申请实施例1中的HPLC-MS/MS检测的检测参数对甲基丙二酸及其干扰物琥珀酸进行检测，具体检测色谱图如图20所示。
图20为本实施例提供的琥珀酸和甲基丙二酸的色谱图，其中，左侧为琥珀酸和甲基丙二酸的色谱图，右侧是甲基丙二酸内标色谱图。
由图20可知，琥珀酸和甲基丙二酸互为同分异构体，液相色谱-串联质谱法是利用目标物的质荷比来进行筛选的，同分异构体因分子量相同、分子结构相似，单纯利用质荷比无法实现区分，需要额外借助色谱分离的方式，不同的出峰时间来进行准确定量。而本申请HPLC-MS/MS检测的技术方案能够有效排除血清样本中干扰物琥珀酸对甲基丙二酸检测结果影响，具有结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的技术优势。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
（a）提供检测样本以及同型半胱氨酸生化代谢相关标志物，随后将检测样本以及同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行预处理，得到待测样本和同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准工作溶液；所述检测样本包括人血清、血浆、尿液中的任意一种；
所述同型半胱氨酸生化代谢相关标志物包括同型半胱氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、胆碱、甜菜碱、二甲基甘氨酸、肌酐、非对称二甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸、甲基丙二酸、吡哆酸、核黄素、5-甲基四氢叶酸和叶酸；
（b）将待测样品和同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准溶液分别用HPLC-MS/MS进行检测，分别得到色谱图和质谱图；
所述HPLC-MS/MS检测的色谱条件为：
（c）将得到的色谱图和质谱图进行处理，对18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物进行定性和定量分析，分别得到待测样品中的18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的含量。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述检测样本预处理的方法包括：
将检测样本加入内标标准品溶液后混匀，随后离心，分离上清，得到待测样本。
3.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸生化代谢相关标志物预处理的方法包括：
分别将18种同型半胱氨酸生化代谢相关标志物加入内标标准品溶液后混匀，随后离心，分离上清，得到同型半胱氨酸生化代谢相关标志物标准工作溶液。
4.根据权利要求2或3所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述内标标准品溶液的制备方法为：
将同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的同位素内标原料加入溶剂中溶解即得。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的质量比为1~9:9~1。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述溶剂中还含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐、VC、柠檬酸，其中：溶剂中三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为1~10mg/mL；VC的浓度为0.1~10mg/mL；柠檬酸的浓度为0.1~10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用同型半胱氨酸生化代谢相关标志物作为质控品进行质控的步骤。
8.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS检测的质谱条件为：
母离子质量数(Da) 子离子质量数(Da) 驻留时间(msec) 编号 去簇电压(volts) 入口电压(volts) 碰撞能(volts) 碰撞池出口电压(volts) 1 117.1 73.1 50 MMA -30 -10 -13 -11 2 121.1 76.1 50 MMA-d4 -30 -10 -13 -11 3 182.1 138.1 50 VB6 -80 -10 -20 -11 4 185.1 141.1 50 VB6-d3 -80 -10 -20 -11 5 76.1 30.1 8 Gly 30 6 27 6 6 79.1 32.1 8 Gly-13C2、15N 30 6 15 6 7 106.1 60.1 8 Ser 30 10 33 6 8 109.1 62.1 8 Ser-13C3 30 10 17 6 9 114.1 86.1 8 Cre 30 10 30 6 10 117.1 89.1 8 Cre-d3 30 10 15 6 11 136.1 56.1 8 Hcy 50 6 25 6 12 140.1 59.1 8 Hcy-d4 50 6 25 6 13 149.6 56.1 8 Met 30 10 21 8 14 153.2 56.1 8 Met-d3 50 10 23 8 15 175.1 116.1 8 Arg 30 10 28 6 16 181.1 121.1 8 Arg-13C6 30 10 22 6 17 122.1 59.1 8 Cys 50 10 30 6 18 125.1 61.1 8 Cys-13C3 50 10 30 6 19 377.1 243.1 8 VB2 50 10 32 15 20 383.1 249.1 8 VB2-13C6 50 10 30 15 21 442.1 295.1 8 VB9 55 10 22 8 22 447.1 295.1 8 VB9-d5 55 10 22 8 23 460.2 313.2 8 5-MTHF 60 10 29 8 24 465.2 313.2 8 5-MTHF-d5 60 10 30 8 25 117.8 58.1 8 Bet 50 10 78 8 26 127.1 66.2 8 Bet-d9 50 10 70 6 27 104.1 58.1 8 DMG 50 10 40 6 28 110.1 64.1 8 DMG-d6 50 10 40 6 29 203.1 172.1 8 SDMA 50 10 30 6 30 209.2 175.1 8 SDMA-d6 50 10 19.3 6 31 203.2 46.1 8 ADMA 50 10 27 6 32 209.2 52.1 8 ADMA-d6 50 10 27 6 33 223.1 134.1 8 Cth 50 10 25 6 34 227.1 138.1 8 Cth-d4 50 10 20 6 35 104.1 60.1 8 Cho 50 10 40 6 36 113.1 66.2 8 Cho-d9 50 10 35 8
。
9.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法，其特征在于，所述步骤（c）对色谱图和质谱图进行处理的方法为：
选取任一同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的色谱图和质谱图，以该同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的标准工作溶液的浓度为自变量xi，以相应浓度标准品和内标的峰面积比值均值为因变量yi，计算线性回归方程y =ax+b和相关系数r；
当校准曲线的r≥0.990时，将质控品的信号强度带入回归方程，获得质控样品浓度；
当质控品的测定结果在允许范围内时，将待测样本的信号强度带入回归方程，获得待测样本中的目标物浓度。
CN202211074868.7A 2022-09-02 2022-09-02 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒 Active CN115436536B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211074868.7A CN115436536B (zh) 2022-09-02 2022-09-02 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211074868.7A CN115436536B (zh) 2022-09-02 2022-09-02 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115436536A CN115436536A (zh) 2022-12-06
CN115436536B true CN115436536B (zh) 2023-09-19

Family

ID=84248022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211074868.7A Active CN115436536B (zh) 2022-09-02 2022-09-02 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115436536B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010519532A (ja) * 2007-02-23 2010-06-03 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 両性イオン性固定相上でのｈｉｌｉｃを用いたメチルマロン酸およびコハク酸の質量分析的定量的検出
CN113341012A (zh) * 2021-06-01 2021-09-03 山东英盛生物技术有限公司 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014520265A (ja) * 2011-06-16 2014-08-21 ベイラー リサーチ インスティテュート 血漿分離デバイス（ｐｓｄ）から得られる血漿中の総ホモシステイン及びメチルマロン酸のｌｃ−ｍｓ／ｍｓによる分析

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010519532A (ja) * 2007-02-23 2010-06-03 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 両性イオン性固定相上でのｈｉｌｉｃを用いたメチルマロン酸およびコハク酸の質量分析的定量的検出
CN113341012A (zh) * 2021-06-01 2021-09-03 山东英盛生物技术有限公司 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Seu Ping Guiraud et al.."High-throughput and simultaneous quantitative analysis of homocysteine–methionine cycle metabolites and co-factors in blood plasma and cerebrospinal fluid by isotope dilution LC-MS/MS".《Anal Bioanal Chem》.2016,295-305. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115436536A (zh) 2022-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rafii et al. High-throughput and simultaneous measurement of homocysteine and cysteine in human plasma and urine by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry
Hampel et al. Ultra-performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry (UPLC–MS/MS) for the rapid, simultaneous analysis of thiamin, riboflavin, flavin adenine dinucleotide, nicotinamide and pyridoxal in human milk
Dai et al. Determination of serum uric acid using high-performance liquid chromatography (HPLC)/isotope dilution mass spectrometry (ID-MS) as a candidate reference method
Wallace et al. Measurement of 25-hydroxyvitamin D in the clinical laboratory: current procedures, performance characteristics and limitations
Rappaport et al. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles
Janssen et al. Multicenter comparison study of current methods to measure 25-hydroxyvitamin D in serum
Keevil Does the presence of 3-epi-25OHD3 affect the routine measurement of vitamin D using liquid chromatography tandem mass spectrometry?
Stokes et al. Development of a liquid chromatography–mass spectrometry method for the high-accuracy determination of creatinine in serum
CN106442761B (zh) 同时检测血液中维生素a和25-羟基维生素d的方法
Mena-Bravo et al. Two-dimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for vitamin D metabolite profiling including the C3-epimer-25-monohydroxyvitamin D3
Wijeyesekera et al. Quantitative UPLC-MS/MS analysis of the gut microbial co-metabolites phenylacetylglutamine, 4-cresyl sulphate and hippurate in human urine: INTERMAP Study
WO2009100229A1 (en) Methods for analysis of vitamins
CN113125601B (zh) 一种同时检测血清中4种脂溶性维生素的浓度的方法
CN109387573A (zh) 一种液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备
CN105911160A (zh) 血清或血浆中25-羟基维生素d液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒
CN113720946A (zh) 检测血液中多种类固醇激素的方法及试剂盒
CN106153712B (zh) 一种多肽二硫键的定位方法
Stevens et al. Determination of vitamins D2 and D3 in infant formula and adult nutritionals by ultra-pressure liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection (UPLC-MS/MS): First Action 2011.12
Higashi et al. Stable isotope-dilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for determination of thyroxine in saliva
CN110927310A (zh) 同时检测微量血中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法
CN112903855B (zh) 高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素k1的方法
CN115436536B (zh) 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒
CN116399982A (zh) 一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法
Nakazato et al. Blood folate concentrations analyzed by microbiological assay and chemiluminescent immunoassay methods
CN110361488A (zh) 一种血液中拉莫三嗪药物浓度监测试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant