CN112903855B - 高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素k1的方法 - Google Patents

高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素k1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微量化合物检测技术领域，涉及一种高效液相色谱‑串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，包括：配制维生素K1对照品储备液和Vitamin K1‑d4标准溶液；取血清样品，加入Vitamin K1‑d4标准溶液，预处理后，加入PTAD衍生液，孵育，加入乙醇，振荡、吹干，再用甲醇复溶，取上清溶液，进行HPLC－MS/MS分析，即得；所有操作在避光条件下进行。用于临床上维生素K1的浓度监测。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素K1离子对，对其进行浓度定量。本发明通过衍生化反应后，增强了维生素K1稳定性、离子化效率，大大提高了维生素K1的检测灵敏度，能大幅度的节约仪器成本。且对方法进行了性能验证，方法稳定性好。

Description

高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的 方法
技术领域
本发明属于微量化合物检测技术领域，具体涉及一种用于高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
维生素K，又名叶绿醌，在食物、人体中广泛存在。维生素K1是治疗维生素K缺乏症及低凝血酶原症的常用药物，是促凝的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和抗凝的蛋白C、S非活性前体的翻译后修饰所必须的物质，能促进血液凝固；若维生素K1缺乏则会导致维生素K1反应性凝血酶原时间延长，主要症状为凝血障碍，在严重情况下，可引起出血。
目前检测维生素K1的方法有液相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法、高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法等，由于LC-MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度等优势，它已经成为检测血清中维生素K1浓度的最主要方法。目前该分析技术已越来越广泛地用于临床检验实验室中对维生素K1的分析。
检测维生素K1最大的难度在于人体内维生素K1含量低，人血清参考的正常人范围是0.1-2.2ng/mL，大部分人血清或血浆样本检测结果仅有几百pg/mL，这就对分析仪器的灵敏度提出了更高的要求，同时购买仪器的成本也会大大增加。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种用于高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法。一用于临床上维生素K1的浓度监测。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素K1离子对，对其进行浓度定量。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，包括：
配制维生素K1对照品储备液和Vitamin K1-d4标准溶液；
取血清样品，加入Vitamin K1-d4标准溶液，预处理后，加入PTAD衍生液，孵育，加入乙醇，振荡、吹干，再用甲醇复溶，取上清溶液，进行HPLC－MS/MS分析，以内标法测定血清样品中维生素K1的含量；
所有操作在避光条件下进行。
为了获得更高灵敏度，本发明从前处理出发，使用了PTAD试剂(4位取代的1,2,3-三唑啉-3,5-二酮)对维生素K1进行衍生化反应。PTAD试剂在维生素D衍生化中已有应用，衍生化法显著提高了维生素D的灵敏度，我们在实验中发现PTAD试剂也能使维生素K1发生衍生反应。维生素D的衍生化过程是维生素D与PTAD进行了Diels–Alder反应，即共轭双烯与取代烯烃反应生成取代环己烯。维生素K1是一种多环芳香酮，不含有VD的共轭双烯结构，其与PTAD的反应推测是发生了迈克尔加成反应。同时配合流动相中加入甲铵，会形成更易离子化的[M+CH3NH3]+峰，解决了维生素K1在电喷雾电离(ESI)模式下很难被电离的问题，从而大大提高分析的灵敏度(提高达50倍)。具体反应过程见下图，维生素K1六元环上2号位碳原子受到长链烃的电负性影响，双键电子云偏向2号位碳原子。PTAD结构上的偶氮基团受到羰基的影响，双键电子云偏向两边的氮原子。维生素K1六元环上2号位碳原子与PTAD偶氮基团的其中一个氮原子发生迈克尔加成反应，甲胺随之在电离过程中与偶氮基团上的另外一个氮原子反应，最终生成如下产物。
Figure BDA0002912033550000031
本发明的第二个方面，提供了PTAD衍生液在高效液相色谱-串联质谱法定量检测维生素K1中的应用。
本发明的第三个方面，提供了PTAD衍生液在提高了维生素K1的高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明建立了一种高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)测定血清中衍生后维生素K1浓度的方法，用于临床上维生素K1的浓度监测。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素K1离子对，对其进行浓度定量。
(2)本发明通过衍生化反应后，增强了维生素K1稳定性、离子化效率，大大提高了维生素K1的检测灵敏度，能大幅度的节约仪器成本。且对方法进行了性能验证，方法稳定性好。
(3)本发明的检测方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实验例1衍生及非衍生维生素K1信号对比图；
图2是本发明实验例1衍生维生素K1子离子碎片断裂处图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释
本发明中，“PTAD”是指：4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮。
本发明建立了一种高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)测定血清中衍生后维生素K1浓度的方法，用于临床上维生素K1的浓度监测。将血清提取后进行衍生化反应，然后用质谱扫描衍生后的维生素K1离子对，对其进行浓度定量。
维生素K1(对照品)，纯度:99.6％；vitamin K1－d4(内标)，纯度:99.8％。
仪器：YS EXT 9050MD高效液相色谱串联质谱检测系统。
飞诺美Kinetex C18色谱柱(2.1mm×50mm，2.7μm)；流动相:水(A)－10mM甲胺的甲醇(B)；柱温:40℃；流速:0.5mL/min。梯度洗脱:0～1.0min，60％B，3.0～5.0min，98％B，5.5～7min，60％B。
衍生后的维生素K1和内标(vitamin K1－d4)的检测离子对分别为m/z 657.3→187.3和m/z 661.3→191.3；透镜电压分别为130V，135V；碰撞电压分别为38V，40V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。
对照品储备溶液维生素K1系列标准溶液的配制：取维生素K1标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL维生素K1储备液。Vitamin K1-d4标准溶液的配制：取vitamin K1－d4标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL内标储备液。临用时，用甲醇稀释至所需浓度。
血清样本处理：取血清样品200μL，加入内标溶液(100ng/mL)2μL，涡旋30s，加入甲醇600μL沉淀蛋白，涡旋1min，加入正己烷1mL液液萃取，以8000rpm离心5min，取上清溶液，放入玻璃小管，氮气吹干，加入浓度为0.025mg/mL PTAD衍生液50μL，50℃恒温振荡孵育30min，加入20μL无水乙醇振荡1min，氮气吹干，加入甲醇50μL复溶，再取上清溶液转入进样小瓶，进行HPLC－MS/MS分析，所有操作在避光条件下进行。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，“PTAD衍生液”的品牌为TCI，用乙腈溶解。
实施例1：
维生素K1(对照品)，纯度:99.6％；vitamin K1－d4(内标)，纯度:99.8％。
仪器：YS EXT 9050MD高效液相色谱串联质谱检测系统。
色谱柱：飞诺美Kinetex C18色谱柱(2.1mm×50mm，2.7μm)；流动相:流动相(A)：水；流动相(B)：10mM甲胺的甲醇；柱温:40℃；流速:0.5mL/min。梯度洗脱:0～1.0min，60％B，3.0～5.0min，98％B，5.5～7min，60％B。
衍生后的维生素K1和内标(vitamin K1－d4)的检测离子对分别为m/z 657.3→187.3和m/z 661.3→191.3；透镜电压分别为130V，135V；碰撞电压分别为38V，40V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350℃、正离子电压3500V。
对照品储备溶液维生素K1系列标准溶液的配制：取维生素K1标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL维生素K1储备液。Vitamin K1-d4标准溶液的配制：取vitamin K1－d4标准品10mg，置于10mL容量瓶中，并加入甲醇10mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL内标储备液。临用时，用甲醇稀释至所需浓度。
血清样本处理：取血清样品200μL，加入内标溶液(100ng/mL)2μL，涡旋30s，加入甲醇600μL沉淀蛋白，涡旋1min，加入正己烷1mL液液萃取，以8000rpm离心5min，取上清溶液，放入玻璃小管，氮气吹干，加入浓度为0.025mg/mL PTAD衍生液50μL，50℃恒温振荡孵育30min，加入20μL无水乙醇振荡1min，氮气吹干，加入甲醇50μL复溶，再取上清溶液转入进样小瓶，进行HPLC－MS/MS分析，所有操作在避光条件下进行。
可行性分析
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对检测限、定量限、精密度、准确度、提取回收率。
线性关系及检测限、定量限：取维生素K1标准溶液与牛血清白蛋白(BSA)精确配制6.0ng/mL，用BSA倍比稀释一系列不同浓度的标准曲线浓度。提取方法与样本相同，以维生素K1/vitamin K1–d4与浓度的峰面积比构建校准曲线，得到回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限，得到维生素K1的检出限和定量限，结果见表1。
表1人血清中测定维生素K1含量方法的线性、检测限和定量限
化合物 线性方程 R<sup>2</sup> 定量限 检出限
VK1 y＝6.0025x+0.1883 0.9862 0.60 0.20
VK1-PTAD y＝5.9848x+0.2505 0.9955 0.1 0.03
灵敏度对比：相同浓度下(1ng/mL)维生素K1非衍生与衍生结果对比，经过衍生化后，维生素K1的信号提高50倍以上。衍生后的物质在色谱柱上的保留较非衍生的维生素K1有所改变，衍生后的物质极性变强，出峰时间提前，衍生与非衍生物质的保留时间均与其内标一致，具体结果见图1。
精密度：在同一天对四种浓度(0.1、0.25、2.0和10ng/mL)的六个重复的最低定量限(LLOQ)样本和质控(QC)样本进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中维生素K1的精密度和准确度结果见表2。维生素K1各样品水平的精密度(RSD)均小于15％。对维生素K1各样品水平的准确度在85％到115％之间。测定值均在可接受范围内。
表2人血清中测定维生素K1含量方法的精密度和准确度
Figure BDA0002912033550000081
提取回收率：选择临床样品，将其分为体积相同的3份，每份200μL。在其中1份样本中加入10μL不含待测物的空白试剂(甲醇色谱级或以上)，作为基础样本；而在另2份样本中各加入10μL不同浓度的待测物标准品溶液，加入后样本中的标准液浓度见表3，制成2个不同加入浓度的回收样本。要求加入标准液后低水平样本中的待测物在参考范围中间值附近，而高水平样本中的待测物达到参考范围上限。不同浓度下维生素K1的提取回收率结果准确、重现性好。
表3人血清中测定维生素K1含量方法的提取回收率
Figure BDA0002912033550000082
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，包括：
配制维生素K1对照品储备液和Vitamin K1-d4标准溶液；
取血清样品，加入Vitamin K1-d4标准溶液，预处理后，加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮衍生液，孵育，加入乙醇，振荡、吹干，再用甲醇复溶，取上清溶液，进行HPLC－MS/MS分析，以内标法测定血清样品中维生素K1的含量；
所有操作在避光条件下进行。
2.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，所述预处理的具体步骤为：均质后，沉淀蛋白，再加入正己烷萃取、固液分离，取上清液，氮气吹干后，即得。
3.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，色谱柱为C18色谱柱。
4.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，流动相A：水；流动相B：10～12mM甲胺的甲醇。
5.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，色谱柱的柱温:40～45℃；流速:0.5～1mL/min。
6.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，梯度洗脱:0～1.0min，60％流动相B，3.0～5.0min，98％流动相B，5.5～7min，60％流动相B；
所述流动相B为10～12mM甲胺的甲醇。
7.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，衍生后的维生素K1和内标vitamin K1－d4的检测离子对分别为m/z 657.3→187.3和m/z 661.3→191.3。
8.如权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱法定量检测衍生后的维生素K1的方法，其特征在于，透镜电压分别为130～135V，135～140V；碰撞电压分别为38～40V，40～42V；采用电喷雾ESI源正离子方式，离子源温度350～360℃、正离子电压3500～3600V。
9.4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮衍生液在高效液相色谱-串联质谱法定量检测维生素K1中的应用。
10.4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮衍生液在提高了维生素K1的高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度中的应用。
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