CN116381113B - 干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及脂溶性维生素检测的技术领域，尤其是涉及干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法。该方法采用液相色谱与质谱的方法对样本进行检测，采用同位素内标定量法，利用工作站软件(Analyst MD)以标准品的浓度与内标物的浓度比为X轴，标准品的峰面积与内标物的峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算出待测维生素的浓度；质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，五种维生素MRM参数的主要区别在于每种维生素的Q1和Q3的数值不同。该方法能够同时检测出干血片中的五种脂溶性维生素，提高检测结果的准确性和有效性。
Description
技术领域
本申请涉及脂溶性维生素检测的技术领域，尤其是涉及干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
液相色谱串联质谱(LCMSMS)检测技术具有灵敏度高、检测干扰少、定量结果准确等优点，已经成为当下首选的检测工作，并被公认为检测行业的金标准。目前，该检测技术也越来越多的应用于医疗检测行业，对于一些含量低、检测干扰大、无法被准确检测的项目，液相色谱串联质谱(LCMSMS)检测技术具有明显的优势。
在医疗检测行业，最常用的检测样品就是血液，但很多检测项目在血液样本中并不稳定，为了保证检测项目浓度的稳定，需要在血液中添加稳定剂，并储存在-18℃甚至更低的温度中。这对样本的保存和运输造成了很多不便。近年来使用干血片来保存全血样本也成为了研究热点，特别是在新筛领域，干血片采血已经成为常规的样本保存方式。这是因为干血片样本只需要保存在冷藏避光条件下即可保证稳定，极大方便了血液样本的保存和运输。对于检测而言，样本的保存技术也非常关键。
干血片样品作为血液样本的载体，其中干血片样品中同时含有维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E及维生素K1这五种脂溶性维生素。其中，干血片样品中检测25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的文章比较多，现有技术中，对25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的检测，主要是分为两种途径：第一种是直接提取后检测，这种检测方式对样本量要求多，主要用于血清样本的检测；第二种是提取后通过PTAD衍生后检测。因为后者在衍生后可以提高在液相色谱串联质谱仪的灵敏度，所以对于干血片样品的检测更具有实际意义。其中，对于维生素A、维生素E、维生素K1的检测主要见于对血清样本的检测，而干血片样品中检测维生素K1的文章还没有出现。也就是说，针对干血片中维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E及维生素K1同时检测的方法暂未发现。
此外，对于干血片中物质含量的检测，现有技术普遍采用的是将干血片直接用有机试剂提取，这种提取方法无法将已经与干血片纤维结合的血液基质完全清洗下来，造成了回收率并不高，对于25-羟基维生素D2、维生素K1这两种含量特别低物质，回收率的变化直接影响了检测结果的准确性和有效性。
发明内容
为了同时检测出干血片中的五种脂溶性维生素，提高检测结果的准确性和有效性，本申请提供干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法。
本申请提供的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法采用如下的技术方案：
干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，包括采用液相色谱与质谱的方法对样本进行检测，采用同位素内标定量法，利用工作站软件(AnalystMD)以标准品的浓度与内标物的浓度比为X轴，标准品的峰面积与内标物的峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算出待测维生素的浓度；质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，其中，质谱的MRM参数参见表5；
表5质谱的MRM参数
通过采用上述技术方案，针对干血片中提取出的微量样品进行检测，同时检测出五种脂溶性维生素。
可选的，干血片在检测前进行样本前处理，步骤为：
(1)取样:用3-6mm打孔器在干血片样品上打孔，取一片进行处理；
(2)复原:将干血片中加入200μL含抗氧化剂及内标的提取液，震荡1min，静置20min后，再震荡提取10min，将干血片中已干燥的血液提取到提取液中，复原为液体状态；
(3)沉淀：加入400μL沉淀剂，将样本中的蛋白质进行沉淀，去除干扰，进行净化；
(4)萃取：加入1mL萃取剂，震荡5min后，10000rpm下离心分层，取上层液体，在40℃以下，用氮气吹干；
(5)衍生化：将50μL衍生化试剂加入到吹干后的残渣中，45℃下反应15min后，加入50μL反应终止剂，涡旋混匀后上机。
通过采用上述技术方案，在干血片检测之前进行样本前处理，能够将干血片中的血液完全清洗下来，使得干血片中的基质恢复为近似血液的液体状态，解决了干血片样本回收率不稳定的问题，提高检测效率。
可选的，五种维生素的内标物分别为：200ng/mL维生素A-d6、10ng/mL 25-羟基维生素D2-d3、40ng/mL 25-羟基维生素D3-d3、2000ng/mL维生素E-d6和4ng/mL维生素K1-d7。
通过采用上述技术方案，五种维生素的内标物能够辅助五种维生素的标准品制作标准曲线，对待测样品进行更准确的含量测定。
可选的，含抗氧化剂及内标的提取液为：取2mL含0.1％L-抗坏血酸的水溶液,加入100μL内标物的混合溶液，混合均匀。
通过采用上述技术方案，能够有效溶解内标物，同时能够防止内标物氧化，提高检测方法的准确性。
可选的，沉淀剂为乙腈，萃取剂为正己烷，衍生化试剂为1000ug/mL的4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮乙腈溶液，终止剂为甲醇。
通过采用上述技术方案，乙腈能够将干血片中的蛋白质沉淀下来，去除蛋白质对检测结果的干扰，正己烷能够有效将干血片中的五种维生素提取出来，PTAD能够对干血片中的五种维生素进行衍生化，起到放大信号的作用，甲醇能够有效终止五种维生素与PTAD的反应。
可选的，质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，气帘气(CUR)为30，碰撞气(CAD)为6，温度为550℃，电压为5500，离子源气流(GS1)为75，(GS2)为80；
表5中质谱的MRM参数还包括以下内容：
通过采用上述技术方案，质谱设置的MRM参数能够测定样品中各个物质的质荷比，推测出物质的化学结构式，从而鉴别出五种维生素。
可选的，液相色谱采用的色谱柱为C18，3.0mm×50mm，3um。
通过采用上述技术方案，对样品中的维生素进行分离。
可选的，液相色谱条件为：流动相A为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的水溶液，流动相B为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的甲醇溶液，柱温40℃，进样量为10μL，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱的参数参见表4；
表4梯度洗脱参数
| 时间(min) | 流速(μL/min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.1 | 600 | 30 | 70 |
| 1 | 600 | 10 | 90 |
| 3 | 600 | 0 | 100 |
| 6 | 600 | 0 | 100 |
| 6.1 | 600 | 30 | 70 |
| 7 | 600 | 30 | 70 |
维生素A衍生物的保留时间为：1.79min，25-羟基维生素D2衍生物的保留时间为：1.90min，25-羟基维生素D3衍生物的保留时间为：1.85min，维生素E衍生物的保留时间为：3.58min，维生素K1衍生物的保留时间为：4.66min。
通过采用上述技术方案，将样品中的五种维生素分别洗脱分离下来，并通过保留时间判断每种维生素的峰。
可选的，干血片包括五种维生素的标准品干血片、高低质控品干血片和待测样本干血片。
通过采用上述技术方案，标准品干血片用于制作标准曲线，高低质控品干血片用于评价检测方法的质量，待测样本干血片用于验证检测方法。
可选的，五种维生素的标准品干血片、高低质控品干血片均采用合成血液配制标准品和高低质控品溶液进行制备，合成血液的成分为羧甲基纤维素钠2g、L-抗坏血酸1.0g、吐温20 0.04g、氯化钠2.4g、苋菜红1.0g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠4.3g，加蒸馏水至1L。
通过采用上述技术方案，合成血液能够有效的模拟还原血液的状态，提高方法检测的准确性。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益效果：
1、采用PTAD(4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮)的衍生化方法，创新性的建立了维生素A和维生素E衍生化产物的MRM检测条件，使得该方法能够同时检测出干血片中的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E及维生素K1，解决了干血片中的五种脂溶性维生素无法同时检测的问题。
2、该方法采用水系溶液将干血片中的基质恢复为近似血液的液体状态，有利于提高干血片中物质的提取效率和检测结果的可靠性，解决了干血片样本回收率不稳定的问题，并提高了检测效率。
3、该方法不仅用于干血片样品的检测，也可以用于微量血清样本的检测。
4、该方法操作步骤简化，衍生完毕后无需再次氮吹吹干，可直接上机操作。
附图说明
图1是维生素A标准品的标准曲线图；
图2是25-羟基维生素D2标准品的标准曲线图；
图3是25-羟基维生素D3标准品的标准曲线图；
图4是维生素E标准品的标准曲线图；
图5是维生素K1标准品的标准曲线图；
图6是维生素A标准品的液相色谱图；
图7是25-羟基维生素D2标准品的液相色谱图；
图8是25-羟基维生素D3标准品的液相色谱图；
图9是维生素E标准品的液相色谱图；
图10是维生素K1标准品的液相色谱图；
图11是五种维生素标准品混合后的液相色谱图；
图12是表8中SAM5中维生素A的液相色谱图；
图13是表8中SAM5中25-羟基维生素D2的液相色谱图；
图14是表8中SAM5中25-羟基维生素D3的液相色谱图；
图15是表8中SAM5中维生素E的液相色谱图；
图16是表8中SAM5中维生素K1的液相色谱图；
图17是维生素A与PTAD的衍生化反应示意图；
图18是25-羟基维生素D2与PTAD的衍生化反应示意图；
图19是25-羟基维生素D3与PTAD的衍生化反应示意图；
图20是维生素E与PTAD的衍生化反应示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下结合附图1-20对本申请作进一步详细说明。
本申请实施例公开了干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法。
1、制备五种维生素的标准品干血片以及高低质控品干血片
(1)配制合成血液:称取羧甲基纤维素钠2g、L-抗坏血酸1.0g、吐温20 0.04g、氯化钠2.4g、苋菜红1.0g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠4.3g，加蒸馏水至1L,用表面张力仪测定溶液的表面张力0.042±0.002N/m。
(2)使用以上配制的合成血液按照表1配制五种维生素的标准品溶液。
表1五种维生素标准曲线的浓度
(3)使用以上配制的合成血液按照表2配制五种维生素的高低质控品溶液。
表2五种维生素高低质控品的制备浓度
(4)选择WHATMAN 903号为采集纸的干血片采集卡，使用移液枪分别吸取以上五种维生素的各个标准品溶液以及各个高低质控的溶液，分别滴到采集卡的圆圈内，保证正面背面浸透完全且覆盖整个圆圈，然后将每个制备的干血片置于阴凉处避光自然干燥，防止污染。干燥后至于密封袋内，4℃以下保存。
2、样本前处理
(1)取样:用3-6mm打孔器在干血片样品上打孔，取一片进行处理。
(2)复原:将干血片中加入200μL含抗氧化剂及内标的提取液，震荡1min，静置20min后，再震荡提取10min，将干血片中已干燥的血液提取到提取液中，复原为液体状态。
(3)沉淀：加入400μL沉淀剂，将样本中的蛋白质进行沉淀，去除干扰，进行净化。
(4)萃取：加入1mL萃取剂，震荡5min后，10000rpm下离心分层，取上层液体，在40℃以下，用氮气吹干。
(5)衍生化：将50μL衍生化试剂加入到吹干后的残渣中，45℃下反应15min后，加入50μL反应终止剂，涡旋混匀后上机。
以上步骤中参与的具体试剂如下：
内标物：本发明分别采用五种维生素的同位素作为内标，用甲醇配制成混合溶液，五种同位素内标物的浓度如表3所示：
表3五种维生素的同位素内标
| 同位素内标名称 | 内标浓度(ng/mL) |
| 维生素A-d6 | 200 |
| 25-羟基维生素D2-d3 | 10 |
| 25-羟基维生素D3-d3 | 40 |
| 维生素E-d6 | 2000 |
| 维生素K1-d7 | 4 |
含抗氧化剂及内标物的提取液：取2mL含0.1％L-抗坏血酸的水溶液,加入100μL内标物的混合溶液，混合均匀，现用现配。
沉淀剂：乙腈
萃取剂：正己烷
衍生化试剂：1000ug/mL的4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮乙腈溶液
终止剂：甲醇
3、液相色谱串联质谱检测五种维生素的标准品和内标物
检测方法为液相色谱串联质谱法，其中质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，使用的仪器名称为液相色谱串联质谱仪，仪器的型号为AB SCIEX 4500MD，仪器的厂家为美国AB SCIEX。
(1)液相色谱条件为：色谱柱：C18，3.0mm×50mm，3um，流动相A为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的水溶液，流动相B为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的甲醇溶液，柱温40℃，进样量为10μL，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱的参数如表4所示。
表4梯度洗脱参数
| 时间(min) | 流速(μL/min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.1 | 600 | 30 | 70 |
| 1 | 600 | 10 | 90 |
| 3 | 600 | 0 | 100 |
| 6 | 600 | 0 | 100 |
| 6.1 | 600 | 30 | 70 |
| 7 | 600 | 30 | 70 |
由图6-图10的液相色谱图可知，维生素A衍生物的保留时间为：1.79min，25-羟基维生素D2衍生物的保留时间为：1.90min，25-羟基维生素D3衍生物的保留时间为：1.85min，维生素E衍生物的保留时间为：3.58min，维生素K1衍生物的保留时间为：4.66min。
(2)质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，气帘气(CUR)为30，碰撞气(CAD)为6，温度为550℃，电压为5500，离子源气流(GS1)为75，(GS2)为80。MRM参数如表5所示。
表5质谱的MRM参数
4、采用内标法建立五种维生素标准品的标准曲线
采用内标定量法，利用工作站软件以每个标准品中的各个的浓度与内标物的浓度比为X轴，检测的标准品的峰面积与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，从而计算出样品中的待测物浓度。线性回归方程及线性相关系数如表6所示。
表6五种维生素标准曲线的线性回归方程及线性相关系数
| 名称 | 线性回归方程 | 相关系数(r) |
| 维生素A | y＝0.0463x+0.0317 | 0.999 |
| 25-羟基维生素D2 | y＝0.682x+0.0279 | 0.9996 |
| 25-羟基维生素D3 | y＝0.701x+0.0285 | 0.9983 |
| 维生素E | y＝0.0351x+0.2666 | 0.9996 |
| 维生素K1 | y＝1.49x+0.0203 | 0.9985 |
由表6可知，建立的标准曲线，相关系数在0.99以上，线性良好，可以满足定量要求。
5、准确度及精密度的考察
采用五种维生素的高低值质控品来考察批内、批间精密度，并用检测结果与高低值质控品的理论靶值的相对误差RE来考察结果的准确性。
表7五种维生素检测结果的批内、批间精密度
通过三批次的数据进行分析，批内精密度在1.46％9.26％之间，批间精密度在2.53％7.52％之间，与靶值的相对误差范围为-10.3％9.40％。
本发明还采集了52例人血制备成的干血片临床样品，进行定量检测，检测结果如表8所示：
表8人血制备成的干血片中五种脂溶性维生素的检测结果
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通过分析检测结果及图12-图16，该方法可以对干血片样本进行检测，且峰形良好，无干扰峰存在，因此可以用于干血片中维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E及维生素K1浓度的准确检测。
本具体实施例是对本申请的说明，但其并不是对本申请的限制，在本申请的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，都应属于本申请的保护范围，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：包括采用液相色谱与质谱的方法对样本进行检测，采用同位素内标定量法，利用工作站软件以标准品的浓度与内标物的浓度比为X轴，标准品的峰面积与内标物的峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算出待测维生素的浓度；所述五种脂溶性维生素为：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1，质谱采用的是多反应监测MRM扫描方式，其中，质谱的MRM参数如下表所示；
质谱的MRM参数
液相色谱采用的色谱柱为C18，3.0mm×50mm，3μm，液相色谱条件为：流动相A为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的水溶液，流动相B为含有0.05％甲酸、2mM甲胺的甲醇溶液，柱温40℃，进样量为10μL，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱的参数如下表所示；
梯度洗脱参数
干血片在检测前进行样本前处理，步骤为：
(1)取样：用3-6mm打孔器在干血片样品上打孔，取一片进行处理；
(2)复原：向干血片中加入200μL含抗氧化剂及内标的提取液，震荡1min，静置20min后，再震荡提取10min，将干血片中已干燥的血液提取到提取液中，复原为液体状态；
(3)沉淀：加入400μL沉淀剂，将样本中的蛋白质进行沉淀，去除干扰，进行净化；
(4)萃取：加入1mL萃取剂，震荡5min后，10000rpm下离心分层，取上层液体，在40℃以下，用氮气吹干；
(5)衍生化：将50μL衍生化试剂加入到吹干后的残渣中，45℃下反应15min后，加入50μL反应终止剂，涡旋混匀后上机；
含抗氧化剂及内标的提取液为：取2mL含0.1％L-抗坏血酸的水溶液，加入100μL内标物的混合溶液，混合均匀；
沉淀剂为乙腈，萃取剂为正己烷，衍生化试剂为1000μg/mL的4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮乙腈溶液，终止剂为甲醇。
2.根据权利要求1所述的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：五种维生素的内标物分别为：200ng/mL维生素A-d6、10ng/mL 25-羟基维生素D2-d3、40ng/mL 25-羟基维生素D3-d3、2000ng/mL维生素E-d6和4ng/mL维生素K1-d7。
3.根据权利要求1所述的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，气帘气为30，碰撞气为6，温度为550℃，电压为5500，离子源气流：GS1为75，GS2为80；
质谱的MRM参数还包括以下内容：
4.根据权利要求1所述的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：维生素A衍生物的保留时间为：1.79min，25-羟基维生素D2衍生物的保留时间为：1.90min，25-羟基维生素D3衍生物的保留时间为：1.85min，维生素E衍生物的保留时间为：3.58min，维生素K1衍生物的保留时间为：4.66min。
5.根据权利要求1所述的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：干血片包括五种维生素的标准品干血片、高低质控品干血片和待测样本干血片。
6.根据权利要求5所述的干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：五种维生素的标准品干血片、高低质控品干血片均采用合成血液配制标准品和高低质控品溶液进行制备，合成血液的成分为羧甲基纤维素钠2g、L-抗坏血酸1.0g、吐温20 0.04g、氯化钠2.4g、苋菜红1.0g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠4.3g，加蒸馏水至1L。
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| CN116381113A (zh) | 2023-07-04 |
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