CN113588826A - 一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，先对试样用甲酸的乙腈溶液进行提取，然后用无水硫酸钠除水，再将得到的上清液吹干，通过乙腈的水溶液溶解残渣，经涡旋振荡过滤，形成待测液，利用高效液相色谱串联质谱仪测定待测液和混合标准工作液中的兴奋剂，通过得到的谱图信息进行比对，判断试样中存在相应的目标物；根据兴奋剂和对应内标物的峰面积，结合各个待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用外标法定量，求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量，采用内标法定量可求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量。

Description

一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法
技术领域
本发明涉及兴奋剂检测技术领域，具体为一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法。
背景技术
大型体育赛事活动中，运动员尿检主要是检测尿液中蛋白同化制剂、β2-激动剂、糖皮质激素和利尿剂等兴奋剂。因为人体内新陈代谢产生的产物，主要通过肾脏的解毒后随尿液排出体外。作为运动员的营养供给，各类畜禽肉必须摄入，而监测畜禽肉是否含有兴奋剂的重要途径就是监测动物体液中兴奋剂的含量。动物体液相对于其他肌体组织，具有宰前检测、日常可监控等优点。因此检验动物体液中的兴奋剂含量，可以有效监控动物饲料、动物肌体组织中的兴奋剂含量，保护运动员的身心健康。兴奋剂种类繁多，结构差异大，并且随着时间的推移不断有新的兴奋剂涌现。
动物体液由于成分复杂，所以需要进行前处理，才能去除干扰物质，但是目前还没有相关的处理方式。另外，兴奋剂本身的检测技术也在不断发展中。为有效解决某些兴奋剂检测过程中需要衍生化、操作复杂、检测周期长、灵敏度较差等问题，目前已经采用更为先进的、灵敏度更高的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用检测方法，但是关于β2-激动剂兴奋剂、蛋白同化制剂类兴奋剂、糖皮质激素兴奋剂和利尿剂类兴奋剂这48种常见兴奋剂的检测方法还没有相关报道，
因此，目前在动物体液前处理和48种常见兴奋剂的检测方面均无相关的报道，所以造成了动物体液中常见的48种兴奋剂无法同时进行检测的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，实现了对动物体液中48种兴奋剂同时进行检测。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，所述同时检测的四十八种兴奋剂为克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、肾上腺素、普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、克仑丙罗、曲托喹酚、去甲乌药碱、美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地酮、群勃龙、睾酮、β-玉米赤霉醇、泽仑诺、齐帕特罗、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、可的松、氢化可的松、乙酰唑胺、坎利酮、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、卞氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氨苯蝶啶和4-氨基-6-氯苯-1，3二磺酰胺，包括如下步骤：
步骤1，在试样中加入与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质形成的混合同位素内标中间液，之后用甲酸的乙腈溶液进行提取，然后用无水硫酸钠除水，试样、甲酸的乙腈溶液和无水硫酸钠的比例为(4.88～5.12)mL：10mL：(2.5～4.5)g，从得到的提取液中分离出上清液，然后将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，合并得到上清液，将上清液吹干，将得到的残渣用乙腈的水溶液溶解，最后依次涡旋振荡、过滤，得到待测液；
步骤2，将待测液用高效液相色谱串联质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；
将由所述的四十八种兴奋剂标准物质、与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质和所述动物体液对应的空白基质配制的混合标准工作液，用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中除倍他米松和地塞米松外所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；
将步骤2所述的四种待测液按照相同的条件，分别用BEH C18色谱柱串联质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；将该谱图信息与混合标准工作液对应的谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中倍他米松和地塞米松的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中倍他米松、地塞米松对应的内标物的峰面积；
步骤4，结合以下两种方式，完成动物体液中四十八种兴奋剂的同时检测；
结合待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用外标法，求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量；
结合待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用内标法，求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量。
优选的，步骤1中所述的甲酸的乙腈溶液中甲酸占整个溶液体积的1％，并按如下方式对所述的试样进行提取：
先加入甲酸的乙腈溶液涡旋振荡10～25min，之后加入无水硫酸钠涡旋振荡2～5min，最后在7000～8000r/min下离心3～6min。
优选的，步骤1用氮气在30～45℃下对上清液进行吹干。
优选的，步骤2采用如下过程配制混合标准工作液：
先采用权利要求1步骤1中对应的过程对所述动物体液对应的空白基质进行提取，得到空白基质提取液，在空白基质提取液中加入由所述的四十八种兴奋剂标准物质配制的混合标准使用液和由所述的四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制的混合同位素内标中间液，涡旋混匀，吹干后加入乙腈的水溶液溶解，最后依次涡旋振荡和过滤，得到混合标准工作液。
优选的，步骤2中所述的C18色谱柱中，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为甲酸的甲醇溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，梯度洗脱程序如下：
0～1min内，流动相A的体积比例保持95％；1～2min内，流动相A的体积比例由95％线性减小至80％；2～6min内，流动相A的体积比例由80％线性减小至40％；6～8min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至20％；8～8.5min内，流动相A的比例由20％线性减小至10％，8.5～10.5min内，流动相A的比例保持10％，10.5～11min内，流动相A的体积比例由10％线性增加至95％，11～15min内，流动相A的比例保持95％；
步骤3中所述的BEH C18色谱柱中，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：
0～15min内，流动相A的体积比例保持75％；15～15.1min内，流动相A的体积比例由75％线性减小至20％；15.1～20min内，流动相A的体积比例保持20％；20～20.1min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至75％；20.1～25min内，流动相A的比例保持75％。
优选的，步骤2和步骤3中所述的质谱仪采用如下参数进行工作：
离子源为电喷雾离子源，ESI+下的喷雾电压为3.5kv，ESI-下的喷雾电压为2.5kv，扫描方式为多反应监测，离子传输管温度为350℃，雾发温度为350℃，鞘气压力为40Arb，辅助气压为10Arb，吹扫气压力为0Arb。
优选的，步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比。
优选的，步骤3在进行谱图信息比对时，采用如下标准：
待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3。
优选的，步骤4采用如下公式求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量：
Figure BDA0003190406070000051
式中：
Xi为试样中所述各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；
c为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的含量，单位为ng/mL；
A为测试液中各个待测兴奋剂的峰面积；
As为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的峰面积；
V为样液的提取体积，单位为mL；
m为试样的质量，单位为g；
f为稀释倍数。
优选的，步骤4采用如下公式求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量：
Figure BDA0003190406070000052
式中：
Xi为试样中各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；
c为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的含量，单位为ng/mL；
ci为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；
A为测试液中各个待测兴奋剂的峰面积；
Asi为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；
V为样液的提取体积，单位为mL；
csi为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；
Ai为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；
As为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的峰面积；
m为样品的质量，单位为g；
f为稀释倍数。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，首先用甲酸的乙腈溶液对动物体液进行提取，之后用无水硫酸钠除水，通过合理搭配试样、甲酸的乙腈溶液和无水硫酸钠的比例，进而获得上清液，再将上清液吹干，之后通过试剂溶解残渣、和过滤，形成待测液，以保证各个待测液中含有所述的四十八种兴奋剂且不存在干扰物质，由于最后要采用外标法和内标法进行计算相应兴奋剂的浓度，所以前处理过程加入了这四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质形成的混合同位素内标中间液，再利用高效液相色谱串联质谱仪测定待测液和混合标准工作液中的兴奋剂，同时为了消除基质效应带来的影响，用空白基质结合所述的四十八种兴奋剂标准物质、与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制混合标准工作液，通过得到的谱图信息进行比对，可判断试样中存在相应的目标物；根据兴奋剂和对应内标物的峰面积，并结合各个待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用外标法，求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量，提取体积、试样量、稀释倍数，采用内标法可求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量，本发明前处理简单，分析时间短，灵敏度高，检测种类全面，能够保障体育赛事对兴奋剂检测的需要。
附图说明
图1为48种兴奋剂混合标准工作液(色谱柱1)总离子流图(10ng/mL)。
图2为地塞米松和倍他米松混合标准工作液(色谱柱2)总离子流图(2ng/mL)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明一种同时检测动物体液中48种常见兴奋剂的检测方法，包括以下步骤：
所述48种兴奋剂包含有；
a)β2-激动剂(或称为β-阻断剂或刺激剂)16种：克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、肾上腺素、普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、克仑丙罗、曲托喹酚、去甲乌药碱；
b)蛋白同化制剂类13种：美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地酮、群勃龙、睾酮、β-玉米赤霉醇、泽仑诺、齐帕特罗；
c)糖皮质激素9种：泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、可的松、氢化可的松；
d)利尿剂类10种：乙酰唑胺、坎利酮、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、卞氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氨苯蝶啶、4-氨基-6-氯苯-1，3二磺酰胺。
2)标准溶液制备
a)标准储备液：分别准确称取适量48种兴奋剂标准物质(精确至0.01mg)，分别加入表1中对应的溶剂溶解，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，置于-18℃以下避光冷冻保存。
b)混合标准中间液：按照表1中兴奋剂的类别，分别吸取同类别兴奋剂标准储备液适量于10mL容量瓶中，用甲醇分别稀释至刻度，配成浓度均为10μg/mL的β2-激动剂类(肾上腺素为500μg/mL，除外)、蛋白同化制剂类、糖皮质激素类(氟氢可的松为500μg/mL，除外)、利尿剂类共4类混合标准中间液。
c)混合标准使用液：分别精确吸取适量混合标准中间液中4类混合标准中间液，用甲醇配成100ng/mL～5μg/mL的混合标准使用液。现配现用。
d)同位素内标标准储备液：如表1所示，分别准确称取或精确吸取适量22种同位素内标标准物质，分别加入表1中对应的溶剂溶解，配制成浓度均为100μg/mL的标准储备液，置于-18℃以下避光冷冻保存。
e)混合同位素内标中间液：分别精确吸取同位素内标标准储备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度均为1μg/mL(肾上腺素-D6为100μg/mL，除外)的混合同位素内标中间液。
f)混合标准工作液：
为了消除基质效应带来的影响，动物体液是用空白基质配标，先精密移取2mL空白基质提取液于10mL离心管中，分别准确吸取适量c)的混合标准使用液，加入适量e)混合同位素内标中间液，涡旋混匀，于40℃下氮气吹干，准确加入1mL乙腈-水(1+1，V/V)溶液溶解残渣，涡旋振荡1min，过0.22μm尼龙滤膜，作为混合标准工作液。
以猪尿为例，发明人做了几十批猪尿，发现有的猪尿中所有的项目都没有检出，就把该批次的猪尿当做空白基质。
表1的内容过于多，所以将拆分成如下四张分表进行说明。
表1aβ2-激动剂类和蛋白同化制剂类的一部分相关参数
Figure BDA0003190406070000091
表1bβ2-激动剂类和蛋白同化制剂类的另一部分相关参数
Figure BDA0003190406070000101
表1c糖皮质激素类和利尿剂类的一部分相关参数
Figure BDA0003190406070000111
表1d糖皮质激素类和利尿剂类的另一部分相关参数
Figure BDA0003190406070000121
步骤1，将供试样品置于-18℃以下保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。
精密量取试样5mL于50mL具塞离心管中，加入100μL混合同位素内标中间液，涡旋混匀，再加入10mL甲酸的乙腈溶液，甲酸占溶液体积的1％，涡旋振荡10～25min，加入2.5～4.5g氯化钠，涡旋振荡2～5min，然后在7000～8000r/min离心3～6min，分层后取上清液于另一干净的50mL具塞离心管中，剩余部分再用10mL上述甲酸的乙腈溶液重复提取一次，合并上清液，精密移取2mL上清液于10mL离心管中，于30～45℃下氮气吹干，防止待检测物分解，准确加入1mL乙腈-水(1+1，V/V)溶液溶解残渣，涡旋振荡1～5min，过0.22μm尼龙滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
步骤2，液相色谱-串联质谱仪测定
1，色谱条件
a)色谱柱1：C18(粒径：5μm，规格为2.0mm×150mm)；色谱柱2：BEH C18(粒径：1.7μm，规格为2.1mm×100mm)；
b)柱温：35℃；
c)进样量：5μL；
d)流速：0.3mL/min(色谱柱1)；0.2mL/min(色谱柱2)
e)色谱柱1流动相：A相：甲酸体积浓度为0.1％的水溶液，B相：甲酸体积浓度为0.1％的甲醇溶液，梯度洗脱程序见表2；
色谱柱2流动相：A相：甲酸体积浓度为0.1％的水溶液，B相：乙腈，梯度洗脱程序见表3。
表2色谱柱1梯度洗脱程序
时间(min) A(％) B(％)
0 95 5
1 95 5
2 80 20
6 40 60
8 20 80
8.5 10 90
10.5 10 90
11 95 5
15 95 5
表3色谱柱2梯度洗脱程序
时间(min) A(％) B(％)
0 75 25
15 75 25
15.1 20 80
20 20 80
20.1 75 25
25 75 25
2，质谱参考条件
a)离子源：电喷雾离子源(ESI+和ESI-)；
b)扫描方式：多反应监测(简写为MRM)；
c)喷雾电压：3.5kv(ESI+)、2.5kv(ESI-)；
d)离子传输管温度：350℃；
e)雾发温度：350℃；
f)鞘气压力：40Arb；
g)辅助气压：10Arb；
h)吹扫气压力：0Arb。
步骤3，含量测定
a，定性测定
根据试样中目标物的含量情况，选择浓度一致的混合标准工作液按照上述条件用色谱柱1及其相应的梯度洗脱程序进行液相色谱-串联质谱仪分析。若检测的色谱峰(倍他米松和地塞米松除外)对应的保留时间与混合标准工作液的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；质谱得到的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度的偏差不超过表4的规定，且每个离子的信噪比≥3，则可判断样品中存在相应的目标物。
若检测得到的地塞米松和倍他米松的色谱峰对应的保留时间与混合标准工作液中地塞米松和倍他米松的保留时间一致，则按照上述条件需用色谱柱2及其相应的梯度洗脱程序进行液相色谱-串联质谱仪分析。若检测的色谱峰保留时间与混合标准工作液的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；质谱得到的定性离子对的相对离子丰度与相当浓度的混合标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度的偏差不超过表4的规定，且每个离子的信噪比≥3，则可判断样品中存在相应的目标物。
表4定性测定时相对离子丰度的允许偏差
相对离子丰度，％ 允许偏差，％
＞50 ±20
20～50 ±25
10～20 ±30
≤10 ±50
10ng/mL的48种兴奋剂混合标准工作液(色谱柱1)总离子流图和地塞米松和倍他米松混合标准工作液(色谱柱2)总离子流图(2ng/mL)如图1和图2所示。
b，定量测定
根据试样中目标物的含量情况，选取浓度相近的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱仪分析。混合标准工作液和待测液中目标物的响应值均应在仪器线性响应范围内。以峰面积或峰面积之比做单点校正定量。
c，空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
d，结果计算和表述
齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱、苯丙酸诺龙，采用外标法定量，按照(1)式计算，计算结果需扣除空白值。
Figure BDA0003190406070000151
Xi—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A—测试液中待测组分的峰面积；
As—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
V—样液的提取体积，此处为20，单位为毫升(mL)；
m—样品的称样量，单位为克(g)；
f—稀释倍数，此处为0.5。
除上述组分外，其它组分均采用内标法定量，按照(2)式计算，计算结果需扣除空白值。
Figure BDA0003190406070000152
式中：
Xi—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
ci—测试液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A—测试液中待测组分的峰面积；
Asi—混合标准工作液中内标物的峰面积；
V—样液的提取体积，此处为20，单位为毫升(mL)；
csi—混合标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai—测试液中内标物的峰面积；
As—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
m—样品的称样量，单位为克(g)；
f—稀释倍数，此处为0.5。
用重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
本发明在实际应用中，制备待测液时，按以下步骤：
精密量取试样5mL于50mL具塞离心管中，加入100μL混合同位素内标中间液，涡旋混匀，再加入10mL甲酸的乙腈溶液，涡旋振荡10min，加入3g氯化钠，涡旋振荡2min，然后在8000r/min离心5min，取上清液于另一干净的50mL具塞离心管中，剩余部分再用10mL上述甲酸的乙腈溶液重复提取一次，合并上清液，精密移取2mL上清液于10mL离心管中，于40℃下氮气吹干，准确加入1mL乙腈-水(1+1，V/V)溶液溶解残渣，涡旋振荡1min，过0.22μm尼龙滤膜。
方法实际应用结果
使用本发明建立的方法对从陕西省各地抽取的6份猪尿液、牛尿液和羊尿液进行测定分析，结果，氢化可的松检出5批次，可的松检出3批次，其它项目均未检出。详见表5。
表5检出样品的种类及结果
Figure BDA0003190406070000171
在空白猪尿中分别添加100μL混合标准使用液和100μL混合同位素内标中间液，使样品中化合物浓度分别为定量限，进行回收率测定，分别按照上述步骤平行做3次，得到本方法的回收率及精密度。结果表明猪尿中48种化合物的回收率范围为61.2％～119.8％，精密度(用相对标准偏差RSD表示)为1.0％～19.5％；详细结果如表6所示。
表6-1猪尿中1-24种化合物的回收率及精密度
Figure BDA0003190406070000172
Figure BDA0003190406070000181
表6-2猪尿中25-48种化合物的回收率及精密度
Figure BDA0003190406070000182
实验结果表明，该方法回收率均能够在国家现行有效标准GB/T 27404－2008中规定的60％～120％内，精密度均在30％以内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。该方法在实际应用中，检测效果良好，可用于动物体液中48种兴奋剂的快速检测。
Figure BDA0003190406070000183
Figure BDA0003190406070000184

Claims (10)

1.一种同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，所述同时检测的四十八种兴奋剂为克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、肾上腺素、普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、克仑丙罗、曲托喹酚、去甲乌药碱、美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地酮、群勃龙、睾酮、β-玉米赤霉醇、泽仑诺、齐帕特罗、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、可的松、氢化可的松、乙酰唑胺、坎利酮、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、卞氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氨苯蝶啶和4-氨基-6-氯苯-1，3二磺酰胺，包括如下步骤：
步骤1，在试样中加入与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质形成的混合同位素内标中间液，之后用甲酸的乙腈溶液进行提取，然后用无水硫酸钠除水，试样、甲酸的乙腈溶液和无水硫酸钠的比例为(4.88～5.12)mL：10mL：(2.5～4.5)g，从得到的提取液中分离出上清液，然后将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，合并得到上清液，将上清液吹干，将得到的残渣用乙腈的水溶液溶解，最后依次涡旋振荡、过滤，得到待测液；
步骤2，将待测液用高效液相色谱串联质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；
将由所述的四十八种兴奋剂标准物质、与所述四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质和所述动物体液对应的空白基质配制的混合标准工作液，用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中除倍他米松和地塞米松外所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；
将步骤2所述的四种待测液按照相同的条件，用高效液相色谱串联质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；将该谱图信息与混合标准工作液对应的谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中倍他米松和地塞米松的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中倍他米松、地塞米松对应的内标物的峰面积；
步骤4，结合以下两种方式，完成动物体液中四十八种兴奋剂的同时检测；
结合待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用外标法，求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量；
结合待测液获得过程中的提取体积、试样量、稀释倍数，采用内标法，求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量。
2.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤1中所述的甲酸的乙腈溶液中甲酸占整个溶液体积的1％，并按如下方式对所述的试样进行提取：
先加入甲酸的乙腈溶液涡旋振荡10～25min，之后加入无水硫酸钠涡旋振荡2～5min，最后在7000～8000r/min下离心3～6min。
3.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤1用氮气在30～45℃下对上清液进行吹干。
4.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤2采用如下过程配制混合标准工作液：
先采用权利要求1步骤1中对应的过程对所述动物体液对应的空白基质进行提取，得到空白基质提取液，在空白基质提取液中加入由所述的四十八种兴奋剂标准物质配制的混合标准使用液和由所述的四十八种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制的混合同位素内标中间液，涡旋混匀，吹干后加入乙腈的水溶液溶解，最后依次涡旋振荡和过滤，得到混合标准工作液。
5.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤2中所述的C18色谱柱中，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为甲酸的甲醇溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，梯度洗脱程序如下：
0～1min内，流动相A的体积比例保持95％；1～2min内，流动相A的体积比例由95％线性减小至80％；2～6min内，流动相A的体积比例由80％线性减小至40％；6～8min内，流动相A的体积比例由40％线性减小至20％；8～8.5min内，流动相A的比例由20％线性减小至10％，8.5～10.5min内，流动相A的比例保持10％，10.5～11min内，流动相A的体积比例由10％线性增加至95％，11～15min内，流动相A的比例保持95％；
步骤3中所述的BEH C18色谱柱中，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：
0～15min内，流动相A的体积比例保持75％；15～15.1min内，流动相A的体积比例由75％线性减小至20％；15.1～20min内，流动相A的体积比例保持20％；20～20.1min内，流动相A的体积比例由20％线性增加至75％；20.1～25min内，流动相A的比例保持75％。
6.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中所述的质谱仪采用如下参数进行工作：
离子源为电喷雾离子源，ESI+下的喷雾电压为3.5kv，ESI-下的喷雾电压为2.5kv，扫描方式为多反应监测，离子传输管温度为350℃，雾发温度为350℃，鞘气压力为40Arb，辅助气压为10Arb，吹扫气压力为0Arb。
7.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比。
8.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤3在进行谱图信息比对时，采用如下标准：
待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3。
9.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤4采用如下公式求出齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙的含量：
Figure FDA0003190406060000041
式中：
Xi为试样中所述各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；
c为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的含量，单位为ng/mL；
A为测试液中各个待测兴奋剂的峰面积；
As为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的峰面积；
V为样液的提取体积，单位为mL；
m为试样的质量，单位为g；
f为稀释倍数。
10.根据权利要求1所述的同时检测动物体液中四十八种兴奋剂的方法，其特征在于，步骤4采用如下公式求出除齐帕特罗、非诺特罗、去甲乌药碱和苯丙酸诺龙以外所有兴奋剂的含量：
Figure FDA0003190406060000042
式中：
Xi为试样中各个待测兴奋剂的含量，单位为μg/kg；
c为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的含量，单位为ng/mL；
ci为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；
A为测试液中各个待测兴奋剂的峰面积；
Asi为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；
V为样液的提取体积，单位为mL；
csi为混合标准工作液中各个待测兴奋剂对应内标物的浓度，单位为ng/mL；
Ai为测试液中各个待测兴奋剂对应内标物的峰面积；
As为混合标准工作液中各个待测兴奋剂的峰面积；
m为样品的质量，单位为g；
f为稀释倍数。
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