CN104596824A - 含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质及其制备方法。通过对活白羽肉鸡喂养含金刚烷胺和利巴韦林的水，使得金刚烷胺和利巴韦林在活鸡体内代谢至合适浓度后，将活鸡宰杀，取前胸肉，经匀浆、灭菌后制得基体标准物质。该物质属于自然污染标准样品，此标样可用于相关检测分析的质量控制，样品均匀、稳定，运输方便，使用可靠。

Description

含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测的动物源性食品基体标准物质技术领域，更具体涉及一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质及其制备方法。

背景技术

金刚烷胺（amantadine）又称金刚胺、三环癸胺，CAS号：768-94-5，分子量；151.2487。利巴韦林（Ribavirin）化学名称为：1-B-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺，又名三氮唑核苷、病毒唑。

金刚烷胺和利巴韦林均为人用主要抗病毒类药物，目前还没有专门针对抗动物病毒的药物，市场上大部分药物都是人用抗病毒药物移植兽用，鉴于人用抗病毒药物移植兽用存在抗药性以及残留等问题，许多国家都禁止使用抗病毒类药物用来预防和治疗鸡、猪流感等病毒性疾病。2006年美国FDA发布新规，禁止金刚烷胺抗流感病毒药品用于禽类；加拿大等国也因为金刚烷胺的抗药性等问题，建议不将其用于禽类流感的预防和治疗；日本也加强了对此类药物的监控；中华人民共和国农业部公告第560号中明确规定抗病毒药物为禁用兽药，其中包括：金刚烷胺，利巴韦林等。但是，近年来，抗病毒药已扩大应用于其他领域，如畜禽、商业养殖、水产业等，养殖企业为了防治病毒感染和经济效益，在动物养殖过程中违禁使用抗病毒药物时有发生，对消费者健康和对外贸易均产生很大危害。根据央视报道，40天“速成鸡”的饲养过程中，滥用药物的情况令人触目惊心！其中就有使用金刚烷胺、利巴韦林等的报道。基于抗病毒类药物目前在我国水产和畜禽养殖中的滥用状况，对动物源性食品中抗病毒类药物残留进行质量控制非常有必要，除了开展对此类药物进行残留监控与代谢研究，有效的检测抗病毒药物残留方法是监督控制抗病毒类药物滥用的关键。

在兽药残留分析中，分析基体多样性和本身的差别使得在分析过程中不能简单地采用传统的纯品标准物质来校准或进行质量控制，需要采用基体标准物质两类标准物质以满足要求，包括证明检测工作与所要求的标准操作程序相符或参加能力验证中、校准仪器、用于质量控制、解决分析中遇到的问题以及保证结果的准确。欧洲委员会对标准物质有明确定义，欧盟有关农、兽药残留检测的法规性文件均提到了要采用标准物质作为质量控制手段，对检测方法进行验证；因此标准物质对于兽药残留分析是十分重要的。另外，现有的残留分析质量控制手段多采用基质加标的形式，这种形式存在基质差异大、目标化合物结合状态不一样等缺陷，据现有的研究表明，利巴韦林在动物和人体肝脏内主要以原药、单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯等形式存在，这就使得对这类化合物的分析质量控制难度加大。因此，本专利采用喂食原药而使肉鸡自然污染的方式制备一批含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质，该标准物质的目标物结合状态与实际检测样完全一致。

发明目的

本发明的目的是提供一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质及其制备方法。该基体标准物质含合适浓度的金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉自然污染基体（目标物结合状态与实际检样完全一致）的实物标样，可作为实物标样在日常检测工作中用于建立分析方法、确定实验准确度与精密度及在检测质量控制，使用方便、浓度适中、品质好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质：金刚烷胺和利巴韦林的浓度均为7～13μg/kg。

一种制备如权利要求1所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的方法，包括以下步骤：

1）采用含金刚烷胺和利巴韦林的水对肉鸡进行口服喂养，当肉鸡肌肉中金刚烷胺和利巴韦林经代谢后浓度变为7～13μg/kg时，停止喂药；

2）将步骤1）喂养合格的活鸡进行宰杀，取鸡前胸肉，捣碎组织、匀浆后过四分筛；

3）真空包装、封口、贴标签；

4）辐照灭菌，制得成品，0-4℃冰箱中储存。

所述的步骤1）中具体的喂养方法为：选取体重0.95~1.05 kg的肉鸡200只，每次给药剂量为利巴韦林 6g/100 kg水，金刚烷胺 3g/100 kg水，每日给药1次，连续给药4日，停药后第3天取样。

所述的步骤2）中匀浆具体为：将捣碎的鸡肉置于匀浆机中，3000rpm 转速搅成酱样并匀浆5min；以4kg/次的鸡肉量搅拌3次，混合后再搅拌3次；再采用拍击式均质器进行二次混匀：将样品装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180拍/min的频率，每次拍击5 min后取出，再进行更换拍击，如此反复拍击3次。

所述步骤3）中，先装入内袋中，再套上外袋；所述内袋为聚乙烯袋，外包装袋为食品级铝箔包装袋，规格为宽9cm，长13cm，厚度双面20丝，每袋重量为25 g。

所述步骤4）中辐照灭菌：60Co-γ辐照，剂量为9KGy。

本发明的显著优点：

1）本发明制备了含合适浓度的金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉自然污染基体（目标物结合状态与实际检样完全一致），可作为实物标样在日常检测工作中用于建立分析方法、确定实验准确度与精密度及在检测质量控制，使用方便、浓度适中、品质好；

2）制备方法科学合理，可操作性强。

附图说明

图1 是本发明的制备流程图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的制备方法：

（1）采用金刚烷胺和利巴韦林多剂量口服给药，选取体重约1公斤的白羽肉鸡200只，每次给药剂量为利巴韦林6g/100kg水，金刚烷胺3g/100kg水，每日给药1次，连续给药4日，停药后第3天取样，使金刚烷胺和利巴韦林药物在肉鸡体内代谢，对其代谢曲线进行测定，获得肌肉中金刚烷胺和利巴韦林浓度在7～13μg/kg的活鸡，将肉鸡宰杀、去毛、去皮骨，取前胸肉，得含有金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉；

（2）取步骤（1）按规定饲养时间完成后的肉鸡，宰杀、去毛、去皮骨，取前胸肉；捣碎匀浆，将鸡肉置于匀浆机中，3000rpm 转速搅成酱样并匀浆5min，以4kg/次的鸡肉量搅拌3次，混合后再搅拌3次；

（3）再采用拍击式均质器将步骤（2）进行二次混匀：将步骤（2）的样品装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180拍/min的频率，每次拍击5 min后取出，再进行更换拍击，如此反复拍击3次；

（4）将步骤（3）中制得的样装入内袋中，再套上外袋；用真空封口机，对装好样品的外袋热封口；

（5）贴上对应的标识；辐照灭菌：将包装好的样品辐照灭菌，采用60Co-γ辐照，辐照剂量为9KGy；

（6）所述步骤（4）中包装袋内袋为聚乙烯袋，外包装袋为食品级铝箔包装袋，规格为宽9cm，长13cm，厚度双面20丝，每袋重量为25 g；

（7）所述步骤（5）灭菌后样品置于0-4℃冰箱中储存。

鸡肉中金刚烷胺与利巴韦林残留检测

由于目前对金刚烷胺和利巴韦林的残留检测方法尚未有正式发布的国家或相关行业标准，因此，本实验室对此类药物的检测参照以下文献方法[1-3]，并对此方法进行实验室细化和相关技术验证，结果见表1，该方法在1.0，2.0，10.0μg/kg的3个添加水平内室内平均回收率在88.5%~92.22%，精密度RSD 均为12% 以内（n=6），符合SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的相关要求。金刚烷胺的保留时间为5.31min左右，利巴韦林的保留时间为2.12min左右。具体检测方法见下面所附检测方法。说明该检测方法稳定、可靠。

[1] 刘正才,杨方, 余孔捷, 林永辉, 刘素珍, 张琼, 苏芝娇，液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测鸡组织中5 种抗病毒类药物的残留量[J]，色谱, 2012, 30（12）: 1253-1259.

[2]  DB 32/T 1165-2007，《鸡肝中利巴韦林及其代谢物残留总量的测定液相色谱--串联质谱法》．江苏省地方标准.

[3]  Li-Tain Yeh, Mai Nguyen, and Chin-Chung Lin，A Sensitive and Specific Method for the Determination of Total Ribavirin in Human Red Blood Cells by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry[J]，Journal of Chromatographic Science, 2003, 41, 256-260。

表1鸡肉基质中金刚烷胺与利巴韦林的添加回收率和精密度数据（n=6）

均匀性检验

均匀性实验的总样本数共500个，顺序编号后按总样本数N的3×N1/3随机抽取15个样品进行样品均匀性实验。

以每个检体3个重复性条件下检测获得的数据为一组，共获得15组数据；计算每组内的均方差和组间的均方差，以及各自的自由度，显著性水平α，按方差检验给定的方法计算统计量F。查F分布表，找出临界值F，进行比较判断，作出结论。F值=0.703＜F_0.05（14，30）=2.31，样本是均匀的。结果见表2，表4。

表2  鸡肉中金刚烷胺的均匀性检验结果及方差分析结果

表3 金刚烷胺的均匀性检验结果方差分析

表4  鸡肉中利巴韦林的均匀性检验结果及方差分析结果

表5 利巴韦林的均匀性检验结果方差分析

由表3，表5可见，均匀性实验所得F值＜F_0.05（14，30），表明样品间不存在明显差异，证明制得的样本是均匀的。

稳定性考察

采用GB/T 15000.3-2008/ISO Guide35:2006检验法评价标准样品的稳定性，标准物质在进行定值时，需考虑长期稳定性（如有效期）与短期稳定性（如运输条件下材料的稳定性）两种类型的稳定性。标准物质的长期稳定性与标准物质在生产者的贮存条件下的行为有关，短期稳定性与样品运输过程中的外部因素有关。本项目的稳定性实验设计为经典稳定性研究，即制定好的样品冷藏与-18℃冰柜中，以一个月为测试时间间隔，每月取样一次进行测试，稳定性研究的测量数据见表6。

表6 稳定性实验数据与分析

根据表6的相关数据，采用一元线性回归参数可按下式计算得到：

斜率的计算：；

截距的计算：；

通过误差分析可以计算和的标准偏差，按估计的标准偏差，式中：；

自由度为n-2和p=0.95（95%置信水平）的学生分布t因子为2.35，由于金刚烷胺和利巴韦林两种化合物均为，故斜率是不显著的，因而未观测到不稳定性。斜率不显著，表示标准样品的特性量值随时间变化而无明显变化，因此标准样品稳定性良好。

鸡肉组织中金刚烷胺与利巴韦林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法

1 方法提要

试样中金刚烷胺与利巴韦林用三氯乙酸-乙腈混合溶液提取并沉淀蛋白后，提取液中的金刚烷胺经混合型阳离子交换固相萃取柱净化后，液相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量；溶液中的利巴韦林代谢物经磷酸酶水解成利巴韦林原药，与样品中残留的利巴韦林原药一起，经三氯乙酸-乙晴混合溶液提取并沉淀蛋白，经苯硼酸阴离子交换固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱进行测定，同位素内标法定量。

试剂和材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

甲醇：色谱纯

乙腈：色谱纯

甲酸：色谱纯

三氯乙酸

氨水：含量为25％～28％

乙酸铵：色谱级纯

酸性磷酸酯酶（Phosphatase Acid, From Wheat Germ，CAS编号：9001-77-8）

2% 甲酸溶液：移取2.0 mL甲酸（2.3），用水稀释并定容至100 mL；

三氯乙酸溶液(20 g/L):称取20 g三氯乙酸（2.4），溶于1 L 水中，混匀后备用；

三氯乙酸溶液乙腈（90+10体积比）：量取900mL三氯乙酸溶液（2.9），加入100mL乙腈，混匀；

5mol/L乙酸铵溶液：称取38.5g乙酸铵至约80mL水中，用氨水调节pH至7.0（±0.2）后定容至100 mL；

1%甲酸乙腈溶液：移取1.0 mL甲酸（2.3），用乙腈稀释并定容至100 mL；

混合型阳离子交换固相萃取柱洗脱液：准确移取2.5 mL氨水和 2.5 mL 乙酸铵溶液加入95 mL 的甲醇中，混匀后备用；

定容液：70 mL乙腈（4.2）、10 mL甲醇（4.1）与20 mL水混匀；

5 mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385 g乙酸铵至约800 mL水中，加入2 mL甲酸后定容至1000 mL，混匀；

乙酸铵缓冲溶液(0.25 mol/L，pH8.5)：称取乙酸铵9.06 g，加水约450mL 使其溶解，用氨水 调pH 8.5±0.1，再加水定容至500mL；

Bond Elut PBA固相萃取小柱洗脱液（2％甲酸甲醇溶液）：准确量取2 mL甲酸加入98 mL的甲醇中，混匀后备用；

标准品：金刚烷胺（amantadine，CAS No.768-94 5）纯度均大于98.0％； 同位素内标标准品：金刚烷胺_D6，美金刚-_D6, 阿昔洛韦_D4纯度均大于99.0％；

利巴韦林（ribavirin；CAS 编号：36791-04-5），纯度均大于 98.0％；同位素内标标准物质：利巴韦林_13C5纯度均大于99.0％；

标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量的金刚烷胺、利巴韦林以及同位素内标标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液，-18℃冰箱中避光保存，有效期为6个月；

混合标准中间液（1μg/mL）：分别准确量取1.00 mL的标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月；

混合内标中间溶液（1μg/mL）:移取1.00 mL的内标标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月；

混合阳离子交换固相萃取小柱：60mg/3 mL，或相当者。使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水和3 mL2％甲酸活化，保持柱体湿润；

Bond Elut PBA固相萃取小柱：100mg/3 mL，使用前依次用3 mL乙腈，3 mL乙腈-1％甲酸（3+1，体积比），3 mL乙酸铵溶液（2.16）活化；

滤膜：0.22μm，有机系。

仪器和设备

高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离（ESI）源

天平：感量0.1 mg和0.01 g

组织捣碎机

高速冷冻离心机：最高转速可达18 000 r/min

离心机：5000 r/min

漩涡振荡器

pH计

氮吹仪

固相萃取装置

试样制备与保存

试样制备

鸡肉放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记； 制样操作过程中，应尽可能防止样品受到污染或发生残留物含量的变化；

试样保存

试样于-18 ℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2 ℃～6 ℃贮存72 h。

分析步骤

提取

称取5 g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL 具螺旋盖的聚丙烯离心管中，添加100 μL内标标准工作溶液（0.1μg/mL），加入12 mL三氯乙酸溶液(2.10)和2.5 mL乙腈，振荡混匀3.0 min后在超声波发生器中超声10 min，于15000r/min离心5 min，取出上清液，再加入10 mL三氯乙酸溶液(2.10)重复提取一次，离心后合并上清液定容至25 mL的容量瓶中。

净化

金刚烷胺：准确移取5 mL上清液（5.1），加入到活化过的HR-XC中，依次用5 mL 2％( V/V)甲酸溶液、3 mL 1％甲酸乙腈( V/V)淋洗；然后真空抽干5 min，4.0 mL 洗脱液1洗脱至5 mL玻璃管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 mL乙腈-甲醇-水(体积比 70:10:20)溶液溶解残渣，过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

利巴韦林：准确移取5 mL以上提取液（5.1），加入1.0mL乙酸铵溶液（2.15），混匀，再加入100μL 磷酸酯酶，加盖后涡旋1 min，于恒温烘箱中37℃培养2h。取出后冷却至室温，用氨水调pH值至(8.5±0.1)，混匀，3 000 r/min离心10min，取上清液备用。取以上上清液，上样到活化过的Bond Elut PBA固相萃取小柱，控制上样流速小于3 mL/min；依次用5 mL 含有10％乙腈-乙酸铵溶液（2.16）和2.0 mL5%氨水甲醇淋洗，然后真空抽干5 min，4.0 mL 洗脱溶液（2.17）洗脱至10 mL玻璃管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 mL乙腈-水(体积比 90:10)溶液溶解残渣，过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

液相色谱-串联质谱测定

液相色谱条件

a） 色谱柱：亲水相互作用色谱柱：2.1mm x 100mm, 5μm，或相当者；

b） 流动相： A为5mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸），B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 液相色谱的梯度洗脱程序

c）流速：0.4 mL/min；

d）柱温：30 ℃；

e）进样量: 2 μL。

质谱条件

离子化模式：电喷雾电离（ESI）正离子模式；

质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；

其他质谱参考参数:

a)        ESI正离子模式；多反应监测（MRM）；

b)        电喷雾电压（IS）：5500.0 V；

c)        离子源温度（TEM）：500℃；

d)       雾化气压力（GS1）：50.00 Psi；

e)        辅助气压力（GS2）：50.00 Psi；

f)         气帘气压力（CUR）：35.00 Psi

g)        监测离子对、去族电压（DP）、碰撞电压（CE）见表2

表 2 金刚烷胺和利巴韦林的保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量

定性测定

被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

定量测定

内标法定量：用标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中利巴韦林的响应值均应在仪器线性响应范围内。利巴韦林的保留时间、母离子和子离子参见A.2。

空白试验

除不加试样外，均按上述操作步骤进行。

6  结果计算和表述

试样中金刚烷胺和利巴韦林及其代谢物的残留总量（以利巴韦林计）利用数据处理系统计算或按式（1）计算：

  —————————（1）

式中：

X — 样品中待测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C — 标准工作溶液中药物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

C _i  — 样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

A — 样液中药物的峰面积；

A _si — 标准工作溶液中内标物的峰面积；

V — 样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

C _si  — 标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

A_i — 样液中内标物的峰面积；

A _s  — 标准工作溶液中药物的峰面积；

m— 最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质，其特征在于：所述的鸡肉基体标准物质中，金刚烷胺和利巴韦林的浓度均为7～13μg/kg。

2.一种制备权利要求1所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）采用含金刚烷胺和利巴韦林的水对肉鸡进行口服喂养，当肉鸡肌肉中金刚烷胺和利巴韦林经代谢后浓度变为7～13μg/kg时，停止喂药； 

2）将步骤1）喂养合格的活鸡进行宰杀，取鸡前胸肉，捣碎组织、匀浆后过四分筛；

3）真空包装、封口、贴标签；

4）辐照灭菌，制得成品，0-4℃冰箱中储存。

3.根据权利要求2所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）中具体使用的肉鸡品种为白羽肉鸡；具体的喂养方法为：选取体重0.95~1.05 kg的肉鸡200只，每次给药剂量为利巴韦林 6g/100 kg水，金刚烷胺 3g/100 kg水，每日给药1次，连续给药4日，停药后第3天取样。

4.根据权利要求2所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中匀浆具体为：将捣碎的鸡肉置于匀浆机中，3000rpm 转速搅成酱样并匀浆5min；以4kg/次的鸡肉量搅拌3次，混合后再搅拌3次；再采用拍击式均质器进行二次混匀：将样品装入拍击袋，置于拍击式均质器中，按180拍/min的频率，每次拍击5 min后取出，再进行更换拍击，如此反复拍击3次。

5.根据权利要求2所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，先装入内袋中，再套上外袋；所述内袋为聚乙烯袋，外包装袋为食品级铝箔包装袋，规格为宽9cm，长13cm，厚度双面20丝，每袋重量为25 g。

6.根据权利要求2所述的含金刚烷胺和利巴韦林的鸡肉基体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中辐照灭菌：60Co-γ辐照，剂量为9KGy。