CN106872600B - 一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法。通过模拟饲喂，获得克伦特罗污染的猪肉原料，将样品绞碎后直接与水以适当比例混合，不经过匀浆，直接采用冷冻干燥方法获得冻干猪肉，经过研磨、筛分、混匀、辐照等步骤，制备获得具有良好均匀性的冻干猪肉粉。采用经过国际比对验证准确性的液相色谱同位素稀释质谱法(LC‑ID‑MS/MS)法进行标准物质的定值以及均匀性检验和稳定性监测。本方法制备的含有克伦特罗的冻干猪肉粉，均匀性和稳定性良好，可用于猪肉中克伦特罗残留检测的分析方法评价、分析过程的质量控制及实验室能力考核。

Description

一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有克伦特罗(瘦肉精)的猪肉粉基体标准物质制备方法，猪肉粉中克伦特罗标准物质是一种计量标准，主要用于校准计量器具和评价测量方法的准确度。

背景技术

盐酸克伦特罗(Clenbuterol)，英文通用名称：Clenbuterol·HCl；化学名称：a[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐；1-(4-amino-3，5-dichloro-phenyl)-2-(tert-butylamino)ethanol；分子式：C₁₂H₁₈Cl₂N₂O；分子量：277.19；CAS登记号：37148-27-9；盐酸盐CAS登记号：21898-19-1，结构式如图1所示。

盐酸克伦特罗是一种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂，人食用高含量残留食品后会引发心悸、胸闷、四肢震颤、视力模糊等症状。1986年开始，欧美等发达国家已严禁在畜牧生产中应用瘦肉精，并与世界卫生组织一起制定了其在肉类产品中的最高残留限量为0.2μg/kg。我国农业部235号公告中明确规定克伦特罗为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出。动物源食品尤其是肉制品中克伦特罗兽药残留的检测水平属于痕量残留(10^-9g/g)检测，在特殊人群食品供应要求中，比如运动员食品，鲜肉中克伦特罗残留检测水平达到超痕量水平(10^-12g/g),因此对复杂食品基质中克伦特罗的测量技术的准确性要求极高。

标准物质(RM)reference material(RM)：是一种已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业中的“量具"，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。

为保证我国克伦特罗残留检测结果的准确性、溯源性和可比性，在取得猪肉中克伦特罗测量的国际互认能力基础上，研制猪肉中克伦特罗基体标准物质。该标准物质的成功研制保证了相关兽药残留测量结果的准确、可比、可溯源，对食品安全检测有着极其重大的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明提供一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法。本发明的目的是提供一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质，具有良好的均匀性和稳定性。该标准物质的使用有利于提高猪肉中克伦特罗痕量残留检测中标准物质与样品的基体匹配程度，从而提高检测结果的准确性和可靠性。

本发明还提供一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法，包括：

样品预处理：取猪肌肉部分，剔除残留肥肉、筋膜，切块；冷冻研磨至粉碎，作为原料；取原料适量，按照1:2的比例，加水稀释成肉浆，得到样品，装入冷冻盘；

预冻样品：所述样品共晶点为-20℃，设置预冻温度设为-25℃；预冻速率为15℃/min；快速预冻3小时；

第一阶段升华干燥：将所述冷冻盘装入干箱，干箱压力较长时间保持不变，以5℃/次的速率逐步提高搁板温度，直至-5℃；当样品干层与冻干层的交界面到达盘底并消失，样品温度升至接近于搁板温度或者干箱真空度与冷阱真空度接近并保持恒定时，继续干燥1小时；

第二阶段升华干燥：一次调整搁板温度至样品允许的最高温度0-4℃以下；自动调节渗气，时间为2小时之上；样品达到最高允许温度后，恢复干箱内真空度，恒温3小时；

研磨制粉：取出冻干样品；在研磨机中研碎，研磨速率为3000rpm，研磨2min；

筛分：采用35目筛，超声脉冲筛分样品；

混匀：样品置于10L混匀桶中，连续混匀6小时；

得到猪肉粉基体标准物质。

所述方法还包括：

所述冷冻盘中样品厚度不能超过2cm。

所述方法还包括：

辐照：采用放射性同位素钴-60产生的γ射线，对冻干粉进行辐照杀菌，辐照剂量为4kGy。

本发明实施例其他技术相比，其优势在于：1)将样品绞碎后与水以适当比例混合，不经过高速匀浆，有效防止了目标物克伦特罗在样品制备过程中被提取。2)采用冷冻干燥方法获得冻干猪肉，经过研磨、筛分、混匀、辐照等步骤，制备获得具有良好均匀性的冻干猪肉粉。2)通过模拟饲喂，获得克伦特罗污染的猪肉原料，该原料能够完全模拟实际检测中的了克伦特罗污染猪肉样品；3)采用该技术制备猪肉粉中克伦特罗的含量水平(0.68μg/kg)与克伦特罗最低残留限量(0.2μg/kg)在一个数量级，满足痕量残留检测的需要。4)本标准物质的赋值，采用了经过国际比对验证的高准确度同位素稀释质谱技术，标准物质赋值准确，国际互认。

本方法制备的含有克伦特罗的冻干猪肉粉，均匀性和稳定性良好，可用于猪肉中克伦特罗痕量残留检测中分析方法的评价、分析过程的质量控制及实验室能力考核。作为标准物质也可并用于校准计量器具和评价计量方法，操作简单，易于推广。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、说明书附图、权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。

下面结合附图，通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为盐酸克伦特罗分子结构图；

图2为猪肉冻干粉样品制备流程图；

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本实施例中，首先需要获取原材料，也就是含有克伦特罗的猪肉样品。

来源：健康猪(约克夏大白猪)饲喂克伦特罗药物。

阳性饲喂方案：体重60-75kg，将一天的猪饲料(农场自制玉米饲料)中混入药物适量，搅拌均匀即可。自由采食和饮用水，连续饲喂28-30天，停药当天宰杀，获取猪肉样品。

1、猪肉样品预处理：

(1)取阳性猪肌肉部分，剔除残留肥肉、筋膜等，切块。冷冻研磨至粉碎，作为原料。

(2)取原料适量，按照1:2的比例，加水稀释成肉浆，装入冷冻盘(30cm*30cm*5cm)，盘中样品厚度不能超过2cm。

2、猪肉冻干粉制备：

(1)预冻样品：样品共晶点为-20℃，设置预冻温度设为-25℃；预冻速率为15℃/min(每分钟降温15℃)；快速预冻3小时，使样品完全冻牢。

(2)第一阶段升华干燥：

预冻结束后，开始第一阶段升华。当干箱压力较常时间保持不变后，以5℃/次的速率逐步提高搁板温度，直至-5℃，防止样品出现过冷，为升华提供能量，加快升华速度。

当样品干层与冻干层的交界面到达盘底并消失，样品温度升至接近于搁板温度或者干箱真空度与冷阱真空度接近并保持恒定时，继续干燥1小时，以彻底消除样品中的残留冰晶及样品干燥的不均衡性，第一阶段升华结束。

(3)第二阶段升华干燥

该阶段样品中已不存在冻结冰，一次调整搁板温度至样品允许的最高温度0-4℃以下。为避免干箱内压力过低影响传热，进行自动调节渗气，以使样品温度尽快达到最高温度，提高升华速率。时间为2小时之上。

样品达到最高允许温度后，恢复干箱内真空度，恒温3小时，第二阶段升华干燥结束。

(4)关机，取出冻干样品。称重，冻干粉得率为25％。

3、研磨制粉：冻干样品在研磨机中研碎，研磨速率为3000rpm，研磨1min，放置10min；重复研磨3次。

4、筛分：采用35目筛，超声脉冲筛分样品。

5、混匀：样品置于10L混匀桶中(不超过桶体积的1/2)，连续混匀6小时。

6、分装：样品包装在15mL透明样品瓶中，每瓶约2.5g。

7、辐照：采用放射性同位素钴-60产生的γ射线，对冻干粉进行辐照杀菌，辐照剂量为4kGy。

对上述方法制得的痕量克伦特罗的冻干猪肉粉样品进行均匀性检验和稳定性监测。

(一)均匀性检验

均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。

均匀性的检测方法：

提取：称取样品约0.5g(准确称量至0.0001g)，加1.5g水复溶，加入适量内标溶液，放置1小时。加5ml水，匀浆1min(14000rpm)，用5mL水清洗刀头，清洗液与匀浆液合并。加0.1％甲酸乙腈溶液10mL，涡旋混合2min。12000rpm(4℃)冷冻离心15min，收集上清液过0.45μm聚醚砜(PES)滤膜，待净化。

净化：PCX(agela,150mg,6mL)依次经8mL甲醇，8mL水，8mL 0.2％甲酸水溶液活化。全部上样，分别用0.2％甲酸水溶液、50％甲醇水溶液，各8mL淋洗，抽干。用8mL正己烷淋洗、抽干。用5％氨化(乙酸乙酯：甲醇＝2:1，v/v)溶液10mL洗脱。洗脱液在45℃水浴下氮气吹至近干。用0.1％甲酸水溶液2mL复溶，过0.22μm聚醚砜(PES)滤膜，供LC-MS/MS检测。

仪器方法：

色谱柱：ACQUITY CSH C18色谱柱(100mm×3.0mm，1.7μm；美国Waters公司)；流动相A为乙腈，流动相B为20％乙腈水溶液(含0.1％甲酸)。梯度洗脱程序：0～5min，100％B；5～5.1min，100％B～30％B；5.1～9min，30％B；9～9.1min，30％B～100％B；9.1～16min，100％B。流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样体积：20μL；

质谱条件：正离子扫描方式；多反应检测(MRM)；雾化气压力(GS1):50Psi；辅助气压力(GS2)：60Psi；气帘气压力(CUR)：15Psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞室入口电压(EP)：13V；碰撞室出口电压(CXP)：14V；CAD：medium；IS：1500V；TEM:600℃。

各特征离子对碰撞电压参数见表1

表1

名称	定量离子对	CE(V)	定性离子对	CE(V)	保留时间(min)
						克伦特罗	277.0/203.0	25	277.0/168.0	45	3.29
D9-克伦特罗	286.0/204.0	24	277.0/132.0	45	3.29

从标准物质的300个包装中随机抽取15个包装，每个包装取3个子样进行瓶间和瓶内均匀性检验。最小取样量为0.5g，按照如下所述的液相色谱同位素稀释质谱法进行测试。将均匀性方差分析结果s_bb与所用方法的重复性s_r或该特性量值不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则标准物质视为均匀。应计算待测特性量值的不均匀性引入的不确定度分量u_bb，并将其计入标准物质总的不确定度中。按照上述方法对标准物质进行了均匀性检验，均匀性检验结果见表2。

表2

瓶间标准偏差的估计值用下式计算：

重复性标准偏差s_r可以用s₂ ²计算：

结果发现s_bb<s_r，需要考察重复性标准偏差sr对sbb的影响，以反映重复性标准偏差相对较大的情况，计算公式为：

结果表明：估计得到的瓶间标准偏差s_bb小于重复性标准偏差s_r对s_bb的影响s'_bb，故瓶间均匀性标准偏差s'_bb＝u_bb＝0.0083ng/g。本标准物质不均匀性引入的不确定度为0.0083ng/g。

(二)稳定性检验

稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性量值随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。

对于本标准物质，采取同步稳定性评估的方法，按先密后疏的原则，考察在规定保存条件(0-4℃)下，保存1、2、4、6个月后样品的稳定性。按照如前所述的液相色谱法-同位素稀释质谱法进行测试，每次取3个包装，每个包装取3个子样，测3次，计算平均值，把9个子样的测量结果平均值作为检测结果。采用趋势分析法对标准物质的稳定性监测数据进行计算，并评价稳定性引入的不确定度，以结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。由于没有物理或化学模型能够真实地描述猪肉中克伦特罗的降解机理，故可选用线性模型作为该候选标准物质的经验模型，稳定性性评价结果见表3，其中，长期稳定性趋势分析结果(t＝6个月)。由表3可知稳定性引入的不确定为0.013ug/kg。

表3

(三)定值

标准物质采用本实验室建立的经过国内实验室验证和国际比对认的高准确度同位素稀释质谱法进行定值。

试样用0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液为提取溶剂，通过匀浆进行提取，经SPE净化后，采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法(LC-ID-MS/MS)进行分析，经反相色谱分离后，根据保留时间和特征离子对定性，采用同位素稀释质谱法对样品进行定量。测定结果和有关参数有以下函数关系：

式中：

x：试样中克伦特罗的含量，单位：μg/kg；

样品中克伦特罗与同位素标记克伦特罗的峰面积比值；

校准标准溶液中同位素标记克伦特罗与克伦特罗的峰面积比值；

校准标准溶液中克伦特罗与同位素标记克伦特罗的质量比值；

(M_D9-CL)_样：样品中加入同位素标记克伦特罗的质量；

W：样品的质量，单位：g。

具体的，标准溶液配制方法为：

准确称取盐酸克伦特罗适量，重量法配制浓度为100mg/kg的克伦特罗甲醇储备液；0.1％甲酸水为溶剂逐级稀释，配制系列工作溶液，供试。

准确称取同位素标记克伦特罗(D9-克伦特罗)，重量法配制浓度为1000mg/kg的D9-克伦特罗储备液，0.1％甲酸水为溶剂逐级稀释，配制系列工作溶液，供试。

样品预处理与仪器分析方法同前均匀性的检测方法。

定值结果：猪肉粉中克伦特罗标准物质的标准值为0.68μg/kg，不确定度为0.06μg/kg。

图2为猪肉粉样品中克伦特罗LC-MS/MS的MRM检测谱图。

综上所述，本方法制备的含有克伦特罗的冻干猪肉粉，均匀性和稳定性良好，采用经过国际比对验证准确性的液相色谱同位素稀释质谱法(LC-ID-MS/MS)法进行标准物质的准确定值。该标准物质的成功研制保证了相关兽药残留测量结果的准确、可比、可溯源，对食品安全检测有着极其重大的社会效益和经济效益。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种含有克伦特罗的猪肉粉标准物质制备方法，其特征在于，包括：

克伦特罗污染的猪的喂养：体重60-75kg的健康猪，将一天的猪饲料中混入克伦特罗，搅拌均匀，所述健康猪自由采食和饮用水，连续饲喂28-30天，停药当天宰杀，获取克伦特罗污染的猪肌肉；

样品预处理：取克伦特罗污染的猪肌肉，剔除残留肥肉、筋膜，切块；冷冻研磨至粉碎，作为原料；取原料适量，按照1:2的比例，加水稀释成肉浆，得到样品，装入冷冻盘；

预冻样品：所述样品共晶点为-20℃，设置预冻温度设为-25℃；预冻速率为15℃/min；快速预冻3小时；

第一阶段升华干燥：将所述冷冻盘装入干箱，干箱压力较长时间保持不变，以5℃/次的速率逐步提高搁板温度，直至-5℃；当样品干层与冻干层的交界面到达盘底并消失，样品温度升至接近于搁板温度或者干箱真空度与冷阱真空度接近并保持恒定时，继续干燥1小时；

第二阶段升华干燥：一次调整搁板温度至样品允许的最高温度0-4℃以下；自动调节渗气，时间为2小时之上；样品达到最高允许温度后，恢复干箱内真空度，恒温3小时；

研磨制粉：取出冻干样品；在研磨机中研碎，研磨速率为3000rpm，研磨2min；

筛分：采用35目筛，超声脉冲筛分样品；

混匀：样品置于10L混匀桶中，连续混匀6小时；

得到猪肉粉基体标准物质，

猪肉粉中克伦特罗的含量为0.68μg/kg，

并且，所述猪肉粉中克伦特罗的含量是利用LC-MS/MS进行检测的，所述检测的仪器方法：

色谱柱：ACQUITY CSH C18色谱柱，100mm×3.0mm，1.7μm；美国Waters公司；

流动相A为乙腈，流动相B为含0.1％甲酸的20％乙腈水溶液；

梯度洗脱程序：0～5min，100％B；5～5.1min，100％B～30％B；5.1～9min，30％B；9～9.1min，30％B～100％B；9.1～16min，100％B；

流速：0.2mL/min；

柱温：40℃；

进样体积：20μL；

质谱条件：正离子扫描方式；多反应检测(MRM)；雾化气压力(GS1):50Psi；辅助气压力(GS2)：60Psi；气帘气压力(CUR)：15Psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞室入口电压(EP)：13V；碰撞室出口电压(CXP)：14V；CAD：medium；IS：1500V；TEM:600℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

所述冷冻盘中样品厚度不能超过2cm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

辐照：采用放射性同位素钴-60产生的γ射线，对冻干粉进行辐照杀菌，辐照剂量为4kGy。