CN112903874B - 一种猪尿中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪尿中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质及其制备方法。饲喂动物获得含游离态和扼合态克伦特罗浓度范围的猪尿原料，定值后冷冻干燥获得均匀性稳定性满足要求的猪尿冻干粉中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质；加水复溶还原成液体，经混合生物酶酶解法前处理，液相色谱‑串联质谱/同位素内标法联合定值，确定该基体标准物质中克伦特罗含量。本发明所提供的标准物质，反映了经动物体内代谢后猪尿中克伦特罗标准物质真实状况，定值更准确、均匀性和稳定性良好，可广泛应用于动物尿液中克伦特罗残留检测、快速筛查产品的质量验证、仪器检测方法评价、实验室内部质量控制以及实验室能力验证比对等众多领域。

Description

一种猪尿中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质及其制备 方法

技术领域

本发明涉及兽药残留检测标准品制备技术领域，具体涉及一种经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质及其制备方法。

背景技术

克伦特罗是β₂-受体激动剂类中的一种，也是被俗称“瘦肉精”一类物质中最早出现、最具典型的代表之一的有毒有害化合物，其特点为成本低、起效快，曾多次被曝光在动物养殖中违法违禁使用，给人体健康和公共卫生安全带来严重风险。克伦特罗一直被列入动物食品重点监测参数，目前针对于猪肉、猪肝等可食性动物组织及猪尿中克伦特罗残留测定方法较多，仪器方法通常用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)法，快速筛查方法一般用酶联免疫(ELISA)法和胶体金试纸条法。

但是由于对猪肉、猪肝等进入市场后的产品进行监测，存在着较强的滞后性，不仅难以及时追溯和追回，也难以对有问题的产品进行处理销毁，同时造成极大的浪费。因此，针对动物产品质量安全的监控，动物尿液是一种具有方便、快捷、直接、低成本、可预警等突出优点的监测靶物质，可以在不必屠宰动物的前提下及时有效监测动物是否使用违禁物质，从而更有效的提升食品安全的监管能力，避免问题产品流入市场，还可以通过动物代谢等方法消除残留物，减少不必要的损失，具有极强的经济效益。

截止目前，无论是在养殖场、屠宰场普遍使用的ELISA法和试纸条法等快速筛查检测，还是在实验室使用LC-MS/MS等仪器法确证检测猪尿中克伦特罗的工作，都是通过临时添加克伦特罗标准溶液到保存时间很久的所谓“空白”猪尿中，模拟配制含有克伦特罗的猪尿阳性样品，作为质控样品或基质标准样品。但是通过人工外源添加“临时配制”得到的样品，如果对待测尿液不进行生物酶预处理，则现场采用常规的试剂盒或试纸条检测效果，往往不准确，导致出现假阴性结果。因此通过“临时配制”得到的模拟含有克伦特罗的所谓猪尿阳性样品，在食品安全监测工作中，特别是对实验条件不能满足严格的现场环境下进行检测，会严重影响到检测结果的准确性、可靠性和可比性。现场检测结果认为不超标的尿液样品，在实验室经酶解法前处理后进行液相色谱-串联质谱法测试，结果有可能会超标。

对于现场快速筛查检测，无法用酶解前处理的情况下，为满足现场检测的需要，降低检测成本和检测时间，并提高检测结果的准确度，迫切需要提供一种更准确、更适用的尿液基体标准品，用于校正检测和用于质量控制，从而会极大提高现场筛查猪尿中克伦特罗含量的准确性，有助于进一步加强食品安全监测工作中对克伦特罗的准确、有效监控，规范快速筛查检测方法中市场产品的验证，科学评判确证检测中的仪器方法评价，提高实验室内部质量控制和外部能力比对水平。

发明内容

本发明的目的是提供经动物代谢后含游离态及扼合态克伦特罗的标准物质，本发明所提供的标准物质能真实反映动物尿液中的克伦特罗含量，且均匀性和稳定性良好的。

本发明在长期检测、筛查中发现，同样的尿液样品，如果采用临时添加配制的标准品进行校准定值，现场快速检测和采用实验室高效液相色谱-串联质谱法检测相比较，样品的检测结果会出现较大偏差，表现在现场快速检测条件下部分显示克伦特罗为阴性的样品，如果同时经过实验室高效液相色谱-串联质谱法检测后，会显示克伦特罗阳性。发明人又尝试在实验室内，按照高效液相色谱-串联质谱方法中预先进行酶处理后的阳性尿液进行现场快速试剂盒方法检测，发现两种方法的结果又趋于一致。这说明高效液相色谱-串联质谱法中加酶预处理待测尿液的步骤，是确保现场快速检测与实验室内高效液相色谱-串联质谱法检测结果准确性一致的关键因素。本发明进一步研究后发现，是由于阳性尿液中同时含有游离态和扼合态的克伦特罗，而现有常用检测的标准物质是人工外源添加“临时配制”得到的猪尿中克伦特罗，这种临时配制的标准品中由于没有经过动物体内循环代谢过程，因此其内的克伦特罗全部处于游离态。在实验室用高效液相色谱-串联质谱法检测中，因为使用了酶预处理，样品中的克伦特罗全部处于游离态，故对其检测结果没有影响；但在现场快速检测中，因为没有使用酶预处理，导致了现场快速检测结果比实验室检测结果偏低，容易出现假阴性结果。

因此，在现场快速筛查检测中不能再使用“临时配制”的标准品，而应该使用一种同时含游离态和扼合态的克伦特罗标准物质，方能在现场快速筛查检测中准确定值，否则会造成假阴性样品流入市场，造成食品安全隐患。

鉴于此，本发明考虑通过人工饲喂屠宰前的动物(猪)代谢后获得含游离态和扼合态克伦特罗的猪尿，作为标准物质用于克伦特罗现场快速检测的校正标准品。经过了大量的摸索和数据对比后，发现经过本发明方法获得经动物代谢后含游离态和扼合态克伦特罗的猪尿作为标准物质，在现场快速检测中定值结果，与实验室仪器法检测结果一致，避免了使用临时添加配制的标准品出现的假阴性问题，其均匀性和稳定性良好，获得多家实验室的联合定值。

具体来说，本发明提供的经动物代谢后猪尿冻干粉中含游离态和扼合态克伦特罗的制备方法，通过配制含有克伦特罗的饲料饲喂生猪，采集饲喂第72-96h之间的尿液，混匀；所述含有克伦特罗的饲料中克伦特罗的浓度为1-10mg/kg。发明人经过长期试验证明，由于生猪个体的差异和代谢程度的不同，过低或过高浓度的饲料，有可能会得到含有过低克伦特罗浓度(小于3ng/mL)或过高克伦特罗浓度(大于 50ng/mL)的猪尿基质。过低克伦特罗浓度的猪尿，会失去对快速筛查检测中胶体金试纸条的质量评价作用；过高克伦特罗浓度的猪尿，对后期标准物质的制备中需要用空白尿液进行稀释，会影响到经过动物代谢后得到尿液的真实比例。

优选地，采集饲喂第72-96小时之间的尿液。

优选地，所述含有克伦特罗的饲料中克伦特罗的浓度为5mg/kg。用于制备标准物质采集尿液的生猪数目不低于10头；所述生猪为出栏前2-4周的生猪。

在本发明的一个实施例中，申请人通过对12份样本得到的猪尿样品连续不间断的检测，发现具有普遍的如下规律，在饲喂3小时后，猪尿中即可测出含有克伦特罗；在3-72小时期间，猪尿中克伦特罗的浓度处于连续上升期；在72h后含量处于平稳。停止饲喂后，在3-48h 内处于迅速下降期；在48h后猪尿中克伦特罗含量处于缓慢下降和平稳期。通过对12份平行样本连续检测得到的克伦特罗含量数据分析研究发现，连续饲喂一定浓度克伦特罗的饲料后，经过72h后得到的尿液混匀，其含量范围在3-30ng/mL范围内。

由于现有的用快速筛查检测猪尿中克伦特罗的胶体金试纸条，最低检测下限为3ng/mL；且经试验证明，饲喂停药后2-4周内，在生猪上市屠宰前，经过生猪代谢后的猪尿中克伦特罗浓度，经LC-MS/MS 法检测含量在10-20ng/mL之间。因此在这个范围内克伦特罗含量浓度，最为适用于直接定值、制备尿液基体标准物质，同时方便用于胶体金试纸条的快速筛查检测，也能用于实验室确证的LC-MS/MS法检测。

本发明提供的含有经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质的制备方法中，在取得尿液后，将混匀后的尿液过滤、离心，取上清液，移入棕色样品瓶中，冷冻干燥至水分小于2％。本发明制备方法中，还包括标准物质进行均匀性检测、稳定性检测，进行定值和不确定度评估。

冷冻干燥过程中进行特定的辅助冷冻干燥手段。

1.冷冻控制，第一阶段温度为-25度，设定时间为60分钟，持续时间为90分钟

2.捕水器制冷设定温度为-50度，持续时间20分钟。

3.预抽真空为0.2mbar，报警真空为0.8mbar，报警真空持续时间为120分钟。

4.一次干燥的第一阶段的温度为5度，设定时间为360分钟，持续时间为360分钟，设定真空为0.7mbar。一次干燥的第二阶段设定温度为20度，设定时间为60分钟，持续时间为180分钟，设定真空为 0.7mbar。

5.解析干燥的设定温度为40度，设定时间为240分钟，持续时间是9999分钟。冻干总时间约为26小时。

本发明提供了上述制备方法制得的经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质。所述标准物质的定量值为12.80-14.43ng，平均值为13.67ng，其中克伦特罗的游离态质量比占克伦特罗总量约 90％-95％，扼合态克伦特罗的质量比占克伦特罗总量约5％-10％。通过均匀性检验，对猪尿中克伦特罗特性量值均通过F检验，表明基体标准物质均匀性良好；长期稳定性监测结果，该猪尿冻干粉标准物质 12个月内，稳定性良好。

本发明提供一种适用于现场快速检测猪尿中克伦特罗含量的检测方法，以上述的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质作为检测的标准品，无需对待检测尿液进行酶解预处理步骤。

进一步，本发明提供了该经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质在猪肉食品安全监管中的应用。

本发明提供了所制得的经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质在检测待生猪体内克伦特罗含量中的应用。

所述经动物代谢后猪尿冻干粉中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质使用时，加入纯水溶解，涡旋振荡，超声后静置3-8min，即作为含有定值克伦特罗猪尿的标准品使用，检测待测尿液时，无需对待检测尿液进行酶解预处理步骤。

所述经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质使用时，先加入一定体积的水溶解，涡旋，超声后静置，即作为含有定值克伦特罗猪尿的标准品使用。

本发明的有益效果在于：本发明制备的经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质，与人为外源添加临时配制、克伦特罗呈游离状态的“模拟标物”相比，更能真实反映克伦特罗经过动物体内代谢后，在猪尿液中呈扼合状态的实际基质状态(试验证明在酶解和不酶解两种处理情况下，得到的数值有5％-10％左右的差距)均匀性和稳定性良好，填补了国内尚无经动物代谢后猪尿冻干粉中扼合态克伦特罗标准物质的空白，主要应用于动物尿液中克伦特罗残留检测、快速筛查产品的质量验证、仪器确认检测方法评价、实验室内部质量控制和实验室能力比对等领域，具有极好的社会效益和经济效益，应用前景良好。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1标准物质候选物制备

在约1000头规模的生猪养殖场中，随机选取12头具有代表性的普通育肥期间生猪(4-5月龄，出栏前2-4周，体重120kg左右)，作为平行试验的代表样本。配制含有一定浓度克伦特罗的饲料后，定期饲喂生猪。同时开始连续收集猪尿液于洁净的样品瓶中，测定克伦特罗的含量。通过对12份样本得到的猪尿样品连续不间断的检测，发现具有普遍的如下规律，在饲喂3小时后，猪尿中即可测出含有克伦特罗；在3-72小时期间，猪尿中克伦特罗的浓度处于连续上升期；在72h后含量处于平稳。停止饲喂后，在3-48h内处于迅速下降期；在48h后猪尿中克伦特罗含量处于缓慢下降和平稳期。

通过对12份平行样本连续检测得到的克伦特罗含量数据分析研究发现，连续饲喂一定浓度克伦特罗的饲料后，经过72h后得到的尿液混匀，其含量范围在在3-20ng/mL范围内。因此，经过生猪体内代谢之后得到的这个浓度范围，最为适用于直接定值、制备尿液基体标准物质。

具体过程如下：配制含有1mg/kg-10mg/kg克伦特罗的生猪配合饲料，每日早晨生猪起床后，空腹饲喂生猪，采集饲喂第72h之后的尿液，混匀后过滤、离心，准确取上清液1.0mL，移入5mL棕色样品瓶中进行冷冻干燥，至水分小于2％。冷冻干燥过程中进行特定的辅助冷冻干燥手段，如下：

1.冷冻控制，第一阶段温度为-25℃，从室温调整到该设定的温度需要的时间为60min，持续该温度时间为90min。

2.捕水器制冷设定温度为-50℃，持续时间20min。

3.预抽真空为0.2mbar，报警真空为0.8mbar，报警真空持续时间为120min。

4.一次干燥的第一阶段的温度为5℃，从上一个温度调整到该设定的温度需要的时间为360min，持续时间为360min，设定真空为 0.7mbar。一次干燥的第二阶段设定温度为20℃，从上一个温度调整到该设定的温度需要的时间为60min，持续时间为180min，设定真空为0.7mbar。

5.解析干燥的设定温度为40℃，从上一个温度调整到该设定的温度需要的时间为240分钟，持续时间是80分钟。冻干总时间约为26小时。

瓶盖密封后，立即转移至-20℃冷冻保存，即可得含有克伦特罗猪尿冻干粉基体标准物质。

使用前，在棕色样品瓶中准确加入一定体积的水，涡旋20s，超声1min，静置，即可作为含有定值克伦特罗猪尿使用。

实施例2均匀性检验

按照整个封装过程的前、中、后随机抽取11个包装单元，随机抽取的样品从1到11编号，每个随机抽取的单元再平行取3个子样，记录编号为1-1、1-2、1-3，2-1、2-2、2-3，......，11-1、11-2、11-3。均匀性检验方法采用液相色谱-同位素稀释质谱法测定结果(具体方法参数见标准物质定值部分)，结果采用方差分析法进行统计分析，通过比较F检验值与F临界值的大小来判定。对猪尿中克伦特罗成分特性量值均匀性检验测定结果及数据统计分析结果见表1。

表1含有克伦特罗的猪尿基体标准物质均匀性检验结果(ng/mL)

上述实验数据表明，对猪尿中克伦特罗特性量值均通过F检验，表明基体标准物质均匀性良好，满足技术规范要求。此外，本实验均匀性检验时的取样量为1.0mL，因此，本项目基体标准物质制备均采用1.0mL作为最小取样量。

实施例3稳定性

分别在第0、1、3、6、9、12个月开展长期稳定性监测研究。每次随机取3个包装单元，每个单元平行测定三次，测量方法与均匀性检验采用的方法相同，均为液相色谱-同位素稀释色谱质谱法。取三个包装单元测量结果的平均值作为该次长期稳定性监测结果，结果分析采用趋势分析法，以监测时间和结果拟合直线，并对结果统计分析。对含有克伦特罗的猪尿冻干粉标准物质长期稳定性监测结果如见表2 所示，以检测时间和结果拟合直线，采用趋势分析法，对稳定性检验结果统计分析。

表2含有克伦特罗的猪尿冻干粉基体标准物质长期稳定性监测结果(ng)

实施例4定值

1、测量方法选择

根据JJF1006-1994一级标准物质技术规范要求，针对一级标准物质定值可采用两种不同原理的方法同时定值，或者采用一种方法多家实验室联合定值的方式。然而，复杂基体标准物质一般难以满足两种不同原理方法同时定值，通常采用一种绝对测量方法——同位素稀释质谱法(IDMS)、多家实验室联合定值的方式。本项目采用基于稳定同位素内标的方式，对样品前处理以及仪器方法进行优化，采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法定值。

2、实验仪器与试剂

Aglient 1290液相色谱(美国Aglient公司)；Aglient Tripe Auad MS 6495质谱(美国Aglient公司)；METTLER XS105十万分之一天平及 METTLER AL104万分之一天平均已通过北京市计量检测科学研究院校准；高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；Vortex-Genie2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；BAKERBOND固相萃取仪(美国Waters公司)；水浴氮吹仪(美国Organomation公司，N-EVAPTM 111，OA-SYSTM水浴加热装置)。

甲醇、乙腈(LC-MS级别，美国Fisher公司)；甲酸(LC-MS级别，德国Sigma公司)；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(迪马公司，300U)，实验室用水为经Milli-Q净水系统(0.22μm过滤膜)过滤的去离子水；克伦特罗纯度标准物质为国家二级有证标准物质，编号为 GBW(E)061890，纯度为99.0％，不确定度为0.6％(k＝2)，购自国家标准物质研究中心；克伦特罗-D9：纯度为99.0％，德国Witega实验室公司。

3、标准溶液制备

(1)克伦特罗标准储备液

准确称取10.0mg(精确到0.1mg)克伦特罗固体标准品，用甲醇充分溶解并定容于10mL棕色容量瓶中，配制浓度为1mg/mL的克伦特罗标准储备液，于-20℃条件下保存，有效期12个月。

(2)克伦特罗-D9内标储备液

准确称取1.0mg(精确到0.1mg)克伦特罗-D9同位素固体标准品，用甲醇充分溶解并定容于10mL棕色容量瓶中，配制浓度为100mg/L 的克伦特罗-D9标准储备液，于-20℃条件下保存，有效期12个月。

(3)克伦特罗标准中间液

准确量取1.0mL克伦特罗标准储备液，用甲醇稀释定容于100mL 棕色瓶中，配制浓度为10mg/L的克伦特罗标准中间液，于-20℃条件下保存，有效期6个月。

(4)克伦特罗-D9内标中间液

准确量取1.0mL克伦特罗-D9内标标准储备液，用甲醇稀释定容于100mL棕色瓶中，配制浓度为1mg/L的克伦特罗-D9标准中间液，于-20℃条件下保存，有效期6个月。

(5)标准工作液

分别准确量一定量克伦特罗标准中间液，用流动相分别稀释配制浓度为1、2、10、20、50μg/L的克伦特罗标准工作液，现用现配。

(6)同位素标记工作液

准确量一定量克伦特罗-D9标准中间液，用流动相稀释配制浓度为200μg/L的克伦特罗-D9标准工作液，现用现配。

(7)混合校准溶液

准确量取一定量的克伦特罗标准工作溶液和克伦特罗-D9标准工作溶液，混合后用流动相定容，浓度应与样品上机浓度尽可能接近，用于单点校准，现用现配。

4、样品前处理

提取：取冻干的基体标物样品，加入1.0mL水后充分涡旋(对液体样品则为吸取1.0mL置于5mL试管中)，加入适量同位素标记内标工作液，再加入2mol/L的乙酸铵缓冲液(pH 5.2)0.25mL，涡旋振荡1min 后，加入40μL的β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在37℃下避光水浴振荡16h。加入10mL乙酸乙酯，涡旋混匀1min，在5000r/min离心 5min，转移上清液于15mL离心管，40℃氮吹至干，用0.1％甲酸水溶液1.0mL溶解，过0.22μm滤膜，上机测定。

5、LC-MSMS测定方法

色谱条件：

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，粒径1.8μm)或相当者；

流动相A(0.1％甲酸水溶液)：流动相B(0.1％甲酸甲醇溶液) ＝1:1；

流速：0.2mL/min；进样体积为5μL；柱温30℃。

质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描方式；多反应监测(MRM) 模式；

离子源温度：110℃；毛细管电压：3.5kV；

干燥气温度：350℃；

干燥气(氮气)流速：450L/h；

碰撞气(氩气)流速：50L/h。

其他质谱参数见表3。

表3质谱MRM监测克伦特罗离子对信息

6、测量结果计算

LC-MS/MS上机顺序为：空白样品—校准溶液—标准物质样品—校准溶液—标准物质样品...，最后对猪尿中克伦特罗质量浓度采用单点计算法进行计算。计算公式如下：

C₁-对猪尿中被测物的质量浓度(ng/mL)；

R₁-仪器测得的对猪尿样品溶液中被测物与同位素标记物的峰面积比；

R₂-仪器测得的标准工作溶液中被测物与同位素标记物的峰面积比；

M₁′-加入到对猪尿样品中的同位素标记物的质量(mg)；

M₂′-加入到标准工作溶液中的同位素标记物的质量(mg)；

M₂-加入到标准工作溶液中的标准物质质量(mg)；

M_S-对猪尿样品的体积(mL)；

P_CRM-标准物质的纯度。

7、多家实验室联合定值

本项目对含有克伦特罗猪尿冻干粉标准物质的研制，采用液相色谱-同位素稀释-串联质谱法(LC-ID-MSMS)作为定值的测量方法， 8家实验室联合定值。

表4对含有克伦特罗的猪尿冻干粉标准物质含量合作定值结果(ng)

综上所示，对含有克伦特罗猪尿冻干粉标准物质特性量值定值，结果为8家定值实验室的总平均值13.67ng，即为标准值。

实施例5经动物代谢后猪尿冻干粉中克伦特罗标准物质和临时配制猪尿中克伦特罗标准品在现场快速筛查检测与实验室仪器检测的结果比较

用本发明制备的经动物代谢后的克伦特罗猪尿冻干粉标准物质 (已定值克伦特罗为3ng)，加入1.0mL水后复溶，配制成浓度为 3ng/mL的校准溶液，作为校准标液1。

用现有技术取空白猪尿液，临时加入克伦特罗标准溶液，配制成浓度为3ng/mL的溶液，作为校准标液2。

分别用校准标液1和校准标液2对同一份经动物代谢后采集的猪尿样品(经LC-MS/MS测定克伦特罗质量浓度为3ng/mL)进行校准测定，具体如下。

1、测量方法选择

(1)方法1：实验室检测法，采用稳定同位素做内标，对样品酶解前处理，高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法定值。

(2)方法2：现场快速筛查检测法，根据现场快速筛查检测的情况，采用常见的酶联免疫试剂盒(ELISA)法，因为现场检测，样品不酶解，直接测定样品，用试剂盒本身所带标准溶液酶标仪曲线定量。

2、实验仪器与试剂

(1)方法1：同上述实施例4。

(2)方法2：酶标仪(国产，带曲线定量软件)；打印机；微量移液器；移液槽。

3、标准溶液制备

(1)方法1：校准标液1和校准标液2。

(2)方法2：校准标液1和校准标液2。

4、样品前处理

(1)方法1：同上述实施例4。

(2)方法2：直接吸取测定。

5、测定方法

(1)方法1：同上述实施例4。

(2)方法2：酶标仪曲线定量。

6、测量结果计算

(1)方法1：同上述实施例4。

(2)方法2：酶标仪直接读数。

7、两种方法定值比较

用方法1和方法2分别对相同的样品平行测定7次，分别用校准标液1和校准标液2定值后，结果如下表5和表6所示。

表5样品经过方法1后的定值结果比较(ng/mL)

样品平行	校准标液1	偏差值1	校准标液2	偏差值2
					1	3.01	+0.01	3.06	+0.06
2	3.04	+0.04	3.04	+0.04
					3	3.02	+0.02	3.05	+0.05
4	3.05	+0.05	3.05	+0.05
					5	3.02	+0.02	3.02	+0.02
6	3.03	+0.03	3.06	+0.06
					7	3.04	+0.04	3.07	+0.07
平均值	3.03	+0.03	3.05	+0.05

表6样品经过方法2后的定值结果比较(ng/mL)

样品平行	校准标液1	偏差值1	校准标液2	偏差值2
					1	3.02	+0.02	2.72	-0.28
2	3.04	+0.04	2.74	-0.26
					3	3.01	+0.01	2.75	-0.25
4	3.00	+0.00	2.80	-0.20
					5	3.05	+0.05	2.77	-0.23
6	3.04	+0.04	2.78	-0.22
					7	3.07	+0.07	2.82	-0.18
平均值	3.03	+0.03	2.77	-0.23

通过对比表5和表6数据可明显看出：

在方法1(实验室仪器方法检测)情况下，对样品因为都用到了酶解法进行前处理，尿液中呈扼合态的克伦特罗最后也都变成了游离态，因此在方法1(实验室仪器方法检测)情况下，用本研究制备的校准标液1和用临时配制的校准标液2，对测定样品的最终的结果与样品的实际值(3ng/mL)差别不大(<0.05ng/mL)。

但是对于方法2(现场快速筛查方法)，对样品，因为都不能用酶解法进行前处理，样品中部分呈扼合态的克伦特罗无法测出，用本研究制备的校准标液1对实际样品的校准测定后，与方法1和样品的实际值(3ng/mL)的结果非常接近(+0.03ng/mL)；而用临时添加配制的校准标液2对实际样品的校准测定结果比方法1和样品的实际值(3ng/mL)的结果偏低较多(-0.23ng/mL)。

因此，在方法2(现场快速筛查方法)情况下，对于经动物代谢后得到的实际样品，如果用临时配制方法做校准，得到的结果会比实际值偏低较多。尤其是当用目前在屠宰场和养殖场使用最多的胶体金试纸条进行现场快速筛查检测情况下，按照目前胶体金试纸条在对猪尿中克伦特罗的检测限(3ng/mL)判断，对于实际含量在大于检测限(3ng/mL)的样品，容易造成显示为阴性(<3ng/mL)，从而造成假阴性情况的“漏网之鱼”，从而造成有害的动物产品流入市场，危害人体健康，对食品安全造成风险隐患。

由此得出如下结论：

1、如果用现有技术的标准品(添加标液到空白样品中临时配制方式)作为校正液，则在现场检测的结果，比实验室仪器测定结果偏低，容易造成现场检测的假阴性结果。

2、用本发明定值后的标准品作为校正液，则现场检测结果和实验室结果二者非常接近，从而说明本发明的标准品发挥了准确作用，在不用酶处理的情况下，都能实现准确检测。现场和实验室两种检测方法效果差异不大。说明本发明的标准品更具有实际应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种经动物代谢后猪尿冻干粉中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质的制备方法，其特征在于，配制含有克伦特罗的饲料，饲喂生猪，采集饲喂第72-96h之间的尿液，混匀；所述含有克伦特罗的饲料中克伦特罗的浓度为1-10mg/kg；

经动物代谢后的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质中克伦特罗的游离态质量比占克伦特罗总量90％-95％，扼合态克伦特罗的质量比占克伦特罗总量5％-10％，所述标准物质的定量值为12.80-14.43ng。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生猪不低于10头，所述生猪为出栏前2-4周的生猪。

3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，将混匀后的尿液过滤、离心，取上清液，移入棕色样品瓶中，冷冻干燥至水分小于2％；和/或还包括对猪尿冻干粉标准物质进行均匀性检测、稳定性检测，进行定值和不确定度评估。

4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制得的经动物代谢后的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质。

5.一种适用于现场快速检测猪尿中克伦特罗含量的检测方法，其特征在于，以权利要求4所述的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质作为检测定值的标准品，无需对待检测尿液进行酶解预处理步骤。

6.一种提高现场快速检测猪尿中克伦特罗含量准确率的方法，其特征在于，以权利要求4所述的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质作为检测定值的标准品，无需对待检测尿液进行酶解预处理步骤，用检测试剂盒或试纸条进行检测，以检测待测猪尿液中克伦特罗的含量。

7.权利要求4所述的含游离态和扼合态克伦特罗猪尿冻干粉标准物质在猪肉食品安全监管、或在检测待宰生猪体内克伦特罗含量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述经动物代谢后猪尿冻干粉中含游离态和扼合态克伦特罗标准物质使用时，加入纯水溶解，涡旋振荡，超声后静置3-8min，即作为含有定值克伦特罗猪尿的标准品使用，检测待测尿液时，无需对待检测尿液进行酶解预处理步骤。