CN113984930B - 一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法，先在试样中加入同位素内标中间液，去离子水和二氯甲烷进行提取，将二氯甲烷层进行净化，得到的上清液吹近干，用乙腈、甲酸和水的混合溶液溶解，涡旋振荡、过滤得到待测液，再用高效液相色谱串联质谱仪测定，得到相应的谱图信息；将混合标准工作液用相同条件测定，将两组谱图信息进行比对，最后从混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中内标物的浓度和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、混合标准工作液中内标物的峰面积和浓度、提取体积、试样重量、样液的提取体积和定容体积、稀释倍数选取相应的参数，用内标法和外标法求出所有兴奋剂的含量。

Description

一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法
技术领域
本发明涉及兴奋剂检测技术领域，具体为一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法。
背景技术
兴奋剂检测是运动会比赛过程中最重要的一个监督环节。动物在食用含兴奋剂的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，继而通过生物链在人体内残留，可能会导致食用者出现不同程度的中毒症状，而运动员也属于其中的食用者。为维护竞技体育的公平和纯洁，保证运动员的身体健康，兴奋剂检测已成为所有体育比赛中不可或缺的重要手段。
普拉雄酮(即去氢表雄酮)是机体外周循环中常见的甾体激素，会在血液中转化为类固醇的药物，其中含有睾丸素，可促进肌肉增生，提高骨骼肌和力量增长；增强男性的性特征；促进红细胞生成，增加血红蛋白的浓度和血容量，提高耐力；在主动或被动减体时保持肌肉体积；加快训练后恢复等。玉米赤霉醇类是一种非甾体类同化激素，主要包括6种结构类似的化合物分别是：α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮。玉米赤霉醇类是一种效果明显的促生长剂，常被用于牛羊等动物饲养，人体摄入该类物质有助于提高肌肉密度强度，其具有明显的雌激素和蛋白同化样作用。虽然，我国和欧洲均明确禁止将该类物质用于禽畜养殖中，但仍然有许多养殖户在饲养过程中违法添加该类药物。不仅运动员误食会导致兴奋剂阳性，对普通消费者的身体健康也是一种伤害。所以检测动物饲料中可能含有的7种蛋白同化制剂类兴奋剂，即去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮势在必行。
为满足上述兴奋剂检测的需要，需要不断完善检测方法，提高检测方法的灵敏度和准确性。以前曾采用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用(GC/MSD)等方法进行检测，但是这7种蛋白同化制剂类兴奋剂在检测过程中需要水解、净化等、会产生操作复杂、检测周期长、灵敏度较差等问题，很多科技工作者已经采用更为先进的、灵敏度更高的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用检测方法，但还是不能对这7种蛋白同化制剂类兴奋剂进行检测。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法，能实现同时检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的含量。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法，所述的兴奋剂为去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，包括如下步骤：
步骤1，在试样中加入与所述7种蛋白同化制剂类兴奋剂对应的同位素内标中间液，之后依次加入去离子水和二氯甲烷进行提取，从得到的提取液中分离出二氯甲烷层，将二氯甲烷层进行净化，得到上清液，将上清液吹至近干，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，最后涡旋振荡、过滤，得到待测液；
步骤2，将待测液用高效液相色谱串联含有电喷雾离子源的质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；
将由所述的7种蛋白同化制剂类兴奋剂混合标准物质中间液和与所述7种蛋白同化制剂类兴奋剂对应的同位素内标中间液，用空白基质配制的混合标准工作液，用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；
步骤4，结合以下两种方式，完成动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测；
结合待测液获得过程中的混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中内标物的浓度和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、混合标准工作液中内标物的峰面积和浓度、提取体积、试样重量、样液的提取体积和定容体积、稀释倍数，采用内标法，求出去氢表雄酮的含量。
结合待测液获得过程中的混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、提取体积、试样重量、样液的提取体积和定容体积、稀释倍数，采用外标法，求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量。
优选的，步骤1中试样、去离子水和二氯甲烷的比例为(4.85～5.15)g：20mL：20mL。
优选的，步骤1在试样中加入所述的同位素内标中间液后，先加入去离子水涡旋混匀，静置之后加入二氯甲烷涡旋振荡，最后将所得的混合体系离心，得到二氯甲烷层。
优选的，步骤1将二氯甲烷层放入内含聚碳酸酯、N-丙基乙二胺、C18和MgSO4的净化管中，之后涡旋混匀，最后静置5～8min，得到上清液。
优选的，步骤2中的高效液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：
0～2min内，流动相A的体积比例保持75％；2～5min内，流动相A的体积比例由75％线性减小至30％；5～7min内，流动相A的体积比例保持30％；7～7.1min内，流动相A的体积比例由30％线性减小至10％；7.1～9min内，流动相A的比例保持10％，9～9.1min内，流动相A的比例由10％线性增加至75％，9.1～13min内，流动相A的比例保持75％；
所述的质谱仪采用如下参数进行工作：
扫描方式为多反应监测，毛细管电压为3.5kv，鞘气温度为400℃，干燥器温度为300℃，鞘气流量为11L/min，干燥器流量为7L/min。
优选的，步骤2采用如下过程配制混合标准工作液：
先采用步骤1中对应的过程对所述动物饲料对应的空白试样进行提取，之后将得到的水层和二氯甲烷层混合均匀得到混合溶剂，在混合溶剂中加入由所述的7种兴奋剂标准物质配制的混合标准使用液和由所述的7种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制的同位素内标中间液，涡旋混匀，之后离心得到二氯甲烷层，将二氯甲烷层进行净化，得到上清液，将上清液吹至近干，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，最后涡旋振荡、过滤，得到待测液，得到混合标准工作液。
优选的，所述的上清液，在35～50℃温度下，使用氮气吹至近干；
所述的混合溶液由甲酸水溶液与乙腈以75:25的体积比混合后得到，甲酸水溶液中甲酸体积浓度为0.1％。
优选的，步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比；
步骤3在进行谱图信息比对时，采用如下标准：
待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3。
优选的，步骤4采用如下公式求出去氢表雄酮的含量：
式中：
X为试样中各待测物的含量，单位为微克每千克；
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
ci为待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
A为待测液中待测组分的峰面积；
Asi为混合标准工作液中内标物的峰面积；
m为样品的重量，单位为克；
V1为二氯甲烷提取试样时的体积，单位为毫升；
V2为溶解样液的混合溶液体积，单位为毫升；
csi—混合标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
Ai为待测液中内标物的峰面积；
As为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
f为稀释倍数。
优选的，步骤4采用如下公式求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量：
X为试样中各待测物的含量，单位为微克每千克；
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为微克每升；
A为待测液中待测组分的峰面积；
As为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
m为样品的重量，单位为克；
V1为二氯甲烷提取试样时的体积，单位为毫升；
V2为溶解样液的混合溶液体积，单位为毫升；
f为稀释倍数。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法，由于需要采用外标法和内标法分别计算这7种兴奋剂的含量，所以在试样前处理之前加入去氢表雄酮-D5内标中间液，之后依次利用去离子水和二氯甲烷对饲料形成的试样进行提取，从得到的提取液中可分离出二氯甲烷层，该二氯甲烷层中含有待检测的7种蛋白同化制剂类兴奋剂，对二氯甲烷层进行净化，可初步除去干扰物质，然后将得到的上清液吹干，得到含有这些蛋白同化制剂类兴奋剂的残渣，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，采用涡旋振荡的方式使残渣充分溶解，最后过滤得到待测液，以保证含有所述的7种兴奋剂且不存在干扰物质，再利用液相色谱串联含有电喷雾离子源的质谱仪测定待测液和混合标准工作液中的兴奋剂，通过得到的谱图信息进行比对，可判断试样中存在相应的目标物，进而得到待测兴奋剂和对应内标物的峰面积，采用内标法，结合待测液获得过程中的混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中内标物的浓度和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、混合标准工作液中内标物的峰面积和浓度、提取体积、试样重量、样液的提取体积和定容体积、稀释倍数求出去氢表雄酮的含量，类似的，利用外标法，结合待测液获得过程中的混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、提取体积、试样重量、样液的提取体积和定容体积、稀释倍数求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量。本发明前处理简单，分析时间短，灵敏度高，检测种类全面，能够保障体育赛事对兴奋剂检测的需要。
附图说明
图1为去氢表雄酮和玉米赤霉醇类这7种物质的标准溶液总离子流图(1.5ng/mL)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明为一种对动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂进行检测的方法，包括以下步骤：
所述7种兴奋剂为去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮。
步骤1)混合标准使用液的制备；
a)标准储备液：分别准确称取适量7种兴奋剂标准物质(精确至0.01mg)，分别加入甲醇溶解，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，置于-18℃以下避光冷冻保存。
b)混合标准中间液：分别移取7种兴奋剂标准储备液适量于10mL容量瓶中，用甲醇分别稀释至刻度，配成浓度均为10μg/mL的混合标准中间液。
c)混合标准使用液：精确吸取适量混合标准中间液，用甲醇配成10ng/mL～100ng/mL的混合标准使用液。现配现用。
d)同位素内标标准储备液：准确称取适量去氢表雄酮-D5标准物质(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，配制成100μg/mL的标准储备液，置于-18℃以下避光冷冻保存。
e)同位素内标中间液：精确吸取同位素内标标准储备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度均为10μg/mL的同位素内标中间液。现配现用。
f)混合标准工作液：精确称取空白样品5.00g，加入20mL去离子水涡旋混匀，静置5min，再加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡10min，于8000r/min离心5min，得到水层和二氯甲烷层，移取水层和二氯甲烷层各5mL后进行混合，作为溶剂。
准确吸取适量的混合标准使用液，及适量同位素内标中间液加入上述溶剂中，涡旋30s，于8000r/min离心5min，得到水层和二氯甲烷层，取二氯甲烷层2mL放入预配好的净化管(内含聚碳酸酯即PC:7.5mg，N-丙基乙二胺即PSA:50mg，C18:50mg，MgSO4:150mg)中，涡旋混匀1min，静置5min，取净化后的二氯甲烷层1mL，在35～50℃下，用氮气吹至近干，再准确加入1.0mL流动相(甲酸水溶液与乙腈以75:25的体积比混合后得到的溶液，甲酸水溶液中甲酸体积浓度为0.1％)溶解残渣，涡旋振荡1min，过0.22μm尼龙滤膜，作为混合标准工作溶液。现配现用。
步骤2，从全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g，用高速粉碎机粉碎均匀或搅拌器搅拌均匀，过0.45mm内径的筛子，以保证取样的均匀性，使样品大小颗粒均匀，之后充分混匀，将混匀好的样品分成两份，密封并标明标记，室温保存。
步骤3，精确称取样品4.85～5.15g，加入20μL同位素内标中间液，加入20mL去离子水涡旋混匀，静置4～6min，加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡8～15min，于7000～9000r/min离心4～8min，得到水层和二氯甲烷层，取二氯甲烷层2mL放入预配好的净化管(内含聚碳酸酯即PC:7.5mg，N-丙基乙二胺即PSA:50mg，C18:50mg，MgSO4:150mg)中，涡旋混匀1～3min，静置5～8min，取净化后的二氯甲烷层1mL，在35～50℃下，用氮气吹至近干，用1.0mL流动相(甲酸水溶液与乙腈以75:25的体积比混合后得到的溶液，甲酸水溶液中甲酸体积浓度为0.1％)溶解残渣，涡旋振荡1～3min，超声溶解1～3min，过0.22μm尼龙滤膜，得到待测液供液相色谱-串联质谱仪测定。
步骤4，液相色谱-串联质谱仪测定
1，色谱条件
a)色谱柱：C18(粒径：5μm，规格为2.0mm×150mm)；
b)柱温：35℃；
c)进样量：10μL；
d)流速：0.2mL/min
e)色谱柱流动相：A相：甲酸体积浓度为0.1％的水溶液，B相：乙腈，梯度洗脱程序见表1；
表1梯度洗脱程序
时间(min) A(％) B(％)
0.0 75 25
2.0 75 25
5.0 30 70
7.0 30 70
7.1 10 90
9.0 10 90
9.1 75 25
13.0 75 25
2，质谱参考条件
a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；
b)扫描方式：多反应监测(简写为MRM)；
c)毛细管电压：3.5kv(ESI)；
d)：鞘气温度：400℃；
e)干燥器温度：300℃；
f)鞘气流量：11L/min；
g)干燥器流量：7L/min；
通过以上方法，得到了如表2(表2a和表2b)的相关数据。
表2a 7种蛋白同化制剂类兴奋剂的一部分参数
表2b7种蛋白同化制剂类兴奋剂的另一部分参数
步骤5，含量测定
a，定性测定
根据试样中目标物的含量情况，选择浓度一致的混合标准工作液按照上述条件用色谱柱及其相应的梯度洗脱程序进行液相色谱-串联质谱仪分析。若检测的色谱峰对应的保留时间与混合标准工作液的保留时间偏差在±5％以内，且不超过0.5min；质谱得到的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度的偏差不超过表3的规定，且每个离子的信噪比≥3，则可判断样品中存在相应的目标物。
表3定性测定时相对离子丰度的允许偏差
相对离子丰度，％ 允许偏差，％
＞50 ±20
20～50 ±25
10～20 ±30
≤10 ±50
1.5ng/mL的去氢表雄酮及α-玉米赤霉醇这7种兴奋剂混合标准工作液总离子流图如图1所示，可以看到峰型很好，说明可以将它们进行分离。
b，定量测定
根据试样中目标物的含量情况，选取浓度相近的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱仪分析。混合标准工作液和待测液中目标物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如表2所示。以峰面积之比做单点校正定量。
c，空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
d，结果计算和表述
除去氢表雄酮以外的其它6种兴奋剂的含量，采用外标法定量，按照(1)式计算，计算结果需扣除空白值。
式中：
X—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
ci—待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A—待测液中待测组分的峰面积；
Asi—混合标准工作液中内标物的峰面积；
m—样品的重量，单位为克(g)；
V1—样液的提取体积，此处为20，单位为毫升(mL)；
V2—样液的定容体积，此处为1，单位为毫升(mL)；
csi—混合标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai—待测液中内标物的峰面积；
As—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
f—稀释倍数，步骤3对应的数值为1。
用重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
去氢表雄酮采用内标法定量，按照(2)式计算，计算结果需扣除空白值。
X—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
C—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为微克每升(ng/mL)；
A—待测液中待测组分的峰面积；
As—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
m—样品的重量，单位为克(g)；
V1—样液的提取体积，此处为15～30，单位为毫升(mL)；
V2—样液的定容体积，此处为1，单位为毫升(mL)；
f—稀释倍数，步骤3对应的数值为1。
在重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
本发明在实际应用中，提取试样时，按以下步骤：
精确称取样品5.00g，加入20μL同位素内标中间液，加入20mL去离子水涡旋混匀，静置5min，加入20mL二氯甲烷，涡旋振荡10min，于8000r/min离心5min，得到水层和二氯甲烷层，取二氯甲烷层2mL放入预配好的净化管(内含PC:7.5mg，PSA:50mg，C18:50mg，MgSO4:150mg)中，涡旋混匀1min，静置5min，取净化后的二氯甲烷层1mL，在40℃下，用氮气吹至近干，用1.0mL流动相(甲酸水溶液与乙腈以75:25的体积比混合后得到的溶液，甲酸水溶液中甲酸体积浓度为0.1％)溶解残渣，涡旋振荡1min，超声溶解1min，过0.22μm尼龙滤膜。
本发明所述描述方法的实际应用结果
使用本发明建立的方法对从陕西省各地抽取的13份动物饲料进行测定分析，结果，玉米赤霉烯酮检出8批次(为内源性兴奋剂，且检出含量均低于它们的限量值)，其它项目均未检出。详见表4
表4检出样品的种类及结果
在空白饲料中分别添加适量混合标准使用液和同位素内标中间液，使样品中化合物浓度分别为定量限，进行回收率测定，平行做3次，按照上述步骤试样提取方法分类进行处理并上机测定，得到本方法的回收率及精密度。结果表明饲料中7种蛋白同化制剂类相关参数的回收率范围为89.1％～98.7％，RSD为1.4％～4.4％，其中动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂相关参数回收率及精密度的详细结果如表5所示。
表5饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂回收率及精密度
实验结果表明，该方法得到的回收率均能够在国家现行有效标准GB/T27404－2008中规定的60％～120％内，精密度均在30％以内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。该方法在实际应用中，检测效果良好，可用于动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的快速检测。

Claims (1)

1.一种检测动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的方法，其特征在于，所述的兴奋剂为去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，包括如下步骤：
步骤1，在试样中加入与所述7种蛋白同化制剂类兴奋剂对应的同位素内标中间液后，先加入去离子水涡旋混匀，静置之后加入二氯甲烷涡旋振荡，最后将所得的混合体系离心，试样、去离子水和二氯甲烷的比例为（4.85~5.15）g：20mL：20mL，得到二氯甲烷层，将二氯甲烷层放入内含聚碳酸酯、N-丙基乙二胺、C18和MgSO4的净化管中，之后涡旋混匀，最后静置5~8min，得到上清液，将上清液在35~50℃温度下，使用氮气吹至近干，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，所述的混合溶液由甲酸水溶液与乙腈以75:25的体积比混合后得到，甲酸水溶液中甲酸体积浓度为0.1%，最后涡旋振荡、过滤，得到待测液；
步骤2，将待测液用C18色谱柱串联含有电喷雾离子源的质谱仪进行测定，C18色谱柱中流动相A为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1%，流动相B 为乙腈，质谱仪中扫描方式为多反应监测，毛细管电压为3.5 kv，鞘气温度为400℃，干燥器温度为300℃，鞘气流量为11L/min，干燥器流量为7L/min，得到相应的谱图信息；
先采用步骤1的过程对所述动物饲料对应的空白试样进行提取，之后将得到的水层和二氯甲烷层混合均匀得到混合溶剂，在混合溶剂中加入由7种兴奋剂标准物质配制的混合标准使用液和由所述的7种兴奋剂对应的同位素内标标准物质配制的同位素内标中间液，涡旋混匀，之后离心得到二氯甲烷层，将二氯甲烷层按照步骤1中二氯甲烷层的处理过程进行后续处理，得到混合标准工作液，将混合标准工作液用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
C18色谱柱的梯度洗脱程序如下：0~2 min内，流动相A的体积比例保持75%；2~5 min内，流动相A的体积比例由75%线性减小至30%；5~7 min内，流动相A的体积比例保持30%；7~7.1min内，流动相A的体积比例由30%线性减小至10%；7.1~9min内，流动相A的比例保持10%， 9~9.1 min内，流动相A的比例由10%线性增加至75%， 9.1~13min内，流动相A的比例保持75%；
所述的谱图信息均为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比；
步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息采用如下标准进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；
待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在±5%以内，且不超过±0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3；
步骤4，采用公式（1）求出去氢表雄酮的含量，采用公式（2）求出其余兴奋剂的含量，完成动物饲料中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测；
（1）
（2）
式中：
X 1为去氢表雄酮的含量，X 2为其余兴奋剂的含量，单位为微克每千克；
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
c i为待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
A为待测液中待测组分的峰面积；
A si为混合标准工作液中内标物的峰面积；
m为样品的重量，单位为克；
V为溶解样液的混合溶液体积，单位为毫升；
c si—混合标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
A i为待测液中内标物的峰面积；
A s为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
f为稀释倍数。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111820363A (zh) * 2019-04-17 2020-10-27 海南泓缘生物科技股份有限公司 一种对ddgs中赤霉烯酮毒素的生物降解方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111820363A (zh) * 2019-04-17 2020-10-27 海南泓缘生物科技股份有限公司 一种对ddgs中赤霉烯酮毒素的生物降解方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Liquid Chromatographic Determination of Zearalenone and Zearalenol in Animal Feeds and Grains, Using Fluorescence Detection;RENEE W. BAGNERIS 等;《J. ASSOC. OFF. ANAL. CHEM》;第69卷(第5期);10-13 *

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