CN113588804A - 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒 - Google Patents

一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测血清中5‑羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒，采用本发明的试剂盒检测血清中5‑羟色胺和褪黑素浓度时，在血清样品的预处理过程中采用碳酸钠溶液作为pH调节剂，甲基叔丁基醚作为萃取液，可以增强5‑羟色胺的萃取效率，并筛选出最佳的流动相、梯度和色谱柱等色谱条件，可以一次性对血清中5‑羟色胺和褪黑素同时进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.5分钟之内完成血清中5‑羟色胺和褪黑素的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中5‑羟色胺和褪黑素的定量分析，为临床上5‑羟色胺和褪黑素浓度监测提供简单快速的检测方法。

Description

一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种检测血清中5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)和褪黑素(Melatonin，MLT)浓度的试剂盒。
背景技术
5-羟色胺和褪黑素作为人体内重要的吲哚胺类神经递质，具有调节生物节律、情绪、认知、清除自由基、促进炎信号传导等多种生物活性，同时还对骨代谢有着重要的影响。褪黑素是5-羟色胺的代谢产物，可经由5-羟色胺N-乙酰转移酶和5-羟色胺N-乙酰甲氧基转移酶转化为褪黑素。近年来的国内外研究发现，5-羟色胺参与了骨形成和骨重吸收的过程，包括中枢5-羟色胺的促进成骨作用和外周5-羟色胺对骨形成的负性调节作用；而褪黑素同样具有促进成骨细胞增殖和分化以及骨分化标记物表达作用，同时可以通过促进OPG分泌和消除破骨细胞自由基来抑制破骨细胞分化，5-羟色胺和褪黑素在维持骨代谢动态平衡中都扮演着至关重要的角色，为骨质疏松等骨代谢疾病提供了新的靶点和方向。利用超高效液相色谱串联质谱技术同时检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度，可以通过循环5-羟色胺和褪黑素水平来反应人体骨量和骨结构的变化，用于评估老年人、绝经后妇女、2型糖尿患者等人群的骨质酥松情况，为临床诊治提供科学依据。
北京洛奇临床检验所股份有限公司于2016年申请的中国专利(申请号:201610220614.X)公开了一种“高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试剂盒”，其提供了一种利用高效液相色谱串联质谱法检测唾液中褪黑素的方法，该方法检测成分单一，基质简单，而且如果是只检测褪黑素，前处理条件非常简单，萃取液毒性也很大，氮吹时间较长，不适用于血清样品的前处理，即使采用该专利中的色谱条件和前处理方法也无法同时检测5-羟色胺和褪黑素，对于血清中褪黑素的临床检测没有太大参考价值。另一篇专利(申请号:201910058794.X)公开了“一种采用HPLC同时检测酱油中多种生物胺含量的方法”，该专利里中待测物虽然含有5-羟色胺，但待测样品不是生物样品，基质简单，而且前处理采用衍生法，非常复杂。
由于5-羟色胺和褪黑素分别属于碱性和中性物质，一同检测比较困难，目前关于血清中5-羟色胺和褪黑素的一同检测尚未见报道，Chau RM(Chau RM,PatelBA.Determination of serotonin,melatonin and metabolites in gastrointestinaltissue using high-performance liquid chromatography with electrochemicaldetection.Biomed Chromatogr.2009,23(2):175-81.)等人采用电化学分析技术一同检测胃肠道中的5-羟色胺和褪黑素，灵敏度低(褪黑素的检测限为70ng/ml)，不能满足临床血样检测需求，分析时间长(30min)，也不利于临床应用。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中5-羟色胺和褪黑素的应用。
本发明的技术方案如下：
一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒，
其中，5-羟色胺和褪黑素对应的内标物分别为：5-羟色胺-d4(5-HT-d4)，褪黑素-d4(MLT-d4)；
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将包含有5-羟色胺20μg/ml和褪黑素0.02μg/ml的混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；
褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml；
(3)混合内标溶液：
包含有5-羟色胺-d4 10000ng/ml和褪黑素-d4 40ng/ml的甲醇水溶液；
(4)萃取液：
甲基叔丁基醚；
(5)pH调节剂：
0.1M～0.5M碳酸钠溶液；
(6)质控品：
含有5-羟色胺和褪黑素的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至10000倍；
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至1000倍；
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
在一种优选方案中，上述洗脱液A为0.1％～0.15％甲酸-1～2.5mM乙酸铵水溶液，优选为0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液。
在一种优选方案中，pH调节剂为0.15M～0.25M碳酸钠溶液，优选为0.2M碳酸钠溶液。
对于本发明而言，对于本发明而言，空白血清基质为不含目标化合物的空白血清。在一种优选方案中，其中，空白血清基质为5％～15％甲醇水溶液，例如，空白血清基质为10％甲醇水溶液。
本发明提及的血清为人或动物的血清。
本发明提及的混合标准储备溶液按照如下方法制备：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液。
在一种优选方案中，在配制混合标准储备溶液时，所选择的甲醇水溶液为10％～80％甲醇水溶液，例如，甲醇水溶液为50％甲醇水溶液。
本发明提及的混合内标溶液按照如下方法制备：
以甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液。
在一种优选方案中，在配制内标母液和混合内标溶液时，所选择的甲醇水溶液为10％～80％甲醇水溶液，例如，甲醇水溶液为50％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将上述5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液；浓度参下表1。
表1 混合标准品储备溶液
Figure BDA0003111813370000041
本发明将混合标准品储备液以空白血清基质(10％甲醇水溶液)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μl混合标准溶液加入至390μl10％甲醇水溶液中作为第一个高值浓度点；取130μl第一高值浓度点用130μl 10％甲醇水溶液稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积10％甲醇水溶液稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积10％甲醇水溶液稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积10％甲醇水溶液稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积10％甲醇水溶液稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积10％甲醇水溶液稀释得第七高值浓度点。
本发明采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，具体过程如下表2(单位：ng/ml)。
表2 标曲配制
标曲 移取溶液(μL) 空白血清基质(μL) 5-羟色胺 褪黑素
S7 混合标准储备溶液10 390 500 0.5
S6 S7 130 130 250 0.25
S5 S7 30 270 50 0.05
S4 S6 30 270 25 0.025
S3 S5 30 270 5 0.005
S2 S4 30 270 2.5 0.0025
S1 S3 50 200 1 0.001
(3)混合内标溶液：
以50％甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液；浓度参考下表3。
表3 混合内标溶液配制
Figure BDA0003111813370000051
(4)萃取液：
甲基叔丁基醚；
(5)pH调节剂：
0.2M碳酸钠溶液；
(6)质控品：
取上述混合标准储备溶液以10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，具体如表4所示。
表4 质控品对应浓度(单位ng/ml)
Figure BDA0003111813370000052
QC(L)中包含：5-羟色胺2ng/ml和褪黑素0.002ng/ml；
QC(M)中包含：5-羟色胺20ng/ml和褪黑素0.02ng/ml；
QC(H)中包含：5-羟色胺400ng/ml和褪黑素0.4ng/ml。
采用本发明的试剂盒，检测血清中5-羟色胺和褪黑素时，将混合内标溶液与甲醇进行混合制备内标工作液。在一种优选方案中，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为1:99。
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中5-羟色胺和褪黑素的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
一种检测检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的方法，
其中，5-羟色胺和褪黑素对应的内标物分别为：5-羟色胺-d4(5-HT-d4)，褪黑素-d4(MLT-d4)；
血清样本通过预处理后，振荡、离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的5-羟色胺和褪黑素，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述5-羟色胺和褪黑素的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至2:98；在1.5-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.5-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.5分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/hr；锥孔气流速为150L/hr；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和乙酸铵，可有效提高目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中5-羟色胺和褪黑素的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5.5分钟之内完成5-羟色胺和褪黑素的分离和检测。在一种优选方案中，流动相A为0.1％～0.15％甲酸-1.5～2.5mM乙酸铵水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相A为0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用甲醇和0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液作为流动相，色谱柱型号为Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用氘代同位素作为内标，内标和待测物具有相同化学性质和基质效应，测定血清中的5-羟色胺和褪黑素时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为90～95:10～5。进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为90:10。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.4ml/min，优选为0.3ml/min。
进一步地，柱温为30～50℃，优选为40℃。
在一种方案中，进样体积为1～10μL，例如，1μL、5μL或10μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的5-羟色胺和褪黑素时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至2:98；在1.5-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.5-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10；每个样品采集时间为5.5分钟；梯度洗脱方式具体见表5；流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
表5 流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(ml/min) ％A ％B Curve
0.0 0.3 90 10 -
1.5 0.3 2 98 6
3.5 0.3 2 98 6
5.5 0.3 90 10 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/hr；锥孔气流速为150L/hr；质谱源参数如表6所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表7。
表6 质谱源参数
Figure BDA0003111813370000081
表7 5-羟色胺和褪黑素检测质谱参数
Figure BDA0003111813370000082
本发明提及的血清为人或动物的血清。
本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入内标工作液、pH调节剂和萃取液进行萃取，振荡，离心处理后取上清液经氮气流吹干后与复溶液混合，再次离心处理后取上清液待进样；其中，pH调节剂为0.1M～0.5M碳酸钠溶液，优选为0.15M～0.25M碳酸钠溶液，更优选为0.2M碳酸钠溶液。萃取液为甲基叔丁基醚。复溶液为10％～80％甲醇水溶液，优选为50％甲醇水溶液。内标工作液为混合内标溶液稀释100倍。
由于5-羟色胺和褪黑素分别属于碱性和中性物质，一同检测比较困难，目前关于血清中5-羟色胺和褪黑素的一同检测尚未见报道。本发明基于5-羟色胺和褪黑素的上述特点，在血清样品的预处理过程中发现采用pH调节剂(碳酸钠溶液)，甲基叔丁基醚作为萃取液，可以增强5-羟色胺的萃取效率，达到和褪黑素一同检测的目的，且萃取方式简单，前处理快速，易于在临床推广使用。在选择具体的pH调节剂时，采用类似的碱性溶液，例如，氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液作为pH调节剂，以及类似的萃取液，例如，正己烷、乙酸乙酯或两者的混合溶液作为萃取液对血清样品进行萃取时，对5-羟色胺的萃取效率很低，不能很好地将5-羟色胺萃取出来，无法满足血清样品中5-羟色胺的定量分析。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入20μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡3～10min后，在12000～15000r/min，4～20℃的条件下离心4～10min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50％甲醇水溶液混合，振荡1～5min后，在12000～15000r/min，4～20℃的条件下离心1～5min，取上清液待进样。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取200μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入20μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min后，在14800r/min，10℃的条件下离心5min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50％甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800r/min，10℃的条件下离心3min，取上清65μl，进样5μl。
在一种方案中，本发明提及的内标工作液按照如下方法制备：
以甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl，再加入至986μl甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液，其中包含：5-羟色胺-d4 10μg/ml，褪黑素-d4 0.04μg/ml。
取10uL上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇中，即得内标工作液，其中包含：5-羟色胺-d4 100ng/ml，褪黑素-d4 0.4ng/ml。
在一种优选方案中，在配制内标母液和混合内标溶液时，所选择的甲醇水溶液为10％～80％甲醇水溶液，例如，甲醇水溶液为50％甲醇水溶液。
在一种更优选方案中，本发明提及的内标工作液按照如下方法制备：
分别以50％甲醇水溶液配制5-羟色胺-d4和褪黑素-d4内标母液，再加入至986μl50％甲醇水溶液中，混匀得到1ml混合内标溶液，取10μl上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇中，即得内标工作液。
在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液；在混合标准品储备液中包含：5-羟色胺20μg/ml、褪黑素0.02μg/ml。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；
褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml。
在一种优选方案中，在配制混合标准储备溶液时，所选择的甲醇水溶液为10％～80％甲醇水溶液，例如，甲醇水溶液为50％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，其中，空白血清基质为5％～15％甲醇水溶液，进一步优选地，空白血清基质为10％甲醇水溶液。
在一种更优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液。
每个浓度点样品取200μl于1.5ml离心管中，向其中加入20μl内标工作液，20μl0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min后，在14800r/min，10℃的条件下离心5min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50％甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800r/min，10℃的条件下离心3min，取上清液65μl，进样5μl。
本发明还包括制备质控品，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以空白血清基质(10％甲醇水溶液)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至10000倍。
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至1000倍。
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
QC(L)中包含：5-羟色胺2ng/ml和褪黑素0.002ng/ml。
QC(M)中包含：5-羟色胺20ng/ml和褪黑素0.02ng/ml。
QC(H)中包含：5-羟色胺400ng/ml和褪黑素0.4ng/ml。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的试剂盒检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度时，在血清样品的预处理过程中采用碳酸钠溶液作为pH调节剂，甲基叔丁基醚作为萃取液，可以增强5-羟色胺的萃取效率，并筛选出最佳的流动相、梯度和色谱柱等色谱条件，可以一次性对血清中5-羟色胺和褪黑素同时进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.5分钟之内完成血清中5-羟色胺和褪黑素的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中5-羟色胺和褪黑素的定量分析，为临床上5-羟色胺和褪黑素浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为5-羟色胺和褪黑素标准品的提取离子流谱图；
图2为血清中5-羟色胺和褪黑素的提取离子流谱图；
图3为5-羟色胺定量下限和血清样本采用不同前处理的响应对比图；
图4为褪黑素定量下限和血清样本采用不同前处理的响应对比图；
图5为5-羟色胺定量下限和血清样本采用不同流动相的响应对比图；
图6为褪黑素定量下限和血清样本采用不同流动相的响应对比图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于中国医科大学附属第一医院2020年12月份病房收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；MS级乙酸铵(Sigma，美国)；HPLC级甲基叔丁基醚(Fisher，美国)；碳酸钠(国药)；色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表8。
表8 标准品和内标
Figure BDA0003111813370000111
(4)质控品：含有5-羟色胺和褪黑素的空白血清，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表4所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。其中，流动相A即洗脱液A；流动相B即洗脱液B。
(2)在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流速为800L/hr，锥孔气流速150L/hr；质谱源参数如表6所示，同时监测了各目标物及其对应内标，各个目标物的质谱参数见表7。
二、实验过程
(1)标准品配制：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：5-羟色胺20μg/ml、褪黑素0.02μg/ml，详见表1。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(10％甲醇水溶液)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，详见表2，所述校准品溶液的七个浓度点为：
5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；
褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml。
(2)混合内标溶液配制
以50％甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液；详见表3。
(3)质控品配制：
取上述标准储备溶液以空白血清基质(10％甲醇水溶液)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表4所示。
QC(L)中包含：5-羟色胺2ng/ml和褪黑素0.002ng/ml。
QC(M)中包含：5-羟色胺20ng/ml和褪黑素0.02ng/ml。
QC(H)中包含：5-羟色胺400ng/ml和褪黑素0.4ng/ml。
(4)样品处理
1)标准品处理：七个不同校准品样本每个浓度点取200μl于1.5ml离心管中，向其中加入20μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min后，在14800r/min，10℃的条件下离心5min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl50％甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800r/min，10℃的条件下离心3min，取上清液65μl，进样5μl。
2)血清样品前处理：取10μl上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇中，即得内标工作液。取200μl血清于1.5ml离心管中，向其中加入20μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min后，在14800r/min，10℃的条件下离心5min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50％甲醇水溶液混合，振荡3min后，在14800r/min，10℃的条件下离心3min，取上清液65μl，进样5μl。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各200μl于1.5ml离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表9。
表9 5-羟色胺和褪黑素浓度分析试剂盒组分的制备
Figure BDA0003111813370000131
Figure BDA0003111813370000141
备注：所述内标工作液按照如下方法制备：取10μl上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇中，即得内标工作液。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：5-羟色胺和褪黑素的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为5-羟色胺和褪黑素标准品的提取离子流谱图；图2为血清样本中5-羟色胺和褪黑素的提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。5-羟色胺和褪黑素在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表10。
表10 5-羟色胺和褪黑素线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0003111813370000142
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，5-羟色胺和褪黑素的加标回收率在97.45％-108.06％之间，5次重复试验的RSD在0.75％-1.97％范围，统计结果见表11。
表11 5-羟色胺和褪黑素添加回收率结果
Figure BDA0003111813370000143
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度5-羟色胺和褪黑素标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以内标法定量测定5-羟色胺和褪黑素的浓度，批内精密度为0.75％～3.00％，三日内分3批处理，计算批间精密度为1.57％～2.86％，结果见表12。
表12 批内及批间精密度测试结果
Figure BDA0003111813370000151
五、讨论
本发明建立了ID-UPLC-MS/MS一同测定人体血清中5-羟色胺和褪黑素的方法。血清用量少(仅需200μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需5.5分钟，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，5-羟色胺和褪黑素的加标回收率为加标回收率在97.45％-108.06％之间，5次重复试验的RSD在0.75％-1.97％范围，准确度良好。
方法的重现性结果表明，5-羟色胺和褪黑素的批内精密度为0.75％～3.00％，三日内分3批处理，计算批间精密度为1.57％～2.86％，方法的重现性良好。且建立的血清样品前处理过程非常简单，血清用量仅200μL。
总之，采用本发明的试剂盒检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度时，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.5分钟之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的定量分析，为相关的化合物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
对比例1：
本对比例所提供的检测血清中5-羟色胺和褪黑素的方法，它包括以下步骤：
1、液质条件
(1)流动相A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/hr；锥孔气流速为150L/hr；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。
2、实验过程
(1)标准品配制：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：5-羟色胺20μg/ml、褪黑素0.02μg/ml。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(10％甲醇水溶液)配制成1ng/ml 5-羟色胺和0.001ng/ml褪黑素(定量下限样品)。
(2)内标工作液
以50％甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl50％甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液，其中包含：5-羟色胺-d4 10μg/ml，褪黑素-d4 0.04μg/ml。
取10μl上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇，即得内标工作液，其中包含：5-羟色胺-d4 100ng/ml，褪黑素-d4 0.4ng/ml。
(3)样品处理
1)标准品前处理1：配制标曲定量下限样品500μl，向其中加入内标工作液10μl，混合60s，加入100μl NaOH溶液(1mol/l)和1ml萃取液(正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1)，涡旋混合5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干，10％甲醇水溶液100μl复溶，涡旋5min；以13000转/分离心3min，取上清进样。
2)血清样品前处理1：取血清样本500μl，向其中加入内标工作液10μl，混合60s，加入100μl NaOH溶液(1mol/l)和1ml萃取液(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1)，涡旋混合5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干，10％甲醇水溶液100μl复溶，涡旋5min；以13000转/分离心3min，取上清进样。
3)标准品前处理2：配制标曲定量下限样品200μl，向其中加入内标工作液20μl，20μl0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干，50％甲醇水溶液100μl复溶，振荡5min；以13000转/分离心3min，取上清进样。
4)血清样品前处理2：取血清样本200μl，向其中加入内标工作液20μl，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及900μl甲基叔丁基醚，振荡5min，以13000转/分离心10min，取上清800μl；氮气吹干，50％甲醇水溶液100μl复溶，振荡5min；以13000转/分离心3min，取上清进样。
分别取前处理1中标准品和血清样品以及前处理2中标准品和血清样品按照上述色谱条件进行检测，实验结果如图3和图4所示。
对标准品和血清样品分别采用前处理1和前处理2两种处理方式进行前处理，考察褪黑素和5-羟色胺在响应强度方面的差异。由图3和图4可知，褪黑素在响应强度方面的差别不大，但前处理2的处理方式略好一些；但对于5-羟色胺而言，在响应强度方面，前处理2的处理效率比前处理1的处理效率高50倍左右，取得了显著的效果，而前处理1由于较低的处理效率无法满足血清样品中5-羟色胺的定量分析，也就是说，采用前处理1的方式处理血清样品，无法一次性对血清中5-羟色胺和褪黑素同时进行检测。
对比例2
本对比例所提供的检测血清中5-羟色胺和褪黑素的方法，其步骤与对比例1的步骤相同，前处理方式方法采用前处理2，区别仅在于流动相A不同。其中，流动相A1：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相A2：0.05％甲酸水溶液。
分别取前处理2中标准品和血清样品参照对比例1中色谱条件进行检测，实验结果如图5和图6所示。
对标准品和血清样品采用前处理2的处理方式进行前处理，参照对比例1中色谱条件进行检测，考察褪黑素和5-羟色胺在响应强度方面的差异。由图5和图6可知，在相同的样品前处理方式下，分别采用流动相A1和流动相A2进行色谱分析时，5-羟色胺在离子化效率方面的差别不大，采用流动相A1时的离子化效率略好一些；但对于5-羟色胺而言，在离子化效率方面的差别很明显，采用流动相A1时的离子化效率是流动相A2时的离子化效率的6倍左右，也就是说，在相同的前处理方式和基本相同的色谱条件下，以0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液-甲醇作为混合流动相明显优于0.05％甲酸水溶液-甲醇作为混合流动相。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒，
所述5-羟色胺和褪黑素对应的内标物分别为：5-羟色胺-d4和褪黑素-d4；
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将包含有5-羟色胺20μg/ml和褪黑素0.02μg/ml的混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；
褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml；
(3)混合内标溶液：
包含有5-羟色胺-d4 10000ng/ml和褪黑素-d4 40ng/ml的甲醇水溶液；
(4)萃取液：
甲基叔丁基醚；
(5)pH调节剂：
0.1M～0.5M碳酸钠溶液；
(6)质控品：
含有5-羟色胺和褪黑素的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至10000倍；
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至1000倍；
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述洗脱液A为0.1％～0.15％甲酸-1.5～2.5mM乙酸铵水，优选为0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述pH调节剂为0.15M～0.25M碳酸钠溶液，优选为0.2M碳酸钠溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述空白血清基质为5％～15％甲醇水溶液，优选地，所述血清基质为10％甲醇水溶液；
所述血清为人或动物血清。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的试剂盒，其特征在于，
所述混合标准储备溶液按照如下方法制备：
将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，
所述混合内标溶液按照如下方法制备：
以甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，
所述甲醇水溶液为10％～80％甲醇水溶液，优选地，所述甲醇水溶液为50％甲醇水溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将上述5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；
分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液；将上述混合标准储备溶液以10％甲醇水溶液配制成七个不同浓度点的校准品溶液；
(3)混合内标溶液：
以50％甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；
分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl 50％甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液；
(4)萃取液：
甲基叔丁基醚；
(5)pH调节剂：
0.2M碳酸钠溶液；
(6)质控品：
取上述混合标准储备溶液以10％甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：5-羟色胺2ng/ml和褪黑素0.002ng/ml；
QC(M)中包含：5-羟色胺20ng/ml和褪黑素0.02ng/ml；
QC(H)中包含：5-羟色胺400ng/ml和褪黑素0.4ng/ml。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，将混合内标溶液与甲醇以体积比为1:99进行混合制备内标工作液，用于超高效液相色谱检测。
10.权利要求1所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中5-羟色胺和褪黑素的应用。
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