CN111896647A - 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，所述的有机酸分别为：HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β‑HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α‑HB、HVA、VMA、HIA和KA；所述试剂盒包括如下试剂：洗脱液、混合标准品储备液、混合内标工作液、稀释液和质控品；本发明利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出尿液中21种有机酸的含量；将尿液样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，5.0分钟之内可同时检测21种有机酸，可用于临床上尿液有机酸的诊断及健康评估。
Description
技术领域
本发明属于尿液检测技术领域，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒。
背景技术
有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，是身体代谢产生的一大类化合物。它们来着膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，大部分有机酸直接参与生物化学反应，有机酸被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所需的营养。同时，有机酸具有抑菌、消炎、抗病毒、抗突变、抗癌等作用，有的能够增加灌装动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、促进钙和铁的吸收，有的具有帮助胃消化脂肪和蛋白质；有的则具有预防疾病和促进新城代谢的作用，从而有益于人体的健康。所以，尿液中有机酸测试，可以作为代谢异常的一个重要诊断指标。代谢失衡是一种常见且普遍的疾病，可能是许多慢性疾病的基础，例如疲劳，胃肠功能障碍，肌肉/关节问题，情绪障碍和头痛。这些疾病通常对长期治疗和持续改善有抵抗力。有机酸分析传统上可以用于早期检测/排除或监测代谢障碍。尿液样本可用于评估肠道，肝脏和神经系统健康以及能量代谢和营养缺乏。
人体摄入的蛋白质、脂肪和碳水化合物，被用于产生细胞能量和提供细胞功能所需要的营养，但食物中同时也应该包括其它必要的营养素，只有在这些必要营养素的帮助下食物才能转化为能量和营养被人体吸收。当食物代谢时，某些必要营养素的缺乏会导致能量生成和营养吸收的通路受阻，同时产生的有机酸代谢产物就会排入尿液中。因此通过尿液中有机酸的测定可以评估个体能量代谢情况和特定的营养素是否缺乏。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明特定的代谢通路被阻碍，该代谢通路所必需的营养素水平较低。尿液有机酸测试有助于理解营养素代谢的执行方式，并确定代谢周期可能存在不平衡的地方。
目前针对抗尿液中有机酸浓度检测的方法主要为超高效液相-串联质谱法或气相色谱-串联质谱法，存在灵敏度低、单个样品分析时间长、样本用量大和进样量大等缺陷，有些甚至采用外标法定量，存在基质干扰，准确性差。文献报道的多为一次性针对1-3种有机酸进行检测，比如中国专利申请(公开号：CN103837624A)公开了“一种尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法”，一次仅检测两种有机酸，而尿液中有机酸种类繁多，检测过程繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，所述的21种有机酸分别为：马尿酸(HA)、4-羟基苯甲酸(HBA)、4-羟苯基乙酸(HPA)、吲哚乙酸(IAA)、丙三羧酸(TCA)、黄尿酸(XA)、β-羟基异戊酸(β-HIVA)、辛二酸(SA)、乙基丙二酸(EMA)、丙酮酸(PYA)、柠檬酸(CA)、琥珀酸(SCA)、羟甲基戊二酸(HMGA)、杏仁酸(MDA)、苯基乙醛酸(PGA)、葡萄糖酸(GA)、α-羟基丁酸(α-HB)、高香草酸(HVA)、香草基扁桃酸(VMA)、5-羟基吲哚乙酸(HIA)和犬尿喹啉酸(KA)；
上述21种有机酸对应的同位素内标物分别为：马尿酸-d5(HA-d5)、4-羟基苯甲酸-d4(HBA-d4)、吲哚乙酸-d3(IAA-d3)、黄尿酸-d4(XA-d4)、柠檬酸-d4(CA-d4)、琥珀酸-d4(SCA-d4)、苯基乙醛酸-d4(PGA-d4)、α-羟基丁酸-d3(α-HB-d3)、高香草酸-d3(HVA-d3)、香草基扁桃酸-d3(VMA-d3)、5-羟基吲哚乙酸-d5(HIA-d5)和犬尿喹啉酸-d5(KA-d5)；
所述试剂盒包括如下试剂：
洗脱液：洗脱液A：0.01～0.5％甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈；
混合标准品储备液：含有HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β-HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α-HB、HVA、VMA、HIA和KA的甲醇溶液；
混合内标工作液：含有HA-d5、HBA-d4、IAA-d3、XA-d4、CA-d4、SCA-d4、PGA-d4、α-HB-d3、HVA-d3、VMA-d3、HIA-d5和KA-d5的甲醇甲酸混合溶液；
稀释液：甲酸水溶液；
质控品：含有21种有机酸的空白尿液基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)和QC(H)，其中：
QC(L)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至250倍；
QC(M)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至50倍；
QC(H)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至10倍。
其中，所述尿液为人或动物尿液。
其中，所述的洗脱液A为体积浓度为0.1％甲酸水溶液。
其中，所述的空白尿液基质为体积浓度为0.1～1％的甲酸水溶液。
其中，所述的稀释液为体积浓度为0.1～1％的甲酸水溶液。
其中，所述的混合标准品储备液为含有HA 1000μg/mL、HBA 50μg/mL、HPA 250μg/mL、IAA 250μg/mL、TCA 5μg/mL、XA 25μg/mL、β-HIVA 100μg/mL、SA 100μg/mL、EMA 250μg/mL、PYA250μg/mL、CA 2500μg/mL、SCA 100μg/mL、HMGA 100μg/mL、MDA 50μg/mL、PGA 5μg/mL、GA 1000μg/mL、α-HB 100μg/mL、HVA 100μg/mL、VMA 100μg/mL、HIA 100μg/mL和KA50μg/mL的甲醇水溶液。
其中，所述的混合内标工作液为含有HA-d5 10μg/mL、HBA-d4 0.5μg/mL、IAA-d32.5μg/mL、XA-d4 0.25μg/mL、CA-d4 25μg/mL、SCA-d4 1μg/mL、PGA-d4 0.05μg/mL、α-HB-d31μg/mL、HVA-d3 1μg/mL、VMA-d3 1μg/mL、HIA-d5 1μg/mL和KA-d5 0.5μg/mL的甲醇甲酸混合溶液。
上述超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒的制备方法；
(1)洗脱液A：配制0.01～0.5％甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
混合标准品储备液：称取各待测物标准品，分别加入纯甲醇完全溶解，将各待测物标准品配制成标准品母液，浓度分别为：HA 10mg/mL、HBA 5mg/mL、HPA 10mg/mL、IAA 5mg/mL、TCA 5mg/mL、XA 10mg/mL、β-HIVA 5mg/mL、SA4mg/mL、EMA 5mg/mL、PYA 5mg/mL、CA10mg/mL、SCA 5mg/mL、HMGA5mg/mL、MDA 5mg/mL、PGA 5mg/mL、GA 10mg/mL、α-HB 5mg/mL、HVA2mg/mL、VMA4mg/mL、HIA4mg/mL和KA 5mg/mL，然后将上述各标准品母液用甲醇水溶液配制成包含有HA 1000μg/mL、HBA 50μg/mL、HPA250μg/mL、IAA250μg/mL、TCA 5μg/mL、XA 25μg/mL、β-HIVA 100μg/mL、SA 100μg/mL、EMA 250μg/mL、PYA250μg/mL、CA 2500μg/mL、SCA100μg/mL、HMGA 100μg/mL、MDA 50μg/mL、PGA 5μg/mL、GA 1000μg/mL、α-HB 100μg/mL、HVA100μg/mL、VMA 100μg/mL、HIA 100μg/mL和KA 50μg/mL的混合标准品储备液；配制过程如表1所示：
表1混合标准品储备液的配制
(2)混合内标工作液：称取各同位素内标物，使用甲醇配制浓度分别为HA-d5 1mg/mL、HBA-d4 1mg/mL、IAA-d3 1mg/mL、XA-d4 1mg/mL、CA-d4 1mg/mL、SCA-d4 1mg/mL、PGA-d41mg/mL、α-HB-d3 1mg/mL、HVA-d3 1mg/mL、VMA-d3 2mg/mL、HIA-d5 2mg/mL、KA-d5 1mg/mL的同位素内标母液，然后将上述同位素内标母液以甲醇水溶液配制成包含有HA-d5 100μg/mL、HBA-d4 5μg/mL、IAA-d3 25μg/mL、XA-d4 2.5μg/mL、CA-d4 250μg/mL、SCA-d4 10μg/mL、PGA-d4 0.5μg/mL、α-HB-d3 10μg/mL、HVA-d3 10μg/mL、VMA-d3 10μg/mL、HIA-d5 10μg/mL和KA-d5 5μg/mL的混合内标溶液；具体配制过程如表2所示；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲酸水溶液，混合均匀得混合内标工作液；
表2混合内标溶液的配制
(3)稀释液：甲酸水溶液；
(4)质控品：取上述混合标准品储备液以空白尿液基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中21种有机酸质控品对应浓度见表3；
表3质控品对应浓度(单位：μg/mL)
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中有机酸的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理的尿液中的上述有机酸，先利用超高效液相色谱将目标待测物与尿液基质中的干扰组分进行分离，利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出尿液中21种有机酸的含量，具体色谱条件为：
色谱条件：
流动相A：含0.01～0.5％甲酸的水；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表4；
流速为0.2～0.5mL/min，柱温为35～45℃，进样体积为1～10μL；
表4流动相梯度洗脱参数
质谱条件：电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表5；
表5质谱检测参数
其中，所述预处理的尿液按照如下方法制备：取200μL尿液于1.5mL EP管中，12000～15000r/min，10～20℃离心2～5min后得到上清液，吸取上清液150μL过0.22μm尼龙滤膜，得到滤液；取20μL滤液，加入20μL混合内标工作液，涡旋混匀5s，加入760μL甲酸水溶液稀释，混匀后，取80μL稀释液至塑料内衬管中，待进样。
其中，采用梯度稀释法进行标曲配制，将混合标准品储备液以空白尿液基质配制成七个不同浓度点的标准品溶液，具体方法如下：
取40μL混合标准溶液加入至160μL 0.3％甲酸水溶液中作为第一个高值浓度点(S7)；取第一高值浓度点(S7)用等体积0.3％甲酸水溶液稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表6；
表6标准曲线配制及浓度(单位：μg/mL)
有益效果：采用本发明试剂盒检测尿液中的21种有机酸，包括HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β-HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α-HB、HVA、VMA、HIA和KA，将尿液样本与所有待测物的混合内标溶液混合，样本无需衍生化处理，前处理简单，样本用量小，灵敏度高，特异性强，检测种类较多，5.0min之内可同时检测21种有机酸，可用于临床上尿液有机酸的诊断及健康评估。
附图说明
图1为21种有机酸标准品选择离子流色谱图；
图2为尿液中21种有机酸选择离子流色谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级乙腈(Fisher，美国)；0.22μm尼龙滤膜(Millipore，美国)；色谱柱型号ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)(Waters，美国)。
(3)标准品：HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β-HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α-HB、HVA、VMA、HIA和KA；HA-d5、HBA-d4、IAA-d3、XA-d4、CA-d4、SCA-d4、PGA-d4、α-HB-d3、HVA-d3、VMA-d3、HIA-d5和KA-d5；TCA购自Sigma公司，其余购自TRC公司。
(4)质控品：含有21种有机酸的空白尿液基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放置50mL稀释液。
2.方法
(1)色谱条件：流动相A：含0.01～0.5％甲酸的水；流动相B：乙腈；色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；采用梯度洗脱的方式，见表4；流速为0.2～0.5mL/min，柱温为35～45℃，进样体积为1～10μL；
(2)质谱条件：电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行负离子扫描；喷雾电压为2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表5；
(3)混合标准品储备液的配制
分别准确移取各待测标准品配制为各个母液浓度，根据表1所示，将部分母液浓度用甲醇稀释为使用浓度，再将各母液浓度或使用浓度以体积浓度为50％的甲醇水溶液配制成混合标准品储备液；
(4)混合内标工作液的配制
准确称量各同位素内标物配制为各个母液浓度，根据表2所示，将部分母液浓度用甲醇稀释为使用浓度，再将各母液浓度或使用浓度以体积浓度为50％的甲醇水溶液配制成混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲酸水溶液，混合均匀得混合内标工作液；
(5)质控品配制：
取上述混合标准溶液以体积浓度为0.3％的甲酸水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中；
QC(L)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至250倍；
QC(M)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至50倍；
QC(H)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至10倍。
(6)样品处理
1)标准曲线配置：将上述混合标准品储备液以空白尿液基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，取40μL混合标准溶液加入至160μL 0.3％甲酸水溶液中作为第一个高值浓度点(S7)；取第一高值浓度点(S7)用等体积0.3％甲酸水溶液稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积0.3％甲酸水溶液稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如表6所示；
2)标准品前处理：每个浓度点样品取20μL于1.5mL EP管中，加入20μL内标工作液，涡旋混匀5s，加入760μL体积浓度为0.3％的甲酸水溶液稀释，混匀后，取80μL稀释液装入含内插管的进样瓶中待检测。
3)预处理的尿液的制备：取200μL尿液于1.5mL EP管中，12000～15000r/min，10～20℃离心2～5min后得到上清液，吸取上清液150μL过0.22μm尼龙滤膜，得到滤液；取20μL滤液，加入20μL混合内标工作液，涡旋混匀5s，加入760μL体积浓度为0.3％的甲酸水溶液稀释，混匀后，取80μL稀释液装入含内插管的进样瓶中待检测。
4)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各20μL于1.5mL EP管中，加入20uL内标工作液，涡旋混匀5s，加入760μL体积浓度为0.3％的甲酸水溶液稀释，混匀后，取80μL稀释液装入含内插管的进样瓶中待检测。
分析试剂盒中各组分见表7。
表7有机酸分析试剂盒组分(100人份)
3.方法验证
1)选择离子流谱图
由图1-2可知，21种有机酸的标准品与尿液样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
2)校准曲线
采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出尿液中有机酸待测物的浓度。21种有机酸在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，详见表8。
表8 21种有机酸的保留时间及线性范围
3)最低定量限
最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。部分有机酸在人体含量低，对方法的灵敏度和特异性要求较高，对方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足21种有机酸同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表9。
表9方法定量下限数据表
4)加标回收率考察：随机选取一例人尿液样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品储备液，以相同步骤重复处理并测定5次，计算回收率结果，见表10。结果显示，尿液中21种有机酸的加标回收率结果在85.4％-114.0％之间，5次重复试验的RSD在0.66％-14.83％范围，均满足要求。
表10尿液中21种有机酸的加标回收率结果(单位：μg/mL)
5)精密度试验：取尿液质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定15种有机酸的浓度，连续三日统计每天的批内精密度，计算批内精密度为2.49-14.76％；三日内分3批处理，计算批间精密度为4.24-14.77％，计算批间精密度，结果见表11。
表11批内、批间精密度试验结果(单位：μg/mL)
4.讨论
本发明采用UPLC-MS/MS方法测定了人体尿液中的21种有机酸，同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，特异性强。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
考察了21种有机酸在尿液中加标回收率，均在85％-115％，符合要求。方法的重现性结果表明，尿液中的21种有机酸的批内精密度为2.49-14.76％，批间精密度为4.24-14.77％，方法的重现性良好。
本方法较其他LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，只需一步离心过滤处理，样本用量小，检测种类较多，5.0分钟之内可同时检测21种有机酸，可用于临床上尿液中有机酸的诊断及健康评估。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的有机酸分别为：HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β-HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α-HB、HVA、VMA、HIA和KA；
所述试剂盒包括如下试剂：
洗脱液：洗脱液A：0.01～0.5％甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈；
混合标准品储备液：含有HA、HBA、HPA、IAA、TCA、XA、β-HIVA、SA、EMA、PYA、CA、SCA、HMGA、MDA、PGA、GA、α-HB、HVA、VMA、HIA和KA的甲醇溶液；
混合内标工作液：含有HA-d5、HBA-d4、IAA-d3、XA-d4、CA-d4、SCA-d4、PGA-d4、α-HB-d3、HVA-d3、VMA-d3、HIA-d5和KA-d5的甲醇-甲酸混合溶液；
稀释液：甲酸水溶液；
质控品：含有21种有机酸的空白尿液基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)和QC(H)，其中：
QC(L)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至250倍；
QC(M)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至50倍；
QC(H)为上述混合标准品储备液以空白尿液基质稀释至10倍。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述尿液为人或动物尿液。
3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的空白尿液基质为体积浓度为0.1～1％的甲酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的稀释液为体积浓度为0.1～1％的甲酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的混合标准品储备液为含有HA 1000μg/mL、HBA 50μg/mL、HPA250μg/mL、IAA 250μg/mL、TCA 5μg/mL、XA 25μg/mL、β-HIVA 100μg/mL、SA 100μg/mL、EMA250μg/mL、PYA 250μg/mL、CA 2500μg/mL、SCA 100μg/mL、HMGA 100μg/mL、MDA 50μg/mL、PGA5μg/mL、GA 1000μg/mL、α-HB 100μg/mL、HVA 100μg/mL、VMA 100μg/mL、HIA 100μg/mL和KA50μg/mL的甲醇水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中21种有机酸的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标工作液为含有HA-d5 10μg/mL、HBA-d4 0.5μg/mL、IAA-d3 2.5μg/mL、XA-d4 0.25μg/mL、CA-d4 25μg/mL、SCA-d4 1μg/mL、PGA-d4 0.05μg/mL、α-HB-d3 1μg/mL、HVA-d3 1μg/mL、VMA-d3 1μg/mL、HIA-d5 1μg/mL和KA-d5 0.5μg/mL的甲醇-甲酸混合溶液。
8.权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，
(1)洗脱液A：配制0.01～0.5％甲酸水溶液；
洗脱液B：乙腈；
(2)混合标准品储备液：称取各待测物标准品，分别加入纯甲醇完全溶解，将各待测物标准品配制成标准品母液，浓度分别为：HA 10mg/mL、HBA 5mg/mL、HPA 10mg/mL、IAA 5mg/mL、TCA 5mg/mL、XA 10mg/mL、β-HIVA 5mg/mL、SA4 mg/mL、EMA 5mg/mL、PYA 5mg/mL、CA10mg/mL、SCA 5mg/mL、HMGA 5mg/mL、MDA 5mg/mL、PGA 5mg/mL、GA 10mg/mL、α-HB 5mg/mL、HVA2 mg/mL、VMA 4mg/mL、HIA4 mg/mL和KA 5mg/mL，然后将上述各标准品母液用甲醇水溶液配制成包含有HA 1000μg/mL、HBA 50μg/mL、HPA250μg/mL、IAA250μg/mL、TCA 5μg/mL、XA25μg/mL、β-HIVA 100μg/mL、SA 100μg/mL、EMA 250μg/mL、PYA 250μg/mL、CA 2500μg/mL、SCA 100μg/mL、HMGA 100μg/mL、MDA 50μg/mL、PGA 5μg/mL、GA 1000μg/mL、α-HB 100μg/mL、HVA 100μg/mL、VMA 100μg/mL、HIA 100μg/mL和KA 50μg/mL的混合标准品储备液；
(3)混合内标工作液：称取各同位素内标物，使用甲醇配制浓度分别为HA-d5 1mg/mL、HBA-d4 1mg/mL、IAA-d3 1mg/mL、XA-d4 1mg/mL、CA-d4 1mg/mL、SCA-d4 1mg/mL、PGA-d41mg/mL、α-HB-d3 1mg/mL、HVA-d3 1mg/mL、VMA-d3 2mg/mL、HIA-d5 2mg/mL、KA-d5 1mg/mL的同位素内标母液，然后将上述同位素内标母液以甲醇水溶液配制成包含有HA-d5 100μg/mL、HBA-d4 5μg/mL、IAA-d3 25μg/mL、XA-d4 2.5μg/mL、CA-d4 250μg/mL、SCA-d4 10μg/mL、PGA-d4 0.5μg/mL、α-HB-d3 10μg/mL、HVA-d3 10μg/mL、VMA-d3 10μg/mL、HIA-d5 10μg/mL和KA-d5 5μg/mL的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲酸水溶液，混合均匀得混合内标工作液；
(4)稀释液：甲酸水溶液；
(5)质控品：取上述混合标准品储备液以空白尿液基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：HA 4μg/mL、HBA 0.2μg/mL、HPA 1μg/mL、IAA 1μg/mL、TCA 0.02μg/mL、XA0.1μg/mL、β-HIVA 0.4μg/mL、SA 0.4μg/mL、EMA 1μg/mL、PYA 1μg/mL、CA 10μg/mL、SCA 0.4μg/mL、HMGA 0.4μg/mL、MDA 0.2μg/mL、PGA 0.02μg/mL、GA 4μg/mL、α-HB 0.4μg/mL、HVA0.4μg/mL、VMA 0.4μg/mL、HIA 0.4μg/mL和KA 0.2μg/mL；
QC(L)中包含：HA 20μg/mL、HBA 1μg/mL、HPA 5μg/mL、IAA 5μg/mL、TCA 0.1μg/mL、XA0.5μg/mL、β-HIVA 2μg/mL、SA 2μg/mL、EMA 5μg/mL、PYA 5μg/mL、CA 50μg/mL、SCA 2μg/mL、HMGA 2μg/mL、MDA 1μg/mL、PGA 0.1μg/mL、GA 20μg/mL、α-HB 2μg/mL、HVA 2μg/mL、VMA 2μg/mL、HIA 2μg/mL和KA 1μg/mL；
QC(H)中包含：HA 100μg/mL、HBA 5μg/mL、HPA 25μg/mL、IAA 25μg/mL、TCA 0.5μg/mL、XA 2.5μg/mL、β-HIVA 10μg/mL、SA 10μg/mL、EMA 25μg/mL、PYA 25μg/mL、CA 250μg/mL、SCA10μg/mL、HMGA 10μg/mL、MDA 5μg/mL、PGA 0.5μg/mL、GA 100μg/mL、α-HB 10μg/mL、HVA 10μg/mL、VMA 10μg/mL、HIA 10μg/mL和KA 5μg/mL。
9.权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中有机酸中的应用。
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