CN114487214A - 一种区分良性前列腺增生和前列腺炎的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物标志物在制备区分良性前列腺增生和前列腺炎的试剂中的应用。所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。本发明通过研究良性前列腺增生和前列腺炎患者静脉血中有机酸代谢物的水平，筛选获得了能有效区分前列腺增生和前列腺炎患者的生物标志物。定量检测患者静脉血中上述生物标志物含量的试剂可用于制备区分良性前列腺增生和前列腺炎患者的试剂盒，在用于临床辅助诊断时具有采样无创、检测快速高效、准确性较高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种区分良性前列腺增生和前列腺炎的生物标志物及其应用。
背景技术
前列腺炎(prostatitis)是指以尿道刺激症状和慢性盆腔疼痛为主要临床表现的前列腺疾病，主要分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型和IV型。I型前列腺炎常发病突然，表现为寒战，发热，疲乏无力等全身症状，伴有会阴部和耻骨上疼痛，可有尿频、尿急和直肠刺激症状，甚至急性尿潴留。Ⅱ型和Ⅲ型前列腺炎临床症状相似，多有疼痛和排尿异常等。IV型前列腺炎无临床症状，仅在有关前列腺方面的检查时发现炎症证据。
良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性常见疾病之一，随全球人口老年化发病日渐增多。有关良性前列腺增生的发病机制研究颇多，但病因至今仍未能阐明。可能与雄激素及其与雌激素的相互作用、前列腺间质与腺上皮细胞的相互作用、生长因子、炎症细胞、神经递质及遗传因素等。
前列腺炎和前列腺增生是50～70岁之间男性生殖系统的常见疾病，都具有排尿不畅、尿频、尿急、下腹部不适等症状。目前的常规检测手段有时很难将两者进行有效区分。
生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。在不同疾病状态下，机体的生物标志物会因代谢水平的改变而产生相应的变化，因此，找出与疾病特异性相关的生物标志物对于有效区分一些具有相似症状的疾病尤为重要。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种区分良性前列腺增生和前列腺炎的生物标志物及其应用，所述生物标志物在良性前列腺增生和前列腺炎患者的血液中存在差异表达，可将两种疾病进行区分，具有采样无创、检测快速高效、准确性较高的优点。
具体技术方案为：
一种生物标志物在制备区分良性前列腺增生和前列腺炎的试剂中的应用，所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。
进一步地，所述生物标志物为柠檬酸。
进一步地，所述生物标志物为乙基丙二酸。
进一步地，所述试剂适用于超高效液相色谱-串联质谱检测技术。
进一步地，所述试剂的检测样品为血清。
本发明还提供了一种区分良性前列腺增生和前列腺炎的试剂盒，所述试剂盒包含定量检测样品中生物标志物含量的试剂和针对所述生物标志物的标准品；所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。
进一步地，所述试剂盒还包括样品前处理试剂，所述样品前处理试剂为含0.1～0.3w/v％甲酸的25～35v/v％甲醇水溶液。
进一步地，所述样品前处理试剂为含0.1w/v％甲酸的30v/v％甲醇水溶液。
本发明通过研究良性前列腺增生和前列腺炎患者静脉血中有机酸代谢物的水平，筛选获得了能有效区分前列腺增生和前列腺炎患者的生物标志物，所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。所述生物标志物在前列腺炎患者静脉血中的含量显著低于良性前列腺增生患者，ROC曲线分析结果显示，在用于区分良性前列腺增生和前列腺炎时，柠檬酸的AUC为0.842，敏感性为78.4％，特异性为76.9％；乙基丙二酸的AUC为0.814，敏感性为73.0％，特异性为82.7％；马尿酸的AUC为0.733，敏感性为64.9％，特异性为63.5％。说明柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸能满足作为区分良性前列腺增生和前列腺炎患者的诊断标志物的要求，准确性较高。因此，定量检测患者静脉血中柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸含量的试剂可用于制备区分良性前列腺增生和前列腺炎患者的试剂盒，在用于临床辅助诊断时具有采样无创、检测快速高效、准确性较高的优点。
附图说明
图1为良性前列腺增生和前列腺炎患者血清中柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸的z-score图。
图2为良性前列腺增生和前列腺炎患者血清中柠檬酸含量的统计分析结果和ROC曲线图；其中，B代表prostatitis组，C代表BPH组。
图3为良性前列腺增生和前列腺炎患者血清中乙基丙二酸含量的统计分析结果和ROC曲线图；其中，B代表prostatitis组，C代表BPH组。
图4为良性前列腺增生和前列腺炎患者血清中马尿酸含量的统计分析结果和ROC曲线图；其中，B代表prostatitis组，C代表BPH组。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1
本实施例检测良性前列腺增生与前列腺炎患者静脉血血清中柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸的含量，具体如下：
1.受试者纳入标准
前列腺良性增生(BPH组)患者纳入标准：1)直肠指诊及前列腺B超显示前列腺体积增大；2)有排尿不畅，尿频，夜尿增多，进行性排尿困难，部分患者有尿潴留病史，无合并其他恶性肿瘤病史；3)所有患者均行尿道前列腺电切术，术后病理组织诊断证实为良性前列腺增生。
前列腺炎患者(prostatitis组)纳入标准：1)具有典型的临床症状尿急、尿频、尿痛；2)前列腺液常规检查结果异常；3)肝肾功能等未见异常，没有接受过药物的治疗或手术切除。
根据上述标准，BPH组纳入52例，平均年龄为66.08±11.02岁；prostatitis组纳入37例，平均年龄为52.05±12.35岁。
所有受试者都签署患者知情同意书，本次研究经过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准。
2.样品采集
上述所有纳入研究的受试者术前抽取清晨空腹静脉血(采血前1周禁行直肠指诊、按摩、穿刺等检查操作)3ml，收集血清并在-80摄氏度下保存至分析。从受试者的记录中回顾性收集患者信息和相关实验室检查指标。
3.代谢组学分析
基于超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的平台分析用甲醇提取的血清中的提取物，并结合UHPLC-三重四极杆质谱靶向分析有机酸。质谱下机原始数据通过Proteowizard软件包(v3.0.8789)4中MSConvert工具将原始质谱raw文件转换为mzXML文件格式。采用RXCMS软件包回进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表。采用公共数据库HMDB、METLIN、massbank、LipidMaps、mzcloundi、KEGG及自建物质库进行物质的鉴定。基于QC样本的LOESs信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉QC样本中RSD>30％的物质。具体如下：
(1)标准曲线制作
称取柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸标准品，用甲醇配制单标母液。量取各母液适量制成混合标准品，用30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)逐一稀释至合适浓度，制成工作标准溶液。柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸的标准品信息及工作标准溶液浓度点如表1和表2所示。母液及工作标准溶液均保存于0℃。
表1柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸标准品信息
| 名称 | 英文名称 | CAS号 |
| 柠檬酸 | Citric acid | 77-92-9 |
| 乙基丙二酸 | Ethylmalonic acid | 601-75-2 |
| 马尿酸 | Hippuric acid | 495-69-2 |
表2柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸标准品浓度(单位:ng/mL)
| 名称 | Cal 1 | Cal 2 | Cal 3 | Cal 4 | Cal 5 | Cal 6 | Cal 7 | Cal 8 | Cal 9 | Cal 10 |
| 柠檬酸 | 2000 | 1000 | 500 | 200 | 100 | 50 | 20 | 10 | 5 | 2 |
| 乙基丙二酸 | 2000 | 1000 | 500 | 200 | 100 | 50 | 20 | 10 | 5 | 2 |
| 马尿酸 | 2000 | 1000 | 500 | 200 | 100 | 50 | 20 | 10 | 5 | 2 |
(2)血清样品处理
吸取血清样品于2mL EP管中，准确加入400μL 30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)，涡旋震荡60s，12000rpm 4℃离心10min，取上清液加入到检测瓶中。
(3)检测参数
色谱条件：采用ACQUITY
BEH C18色谱柱，进样量为5μL，柱温为40℃，流动相A-水(含0.1％甲酸)，B-甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6min，28％B；6～9min，25～40％B；9～10min，40～50％B；10～11min，50％B；11～12min，28％B。流速：0.25mL/min。
质谱条件：电喷雾电离(ESI)源，负离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电。-4500V，碰撞气6psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。用于定量分析的离子对见下表3。
表3用于分析的定量离子对
| 检测物质 | 母离子 | 子离子 | DP | EP | CE | CXP |
| 柠檬酸 | 190.907 | 111 | -55 | -10 | -16 | -3 |
| 乙基丙二酸 | 130.85 | 87.1 | -30 | -10 | -12 | -7 |
| 马尿酸 | 177.979 | 133.9 | -30 | -10 | -16 | -25 |
分别对各工作标准溶液和样品进行检测。以工作标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察线性范围及绘制标准曲线，得到回归方程，分别如下：
柠檬酸：Y＝-5580+332*X，R＝0.9965；
乙基丙二酸：Y＝-9280+16400*X，R＝0.9956；
马尿酸：Y＝-1540+1570*X，R＝0.9918。
根据上述回归方程和各物质对应的峰面积计算样品中柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸的含量。
4.统计分析
采用R软件包Ropls分别对样本数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)降维分析。根据T检验计算P-value值、PLS-DA降维方法计算变量投影重要度(VIP)、foldchange计算组件差异倍数，衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。当P-value值<0.05和VIP值>1时，认为代谢物分子具有统计学意义。
使用受试者工作特征曲线下的面积(AUC)来评估模型在每次比较中识别患者的诊断准确性。AUC<0.5时，表示诊断无意义；AUC＝0.5～0.7时，表示诊断准确性较低；AUC＝0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC>0.9时，表示诊断准确性高。
5.结果
图1为良性前列腺增生患者组和前列腺炎患者组柠檬酸、乙基丙二酸和马尿酸的z-score图。
如图2所示，前列腺炎患者中柠檬酸的含量显著低于良性前列腺增生患者，ROC曲线分析表明，柠檬酸在用于区分良性前列腺增生和前列腺炎患者时AUC为0.842，敏感性为78.4％，特异性为76.9％。
如图3所示，乙基丙二酸在前列腺炎患者中的含量也显著低于良性前列腺增生患者，其在用于区分良性前列腺增生和前列腺炎患者时AUC为0.814，敏感性为73.0％，特异性为82.7％。
如图4所示，马尿酸在前列腺炎患者中的含量也显著低于良性前列腺增生患者，在用于区分良性前列腺增生和前列腺炎患者时AUC为0.733，敏感性为64.9％，特异性为63.5％。
上述结果表明，柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸能满足作为区分良性前列腺增生和前列腺炎患者的诊断标志物的要求，准确性较高。因此，定量检测患者静脉血中柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸含量的试剂可用于制备区分良性前列腺增生和前列腺炎患者的试剂盒。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种生物标志物在制备区分良性前列腺增生和前列腺炎的试剂中的应用，其特征在于，所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为柠檬酸。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为乙基丙二酸。
4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂适用于超高效液相色谱-串联质谱检测技术。
5.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂的检测样品为血清。
6.一种区分良性前列腺增生和前列腺炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含定量检测样品中生物标志物含量的试剂和针对所述生物标志物的标准品；所述生物标志物选自柠檬酸、乙基丙二酸或马尿酸。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品前处理试剂，所述样品前处理试剂为含0.1～0.3w/v％甲酸的25～35v/v％甲醇水溶液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样品前处理试剂为含0.1w/v％甲酸的30v/v％甲醇水溶液。
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