JP5038311B2 - ビタミンｅ関連代謝産物の測定による、結腸直腸癌及び卵巣癌の診断方法 - Google Patents
ビタミンｅ関連代謝産物の測定による、結腸直腸癌及び卵巣癌の診断方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、結腸直腸癌及び卵巣癌（それぞれＣＲＣ及びＯＣ）の診断に関する。本発明は、内生小分子とＣＲＣ又はＯＣとの関係を記載する。本発明はまた、上記方法により同定された診断マーカーに関する。
結腸直腸癌は世界で３番目に多い悪性腫瘍であり、全世界で発症する全てのがんの約１０％を占める（非特許文献１）。世界的な人口の高齢化により、ＣＲＣは深刻な公衆衛生問題となっており、この疾患の影響を最小限にするための新しい対応策が必要とされている。ＣＲＣから生存する可能性は、（表１に示されるように）診断時における疾患のステージと密接に関わっており（http://www.alternative-cancer-treatments.com/colon-cancer-prognosis.htm）、診断が早いほど、生存する可能性が高くなる。例えば、この疾患のタイムフレームの後期（デュークスＤ）に診断がされた場合の５年後生存率は５％未満であるが、一方、初期（デュークスＡ）に診断された場合の５年後生存率は９０％を超える。したがって、早期の外科治療が効果的なことから、早期発見はＣＲＣ患者にとって大きな利益となる。
現在のところ、ＣＲＣのリスク要因はよく分かっていない。実際、この疾患について、食事以外の具体的なリスク要因はほとんど解明されていない。炎症性腸疾患及び家族性大腸ポリポーシス（ＦＡＰ）はリスクを増大させるが、それでも全体的なＣＲＣ発症率に占めるこれらの割合は非常に小さい。民族的、人種的差異、及び移民についての研究から、移民及びその子孫において発症率が急激に上昇して受入国における発症率にまで達することから、環境要因が疾因に関与していることが示唆されている（非特許文献２及び非特許文献３）。全体的に見て、ＣＲＣの症例において家族性のものは１５％に満たず、食事、環境及びライフスタイルが、病因に大きな影響をもつことが示唆されている。
現在最も一般的なＣＲＣのスクリーニング検査は、１）がんは出血性であるので化学的検査又は免疫学的検査により便中に検出することができるという想定に基づく、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、及び２）全体的な異常を特定する侵襲性の方法である。ＦＯＢＴはＣＲＣに対して最も広く用いられている検査であり、ヘモグロビン中のヘムのペルオキシダーゼ様活性のおおまかな検査が含まれるが、全ての腺腫及びＣＲＣが出血するわけではないため、この検査の感度は約５０％しかなく、腺腫に対しての感度はたったの２０％である（非特許文献２）。
全体的な異常の特定方法としては、バリウム注腸二重撮像法及び仮想結腸内視鏡検査の他に、軟性Ｓ状結腸鏡検査及び結腸内視鏡検査等を挙げることができる。結腸内視鏡検査は、ＦＯＢＴで陽性であった人が次に受ける検査であり、擬陽性率が８０％であるため、多くの人に不必要な危険及びリスクを負わせる。結腸内視鏡検査は、ＣＲＣ又は線腫性ポリープ、又は炎症性腸疾患等のその他の素因疾患の既往歴があり、５０歳を超える、リスクが平均以上の人のスクリーニング方法として好ましい。リスクが平均的な集団については、結腸内視鏡検査のみによるスクリーニングで発症率又は死亡率が下がるという証拠はない（非特許文献３）。しかし、Ｓ状結腸鏡検査、及び上記の手法の組合せを含む総合的評価法は、高リスクの人について、一定期間中に期待されるＣＲＣの率を減らすことができる（非特許文献４）。
結腸内視鏡検査は、いまだにポリープ及びＣＲＣの有無を調べる標準的な検査法であるが、直径１ｃｍを超える病変の１５％は見逃されることがある（非特許文献５）。結腸内視鏡検査の合併症には、穿孔、出血、呼吸抑制、不整脈、及び感染症が含まれる（非特許文献６）。大体１０００人に１人の患者が穿孔をきたし、１０００人に３人の患者が出血する。この検査により、検査１０，０００回当たり１〜３人が死亡する（非特許文献３）。その他にも、訓練を受けた人材の不足、患者の不快感、及び高い費用等の不利な点があることが、結腸内視鏡検査が一般集団の日常的なＣＲＣスクリーニング法になるのを妨げていると考えられる（表２参照）。最も散在性のＣＲＣは、悪性腫瘍に発達する数が非常に少ない良性の腺腫から発達すると考えられる。良性の腺腫が悪性に発達する期間を５〜１０年とすると、一般集団の腺腫を結腸内視鏡検査／Ｓ状結腸鏡検査によって検出するには、全体として患者に過剰な処置が必要になり、費用もかかり、有害になる恐れもある（非特許文献７）。
コンピュータ断層撮影コロノグラフィー（ＣＴＣ）、すなわち仮想結腸内視鏡検査は、結腸を画像化する最近の非侵襲性の手法である。この検査法の性能特性についての報告には大きなばらつきがあり（３９％〜９４％の特異度）、これは主に患者の準備並びに分析に用いたハードウェア及びソフトウェアの技術的差異によるものである。ＣＴＣのその他の制限として、擬陽性率が高い、扁平腺腫を検出できない、ポリープを除去できない、反復的及び累積的放射線量、並びに費用を挙げることができる（非特許文献６）。
ＣＲＣの分子病理学的理解が進むにつれ、糞便試料からのＤＮＡ分析に基づく複数の新規なスクリーニング方法が出現した。これらは基本的にＰＣＲを利用した検査法であり、腺腫−癌連鎖（adenoma-to-carcinoma sequence）において発生することが知られている変異、又は家族性ＣＲＣで知られている変異を特定するために用いられる。よくスクリーニングされる遺伝子変異には、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣが含まれ、またマイクロサテライト不安定性及び高メチル化ＤＮＡについての検査もある。非特許文献７から再作成した表２では、現在あるＣＲＣのスクリーニング方法を比較している。
上述の方法は全て、通常、腺腫形成後のＣＲＣしか検出できず、また、一般的に大規模集団のスクリーニングに理想的なものではない。上記の検査法はいずれも、ＣＲＣを正又は負に促進する環境を定量的に評価することはできず、また、正常なヒトの生化学及び関連する健康状態へのＣＲＣの影響を定量的に評価することもできない。ゲノミクスに基づく検査法によって散在性ＣＲＣについての高い診断精度がもたらされるかどうかはまだわかっていない。非特許文献７は、ＣＲＣの理想的なスクリーニング検査法の特徴を以下のように概説している：１）安価、実施しやすい、３）非侵襲性、４）全結腸が対象となる、５）結果の解釈が明確（すなわち、感度、特異度、陽性適中率、及び陰性適中率が高い）、６）教えやすい、並びに７）品質管理維持が容易。
特定の代謝産物を検出できる検査法の開発は比較的容易で、検査当たりの費用も経済的であることから、血清中の小分子又は代謝産物を利用する診断法は上記の基準を満たしている。この検査法は低侵襲性であり、結腸の近接（colonic proximity）に関わらず疾患の状態を示すと考えられる。臨床化学検査室に現在あるハードウェアと両立するような臨床検査への変換が商業的に許容でき且つ効果的であり、この方法は急速に世界中に広まると思われる。さらに、検査を実施及び解釈するための高度な訓練を受けた人材も不要となる。
ＣＲＣの存在、ＣＲＣ促進又は抑制環境、ＣＲＣの生理的負担、又はそれらの特性の組合せを評価することができるヒト血清中のＣＲＣ特異的バイオマーカーは、ＣＲＣのリスク、予防、及び治療の管理に非常に有益である。これらのバイオマーカーを測定するように設計された検査は、一般集団に広く受け入れられると思われる。なぜなら、この検査は低侵襲性であり、且つ従来のスクリーニング検査を実施する前に又は従来のスクリーニング検査と組合せて個人の疾患への罹患しやすさをモニターするために利用することができるからである。
卵巣癌は、女性の癌による死因のうちで５番目に多い死因である（非特許文献８）。米国だけで、今年新たに卵巣癌と診断される件数は２２，０００件を超えると推定されており、１６，２１０人が死亡すると予想されている（非特許文献９）。卵巣癌は一般的に、患者のステージがIII又はIVになるまで確認されず、予後が不良である（５年生存率が約２５〜３０％）（非特許文献１０）。現在ある卵巣癌のスクリーニング法には、内診（双合診）、経膣的超音波検査法、及びＣＡ１２５の測定が含まれる（非特許文献９）。この卵巣癌のスクリーニング検査の効果については現在のところ不明である。なぜなら、スクリーニングによって死亡率が減少するという証拠が無く、擬陽性結果に関連するリスクについて調査中であるからである（非特許文献８及び１１）。米国癌協会によると、ＣＡ１２５測定及び経膣的超音波検査法は、卵巣癌に対する信頼できるスクリーニング又は診断テストではなく、確実な診断のために利用できる方法は外科的な方法だけである（http://www.cancer.org）。
ＣＡ１２５（癌抗原１２５）は高分子量ムチンであり、正常な細胞と比べてほとんどの卵巣癌細胞で上昇していることがわかっている（非特許文献９）。ＣＡ１２５検査の結果が３０〜３５Ｕ／ｍｌより高いと、通常、上昇しているとされる（非特許文献９）。卵巣癌のＣＡ１２５スクリーニングは、ＣＡ１２５の上昇を定義するための閾値が様々であり、被検患者群のサイズも様々であり、患者の年齢層及び人種が広い範囲に渡っているため、精度、感度及び特異度を確立することが困難であった（非特許文献８）。ジョンズ・ホプキンス大学の病理学ウェブサイトによると、卵巣癌について、ＣＡ１２５検査の結果が真陽性であるのは、ステージＩの患者で約５０％、ステージII、III及びIVの患者で約８０％でしかない（http://pathology2.jhu.edu）。子宮内膜症、良性卵巣嚢胞、骨盤内炎症性疾患及び妊娠第１期においても血中ＣＡ１２５レベルが上昇することが報告されている（非特許文献１１）。国立衛生研究所のウェブサイトには、ＣＡ１２５は卵巣癌の有効な一般的スクリーニング検査ではないと記載されている。国立衛生研究所の報告によると、健康な女性でＣＡ１２５レベルの高かった１００人のうち、実際に卵巣癌を有していたのはたったの３人程であり、卵巣癌と診断された患者の約２０％でしか実際にＣＡ１２５レベルが上昇していなかった（http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/007217.htm）。
ヒト血清中の特異度及び感度が高い卵巣癌バイオマーカーの同定は、検査が非侵襲性であり、且つ従来の方法を実施する前に又は従来の方法と組合せて個人の疾患への罹患しやすさをモニターするために利用することができ、非常に有益である。血清検査は低侵襲性であり、一般集団に受け入れられると考えられる。
Boyle, P. and M.E. Leon, Epidemiology of colorectal cancer. Br Med Bull, 2002. 64: p. 1-25. Ahlquist, D.A., et al., Fecal blood levels in health and disease. A study using HemoQuant. N EnglJ Med, 1985. 312(22): p. 1422-8. Winawer, S., et al., Colorectal cancer screening and surveillance: clinical guidelines and rationale-Update based on new evidence. Gastroenterology, 2003. 124(2): p. 544-60. Rex, D.K., et al., Colorectal cancer prevention 2000: screening recommendations of the American College of Gastroenterology. American Collegeof Gastroenterology. Am J Gastroenterol, 2000. 95(4): p. 868-77. Hixson, L.J., et al., Prospective study of the frequency andsize distribution of polyps missed by colonoscopy. J Natl Cancer Inst, 1990. 82(22): p. 1769-72. Lidofsky, S., Detection and prevention of colon cancer: colonoscopy, virtual colonoscopy, and DNA stool tests. Med Health R I, 2005. 88(3): p. 82-5. Davies, R.J., R. Miller, and N. Coleman, Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat Rev Cancer, 2005. 5(3): p.199-209. Screening for ovarian cancer: recommendation statement. Ann Fam Med, 2004. 2(3): p. 260-2. Chu, C.S. and S.C. Rubin, Screening for ovarian cancer in the general population. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2005. Hanna, L. and M. Adams, Prevention of ovarian cancer. BestPract Res Clin Obstet Gynaecol, 2005. Rosenthal, A. and I. Jacobs, Familial ovarian cancer screening. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2005.
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本発明の１実施形態では、ＣＲＣ及びＯＣの診断に使用する代謝産物マーカーの同定方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：未同定代謝産物を複数含む試料であって、前記疾患状態を呈する患者から採取した試料を、高分解能質量分析計、例えばフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ）に導入するステップ；代謝産物の同定・定量用データを取得するステップ；前記同定・定量用データのデータベースを作成するステップ；上記試料の同定・定量用データを対照試料の対応データと比較するステップ；差異のある１又は複数の代謝産物を同定するステップ；及び、最適な診断に必要な最少数の代謝産物を選択するステップ。
本発明の別の実施形態では、生物の健康状態を診断する代謝産物バイオマーカー検査法の開発プロセスが提供され、該プロセスは以下を含む：複数の健康状態の生物から生物学的試料を採取する；前記生物学的試料を高分解能／精密タンデム質量分析計（high resolution/accurate mass mass spectrometer）に導入し、上記生物学的試料に含まれる代謝産物に関する同定・定量用データを取得し、複数の健康状態間で強度が異なる代謝産物を見出す；多変量統計を用いて、前記健康状態を区別するのに必要な最少セットのバイオマーカーを同定する；別にＭＳ法を用いてこれらのバイオマーカーを確認する；同定及び検証されたバイオマーカーを測定するための標的化ハイスループット法（targeted high throughput method）を作成する。
本発明の別の実施形態では、結腸直腸癌特異的な代謝マーカーの同定方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：未同定代謝産物を複数含む試料であって、結腸直腸癌／卵巣癌と診断された患者から採取した試料をフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（ＦＴＭＳ）に導入するステップ；代謝産物の同定・定量用データを取得するステップ；前記同定・定量用データのデータベースを作成するステップ；試料の同定・定量用データを対照試料の対応データと比較するステップ；差異のある１又は複数の代謝産物を同定するステップ（ここで、上記代謝産物は、表３に示される１又は複数の代謝産物、又はそれらのフラグメント若しくは誘導体からなる群から選択される。）。
本発明の別の実施形態では、結腸直腸癌特異的な代謝マーカーの同定方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：未同定代謝産物を複数含む試料であって、結腸直腸癌／卵巣癌と診断された患者から採取した試料をフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ）に導入するステップ；代謝産物の同定・定量用データを取得するステップ；前記同定・定量用データのデータベースを作成するステップ；試料の同定・定量用データを対照試料の対応データと比較するステップ；差異のある１又は複数の代謝産物を同定するステップ（ここで、上記代謝産物は、ダルトンで測定した精密な中性質量が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的に同等の質量を有し、且つ図１３〜２１のいずれか１つに示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳフラグメントパターンを有する代謝産物又はそれらのフラグメント若しくは誘導体からなる群から選択される。）；最適な診断に必要な最少数の代謝マーカーを選択するステップ。
本発明の別の実施形態では、卵巣癌特異的代謝マーカーの同定方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：未同定代謝産物を複数含む試料であって、結腸直腸癌／卵巣癌と診断された患者から採取した試料をフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ）に導入するステップ；代謝産物の同定・定量用データを取得するステップ；前記同定・定量用データのデータベースを作成するステップ；試料の同定・定量用データを対照試料の対応データと比較するステップ；差異のある１又は複数の代謝産物を同定するステップ；ここで、上記代謝産物は、ダルトンで測定した精密な中性質量が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的に同等の質量を有し、且つ図１３〜２１のいずれか１つに示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳフラグメントパターンを有する代謝産物、又はそれらのフラグメント若しくは誘導体からなる群から選択され；最適な診断に必要な最少数の代謝マーカーを選択するステップ。
本発明の１つの実施形態では、表３に記載されている代謝産物又はそれらのフラグメント若しくは誘導体から選択される、ＣＲＣ／ＯＲ癌特異的な代謝マーカーが提供される。
本発明の１つの実施形態では、精密な中性質量（ダルトンで測定）が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的に同等の中性質量を有する代謝産物又はそのフラグメント若しくは誘導体（±５ｐｐｍの差は、同じ代謝産物を示す）からなる群から選択される、ＣＲＣ／ＯＲ癌特異的な代謝マーカーが提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、ダルトンで測定した精密な中性質量が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的に同等な質量を有し、且つ図１３〜２１のいずれか１つに示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳフラグメントパターンを有する代謝産物、又はそのフラグメント若しくは誘導体からなる群から選択される結腸直腸癌／卵巣癌特異的な代謝マーカーが提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６及びＣ３６Ｈ６６Ｏ６からなる群から選択される分子式を有する代謝産物からなる群から選択される、結腸直腸癌／卵巣癌特異的な代謝マーカーが提供される。
本発明のさらに別の態様では、患者の結腸直腸癌若しくは卵巣癌の存在、又はＣＲＣ若しくはＯＣを発症するリスクを診断する方法が提供され、該方法は、前記患者から採取した試料を、表３に記載されている代謝産物又はそれらのフラグメント若しくは誘導体からなる群から選択される１又は複数の代謝マーカーの有無についてスクリーニングするステップを含む。ここで、１又は複数の前記代謝マーカーの強度に差があれば、ＣＲＣ又はＯＣが存在することが示される。
本発明の別の実施形態では、患者の結腸直腸癌又は卵巣癌の存在を診断する方法が提供され、該方法は、前記患者から採取した試料を、精密な中性質量が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的に同等の中性質量を有する代謝産物からなる群から選択される１又は複数の代謝マーカーの有無についてスクリーニングするステップを含む。ここで、１又は複数の前記代謝マーカーが存在しなければ、ＣＲＣ又はＯＣが存在することが示される。
本発明の別の実施形態では、疾患状態が未知の被検者におけるＣＲＣ又はＯＣの有無を診断する方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：前記被検者から血液試料を採取するステップ；前記血液試料を分析して、精密な中性質量が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であることで同定される分子又はそれらと実質的に等しい質量を有する分子又はそれらのフラグメント若しくは誘導体を含む群から選択される分子の定量用データを取得するステップ；前記被検者から得られた前記分子についての定量用データを、複数人のＣＲＣ陽性又はＯＣ陽性のヒトの前記分子から得られた定量用データ或いは複数人のＣＲＣ陰性又はＯＣ陰性のヒトから得られた定量用データと比較するステップ；並びに前記比較を用いて被検者がＣＲＣ／ＯＣに陽性又は陰性である可能性を決定するステップを含む。
本発明の１実施形態では、上記に記載の代謝産物マーカーの最適なサブセットを用いて開発された血清検査を、ＣＲＣ／ＯＣの存在、又はＣＲＣ若しくはＯＣを促進又は抑制する環境の存在を診断するために利用することができる。
本発明の別の実施形態では、上記に記載の代謝産物マーカーの最適なサブセットを用いて開発された血清検査を、ＣＲＣと診断された患者の治療の影響に起因するＣＲＣ健康状態を診断するために利用することができる。治療の例としては、化学療法、外科手術、放射線治療、生物学的治療等を挙げることができる。
本発明の別の実施形態では、上記に記載の代謝産物マーカーの最適なサブセットを用いて開発した血清検査を、ＣＲＣ治療を受けている患者のＣＲＣ状態を長期的にモニターし、その患者に適した用量や具体的な治療法を決定するために利用することができる。
本発明の別の実施形態では、被験者がＯＣ又はＣＲＣを発症するリスクを有する可能性の決定方法が提供され、該方法は以下を含む：ＣＲＣ又はＯＣの無症候性被検者からの血液試料の採取；前記血液試料の分析による上記に記載の代謝産物マーカーの全て又はサブセットについての定量用データの取得；前記被検者から得られた前記代謝産物マーカーについての定量用データと、複数人のＣＲＣ陰性又はＯＣ陰性のヒトを分析して得られた参照用データとの比較；前記比較を用いた、被検者がＯＣ又はＣＲＣを発症するリスクを有する可能性の決定。
本発明の別の実施形態では、ＣＲＣ若しくはＯＣを予防、治療、若しくは安定化するように、又はＣＲＣ若しくはＯＣに関連する症状を改善するようにデザインされた食事療法、化学療法、又は生物学的治療法に反応する人の診断方法が提供され、該方法は以下を含む：前記被検者からの単回採取又は経時的な複数回採取のどちらかによる１又は複数の血液試料の採取；前記血液試料の分析による、上記に記載の代謝産物マーカーの全て又はサブセットについての定量用データの取得；前記被検者の試料中の前記代謝産物マーカーについて得られた定量用データと、複数人のＣＲＣ陰性又はＯＣ陰性のヒトの前記分子から得られた参照用データとの比較；及び、前記比較を用いた、前記被検者の代謝状態が前記治療の期間中に改善されているかどうかの決定。
この本発明の開示（summary of the invention）は、必ずしも本発明の全ての特徴を記載しているわけではない。
本発明の上記の特徴及びその他の特徴は、以下の記述によりさらに明らかになる。以下の記述では添付図面を参照する。
本発明は、結腸直腸癌及び卵巣癌（それぞれＣＲＣ及びＯＣ）の診断に関する。本発明は、内生小分子とＣＲＣ又はＯＣとの関係を記載している。
ＣＲＣに特異的に関連した明確且つ明瞭な生化学的変化は、本発明によって初めて開示されるものである。これらの所見はまた、これらのバイオマーカーの測定が、ＣＲＣ治療の有効性を測定する普遍的な方法を提供し得ることを意味する。これにより、新規治療法の実行可能性を評価するために簡単な生化学的検査が利用できることから、臨床試験実施にかかる費用が大幅に減少すると考えられる。さらに、治療が有益であったかを決定するのに、腫瘍の進行又は患者の死亡を待つ必要がなくなる。研究者は、かかる検査を利用することで、ＣＲＣ治療における投与量、処方、及び化学的構造変化の有効性を、数年ではなく数ヶ月で判断できるようになると考えられる。
本発明は、ヒト血清中に存在する特定の小分子のレベルを測定し、それらと「正常な」参照レベルとを比較することによる、ＣＲＣ又はＯＣの診断方法に関する。本出願の１実施形態では、ＣＲＣ及びＯＣを早期発見及び早期診断し、ＣＲＣ及びＯＣの治療の効果をモニターする新規な方法を記載する。
好ましい方法は、１若しくは複数の疾患又は特定の健康状態を診断するための、表３から選択される代謝産物のサブセットから開発されたハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイの使用を含む。特許保護請求されている方法の実用性は、ＣＲＣ陽性健康状態を診断することができるＨＴＳアッセイを開発することで実証及び検証される。
かかるアッセイのＣＲＣ及びＯＣに与える影響は非常に大きく、リスクの評価及びこれらの疾患の早期発見のために、事実上全ての人を長期間、生涯を通してスクリーニングすることができる。一般的なＣＲＣ集団に対して本検査の性能特性が成り立つとすれば、本検査は単独でも、現在利用可能などのＣＲＣスクリーニング法よりも優れていると考えられる。なぜなら、従来の方法で検出可能な疾患の進行よりも前に、疾患の進行を検出することができるからである。疾患の早期発見は、良好な治療転帰を得るために重要である。
ある健康状態の生化学的マーカーが特定の集団中にあるかどうかを確かめるためには、その健康状態（すなわち、特定の疾患）を代表する患者群と、「正常な」対応する個体群が必要である。特定の健康状態の範疇に属する患者から採取した生物学的試料を、正常者集団から採取した同じ試料と比較して、試料の抽出及び様々な解析プラットフォームを用いた解析により、２つの群の差異を特定することができる。上記様々な解析プラットフォームとしては特に限定されないが、例えばフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＭＳ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を挙げることができる。生物学的試料は、生体内のどこに由来してもよく、限定されるものではないが、例えば、血液（血清・血漿）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、便、呼気、唾液、又は任意の固形組織（腫瘍、隣接する正常な平滑筋及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛髪、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃等）の生検を挙げることができる。
記載のＣＲＣ診断アッセイを発明するために、ＣＲＣ及びＯＣに陰性の健常個体を代表する集団と、専門家にＣＲＣ陽性であると診断された患者を代表する集団とから血清試料を得た。本出願中を通して「血清」という用語を使用するが、方法中で血漿、全血、又は全血のサブフラクションを用いてもよいことは、当業者にとって自明であると考えられる。
患者から血液試料を採血する際、試料は複数の方法で処理することができる。処理の範囲は、少ない処理としては無処理（すなわち、凍結した全血）であってもよいし、複雑な処理としては特定の細胞型を単離してもよい。最も一般的で、日常的な処理には、全血からの血清又は血漿の調製が含まれる。本発明には、血液試料の固相支持体（例えば、濾紙又はその他の固定材料）へのスポッティングなど、全ての血液試料処理方法も包含される。
上述の処理済血液試料をさらに処理して解析的分析手法に適合させ、処理済血液試料（本件の場合、血清試料）中に含まれる生化学的物質の検出及び測定に使用する。処理の種類は、少ない処理としてはさらなる処理を全くしないものから、複雑な処理としては段階抽出（differential extraction）及び化学誘導体化までわたってもよい。抽出方法としては特に限定されないが、一般的な溶媒（例えばメタノール、エタノール、アルコールと水の混合物、又は酢酸エチル若しくはヘキサンなどの有機溶媒）中での、超音波処理、ソックスレー抽出法、マイクロ波抽出法（ＭＡＥ）、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、高速溶媒抽出法（ＡＳＥ）、加圧流体抽出法（ＰＬＥ）、加圧熱水抽出（ＰＨＷＥ）、及び／又は界面活性剤による抽出法（surfactant-assisted extraction）を挙げることができる。ＦＴＭＳ非標的型分析（non-targeted analysis）に好ましい代謝産物抽出方法は、非極性代謝産物を有機溶媒に溶解させ、極性代謝産物を水性溶媒に溶解させる、液液抽出の実施である。本発明の１実施形態では、血清試料中に含まれる代謝産物を、超音波処理及び激しい攪拌（ボルテックスでの混合）により極性抽出物と非極性抽出物に分離した。
生物学的試料の抽出物は、直接導入であれ、クロマトグラフィーによる分離の後であれ、基本的に任意の質量分析プラットフォームに基づく分析に適している。典型的な質量分析計は、試料中の分子をイオン化する源とイオン化した粒子を検出する検出器とを含んで構成される。一般的な源の例としては、例えば電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面支援レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、及びそれらの変法を挙げることができる。一般的なイオン検出器としては、四重極型のシステム、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場型、イオンサイクロトロン型、及びそれらの変法（derivations）を挙げることができる。
本発明では、非標的型分析として知られる方法によって小分子を同定する。非標的型分析では、予備知識も分析前の成分の選択もなしに、試料中の可能な限り多くの分子を測定する（２００１年８月９日公開の国際公開第０１／５７５１８号参照）。したがって、非標的型分析により新規の代謝産物バイオマーカーが発見される可能性は、予め決められたリストの分子を検出する標的型の方法よりも高い。本発明は、非標的型方法を用いて、ＣＲＣ陽性個体及び健常個体の間で差のある代謝産物成分を同定し、続いて、非標的型分析で同定された代謝産物サブセットのハイスループット標的型アッセイを開発する。しかし、代謝産物のその他のプロファイリング方法も、本出願で開示されている異なる制御を受けている代謝産物の一部又は全てを発見するために使用され得ること、並びに本明細書に記載の代謝産物は、発見又は測定されたとしても、その検出及び測定に使用され得る分析技術に拠らない単一の化学物質（chemical entities）であることは、当業者には自明であると考えられる。
本分析によれば、ＣＲＣ陽性の血清と正常な血清の間で量が異なる数百の小分子、代謝産物、又は代謝産物フラグメントを同定することができる。本発明は、表３に記載のとおり、４８０個の代謝産物を開示しており、これらはＣＲＣ陽性の血清と正常な血清の間で、統計的に有意に量が異なっていた。２集団の間で統計的に異なるこれらの特徴の全てが、診断に使用され得る。しかし、商業的な検査法に４８０個のシグナルを組み込むのは非実用的であるので、マーカー又は代謝産物の最適な診断用セットを選択するための周知の方法を実施した。
本特許中に記載の方法から、代謝産物９個のパネルを、正常とＣＲＣを識別するために最適なものとして選んだ。本発明において、精密な中性質量（ダルトンで測定）が４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１であるか又は実質的にそれらと同等の質量を有する代謝産物（＋／−５ｐｐｍの差は同じ代謝産物を示すものとする）からなる群から選択される結腸直腸癌特異的代謝マーカーが同定された。したがって、これらのマーカーは、ＣＲＣの存在について患者をスクリーニングする診断検査に使用することができる。
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を実施するために、上記９個の代謝産物から、さらに６個を選んだ。このＨＴＳ法は、従来の三連四重極質量分析技術に基づく（概略については、図２６参照）。ＨＴＳ法は、血清抽出物を三連四重極質量分析装置に直接導入し、次いで選択イオン検出法（ＳＩＭ）により６個の親分子の各々を個々に分離することで行われる。続いて、不活性ガス（衝突ガスと呼ばれる）を用いて各分子をフラグメント化する（衝突誘起解離又はＣＩＤと総称される）。その後、各親バイオマーカーからの特異的フラグメントの強度を、マルチプルリアクションモニタリング（multiple-reaction monitoring）（ＭＲＭ）と呼ばれるプロセスによって測定及び記録する。さらに、各サンプルに内部標準分子を添加し、フラグメント化する。この内部標準フラグメントは、方法及び装置が正しく機能していれば、各々のサンプルで同じ強度を有するはずである。６個のバイオマーカーフラグメントの強度、及び内部標準フラグメントの強度が得られたら、バイオマーカーフラグメントの強度とＩＳフラグメントの強度の比率を算出し、この比率を対数変換する。各患者試料について、６個のうちの最も低い値を、事前に決定されている疾患陽性及び対照における分布と比較し、疾患に陽性又は陰性である相対的な可能性を決定する。
検出する分子によって、現在、多種類の費用効率の良い検査プラットフォームの選択肢が利用可能である。それらには、比色分析法（ＵＶ又はその他の波長）、抗体を用いる酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、核酸検出法のための、チップを利用した（chip-based）ポリメラーゼ連鎖反応、ビーズを利用した核酸検出法、ディップスティックを用いた化学的検査法、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、ＣＴスキャンなどの画像解析、及び質量分析計に基づく様々な系が含まれ得る。
本発明の本態様によれば、前のセクションで同定したＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンを用いた、ＣＲＣの患者をスクリーニングする商業的方法の開発が提供される。この検査法が全世界で配置されるには多く選択肢がある。最も明白な２点は、１）検査室に現在ある機器と互換性のあるＭＳ／ＭＳ法の開発及び世界中の多くの検査室に配置するのが容易な三連四重極質量分析計、並びに／又は２）試料の配送及び分析が一箇所ででき、患者若しくは患者の主治医に結果を返送できる検査施設の設立である。
一連の物理的特性及び化学的特性を検討し、選択した代謝産物の構造を解析し、決定した。例えば、同定に通常使用される主な性質は、精密質量及び分子式の決定、極性、酸／塩基特性、ＮＭＲスペクトル、及びＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎスペクトルである。
ＣＲＣの病状に特異的な９個の診断マーカー又は代謝産物の精密な中性質量（Ｍ−Ｈイオンを中性質量に変換）を、ＦＴＩＣＲ−ＭＳによって、４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１に決定した。これらの精密な中性質量値、極性、及びイオン化特性に基づき、９個の好ましい診断マーカーの分子式は、それぞれ、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６６Ｏ６に決定された。
これらの代謝産物のＭ−Ｈイオンは、図１３〜２１に示される娘イオンを１又は１以上含む衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンを有することを特徴とする。より詳細には、これらの７個の代謝産物のＭ−Ｈイオンは、図１３〜２１に示される娘イオンの各々を含む衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンを有することを特徴とする。
精密な質量ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づき、各推定構造をバイオマーカーの帰属を行った。バイオマーカーのＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈を総合した結果、これらは全て、カルボン酸部分（ＣＯ２の脱離により示される）と、少なくとも１個のヒドロキシル部分（Ｈ２Ｏの脱離により示される）とを含有している。さらに、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４を除く全ての構造がＣ１８ＨＸＯＹフラグメント（式中、ｘ≧３１、ｙ≧２）を生成したことから、飽和度の高い脂肪酸側鎖が示唆された。
選ばれた６個の代謝産物の式及び精密な質量を図１２に示す。
本発明はまた、以下の実施例を参照し記載するが、これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
ＣＲＣ陽性と正常健常対照群で異なる発現をしている代謝産物の発見及び同定
本発明に記載の、ＣＲＣの生化学的マーカーは、ＣＲＣ陽性患者から得た血清試料４０検体（ＴＮＭ分類によるステージＩ／IIが２４検体、ステージIII／IVが１６検体）及び健常対照から得た血清試料５０検体の分析に由来する。全ての試料は１つの時点で採取し（single time-point collections）、ＣＲＣ試料は腫瘍切除の直前又は直後に採取した。全ての試料は化学療法又は放射線療法の前に採取した。
マルチプル非標的型メタボロミクス戦略（multiple non-targeted metabolomics strategies）は科学文献に記載されており、例えばＮＭＲ［Reo, N.V., NMR-based metabolomics. Drug Chem Toxicol, 2002. 25(4): p. 375-82］、ＧＣ−ＭＳ［Fiehn, O., et al., Metabolite profiling for plant functional genomics. Nat Biotechnol, 2000. 18(11): p. 1157-61、Hirai, M.Y., et al., Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(27): p. 10205-10及びRoessner, U., et al., Metabolic profiling allows comprehensive phenotyping of genetically or environmentally modified plant systems. Plant Cell, 2001. 13(1): p. 11-29］ＬＣ−ＭＳ、及びＦＴＭＳ法［Reo, N.V., NMR-based metabolomics. Drug Chem Toxicol, 2002. 25(4): p. 375-82、Castrillo, J.I., et al., An optimized protocol for metabolome analysis in yeast using direct infusion electrospray mass spectrometry. Phytochemistry, 2003. 62(6): p. 929-37、Fiehn, O., Metabolomics--the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol, 2002. 48(1-2): p. 155-71及びAharoni, A., et al., Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics, 2002. 6(3): p. 217-34］が含まれる。本願において異なる発現をしている代謝産物の発見に用いた代謝産物プロファイリング方法は、Phenomenome Discoveries社が発明した非標的型ＦＴＭＳ法［Hirai, M.Y., et al., Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(27): p. 10205-10、Aharoni, A., et al., Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics, 2002. 6(3): p. 217-34、Hirai, M.Y., et al., Elucidation of gene-to-gene and metabolite-to-gene networks in arabidopsis by integration of metabolomics and transcriptomics. J Biol Chem, 2005. 280(27): p. 25590-5、Murch, S.J., et al., A metabolomic analysis of medicinal diversity in Huang-qin (Scutellaria baicalensis Georgi) genotypes: discovery of novel compounds. Plant Cell Rep, 2004. 23(6): p. 419-25及びTohge, T., et al., Functional genomics by integrated analysis of metabolome and transcriptome of Arabidopsis plants over-expressing an MYB transcription factor. Plant J, 2005. 42(2): p. 218-35］である。
本明細書に記載の本発明には、９０個体（ＣＲＣ４０人、正常者５０人）からの血清抽出物を、ポジティブモード及びネガティブモードの両方でＥＳＩ又はＡＰＣＩによるイオン化によりＦＴＭＳに直接導入し、分析することが含まれる。その他のＭＳを用いるプラットフォームに対するＦＴＭＳの利点は、分解能が高いことであり、これにより、分解能の低い機器ではその多くが見逃されてしまうような、数百ダルトンしか差のない代謝産物を分離することが可能となる。有機（１００％ブタノール）試料抽出物は、負イオン化モードでは、メタノール：０．１％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム（５０：５０、ｖ／ｖ）で３倍又は６倍に希釈し、正イオン化モードでは、メタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（５０：５０、ｖ／ｖ）で３倍又は６倍に希釈した。ＡＰＣＩでは、酢酸エチル有機試料抽出物を希釈せずに直接導入した。全ての分析は、７．０Ｔのアクティブシールド付き超伝導磁石を備えたBruker Daltonics APEX III FTMS（Bruker Daltonics社、Billerica、MA）を用いて実施した。試料は、ＥＳＩ又はＡＰＣＩを用いて、１時間当たり６００μＬの流速で直接導入した。イオンの輸送／検出パラメータは、セリン、テトラ−アラニン、レセルピン、Hewlett-Packard社製チューニングミックス（tuning mix）、及び副腎皮質刺激ホルモンフラグメント４〜１０の標準的な混合物を用いて最適化した。さらに、機器メーカーの推奨に従い、イオン強度及び１００〜１０００ａｍｕの質量範囲に渡る幅広い累積を最適化するように機器の状態を調整した。上記標準物質の混合物を用いて、質量精度について、１００〜１０００ａｍｕの測定範囲（acquisition range）となるように各試料のスペクトルを内部較正した。
各試料について、抽出物及びイオン化モードの組合せを含む、合計６個の別々の分析を得た：
水性抽出物
１．正ＥＳＩ（分析モード１１０１）
２．負ＥＳＩ（分析モード１１０２）
有機抽出物
３．正ＥＳＩ（分析モード１２０１）
４．負ＥＳＩ（分析モード１２０２）
５．正ＡＰＣＩ（分析モード１２０３）
６．負ＡＰＣＩ（分析モード１２０４）
水性抽出物
１．正ＥＳＩ（分析モード１１０１）
２．負ＥＳＩ（分析モード１１０２）
有機抽出物
３．正ＥＳＩ（分析モード１２０１）
４．負ＥＳＩ（分析モード１２０２）
５．正ＡＰＣＩ（分析モード１２０３）
６．負ＡＰＣＩ（分析モード１２０４）
線形最小二乗法回帰線を用いて、各内部標準の質量ピークがその理論上の質量と比較した質量誤差が１ｐｐｍ未満になるように、質量軸の値を較正した。Bruker Daltonics Inc.社製のＸＭＡＳＳソフトウェアを用いて、１メガワードのサイズのデータファイルを取得し、２メガワードまで０を入力した。フーリエ変換及び大きさの計算の前に、ｓｉｎｍデータ変換を行った。各分析から得られた質量スペクトルを積算し、各ピークの精密な質量及び絶対強度を含むピークリストを作成した。１００〜２０００ｍ／ｚの範囲にある化合物を分析した。イオン化モード及び極性の異なるデータを比較及び要約するために、全ての検出された質量ピークを、その対応する水素付加体に基づく中性質量に変換した。次いで、DISCOVAmetrics（商標）ソフトウェア（Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon、SK、カナダ)を用いて、自己生成型の二次元（質量対試料強度）アレイを作成した。複数のファイルのデータを統合し、この統合ファイルを処理して、固有の質量を全て決定した。各固有の質量の平均を決定し、ｙ軸に示した。最初に分析対象に選んだ各ファイルについてカラムを作成し、ｘ軸に示した。選んだ各ファイルの各質量中の強度を、対応するｘ、ｙ座標上に入力した。強度の値を含まない座標は空白のままにした。アレイ中に一度、データをさらに処理し、視覚化して解釈し、推定化学構造の帰属を行った。その後、各スペクトルのピークを拾い、検出された全ての代謝産物の質量及び強度を得た。次いで、全てのモードから得られたこれらのデータを結合し（merge）、試料ごとに１つのデータファイルを作成した。９０試料全てから得られたデータを結合及び整列化し、各試料がカラムで表され、各固有代謝産物が１つの列で表される、２次元代謝産物アレイを作成した。所与の代謝産物試料の組合せに対応するセルには、その試料中における代謝産物強度が表される。データをこの形式で表すことで、試料群（すなわち、正常及び癌）間で差を示す代謝産物を決定することができる。
スチューデントのｔ検定を用いて、正常試料及びＣＲＣ陽性試料の間で差が見られる代謝産物を選択した（ｐ＜０．０５）。この基準を満たした代謝産物（４８０個）を表３に示す。これらは全て、２つの集団間で統計的に有意な差のある特徴をもち、したがって、診断に有用である可能性がある。上記の特徴は、それらの精密な質量及び分析モードで記載され、この２つの特徴は、各代謝産物の推定分子式及び化学的特徴（例えば、極性及び推定官能基）を得るのに十分である。しかし、商業的に有用なアッセイへの４８０個のシグナルの組込み及び開発は非実用的である。そこで、教師付きの統計的手法を用いて、以下に記載のように、４８０個から最適な診断用の特徴セットを抽出した。
マイクロアレイ予測解析（prediction analysis of microarrays）（ＰＡＭ）と呼ばれる教師付きの統計的手法を用いて、最初のアレイから、最適な診断特性を有する代謝産物特徴を選んだ［Tibshirani, R., et al., Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6567-72］。本方法では、対応する診断結果が既知の試料で分類アルゴリズムを訓練し、それを未知試料（すなわち、テスト例）の診断に適用することができる。教師付きの方法は複数あるが、最良の特徴セットを同定するためにはどの方法を用いてもよく、例えば、人工ニューラルネトワーク（ＡＮＮ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、部分最小二乗法による判別分析（partial least squares discriminant analysis）（ＰＬＳＤＡ）、半線形関連方法（sub-linear association methods）、ベイズ推論法、教師付き主成分分析（ＰＣＡ）、縮重重心法（shrunken centroids）（本明細書に記載）、その他（概説については［Wu, B., et al., Comparison of statistical methods for classification of ovarian cancer using mass spectrometry data. Bioinformatics, 2003. 19(13): p. 1636-43］参照）を挙げることができる。
本研究では、ＣＲＣ試料を４０検体しか利用できないため、ＣＲＣ診断へのＰＡＭ法の有効性を２つの方法で検討した。第１の方法では、テスト例用の試料を残さず、９０検体全て（ＣＲＣ及び正常）を用いて、交差検定された訓練分類器を構築した。第２の方法では、試料を無作為に半分に分割し、一方を分類器の構築に使用し、他方を診断用の盲検「テスト例」として使用した。第１の方法ではより多くの試料を用いて分類器を作成しているので、その推定精度は第２の方法よりも高いことが予想され、したがって、高い診断精度を得るために必要となる代謝産物は少なくなる。重要な点は、第１の方法で同定されるのと同じ診断特徴が、第２の方法で同定されるサブセットにも含まれるということである。これらの結果と質量分析データからの信号対雑音の強度情報とに基づき、さらに構造的特徴を解析する、最適なＣＲＣ診断用バイオマーカーセットとして、７個の代謝産物が選ばれた。図２Ａのグラフは、様々な閾値（ユーザー定義のＰＡＭパラメータ）において所与の訓練誤差を達成するために必要な代謝産物の数を示している。このプロットは、たった７個の代謝産物特徴を用いることで、誤り率が１０％（０．１訓練誤差）未満の訓練分類器が得られることを示している（閾値は約５．８、矢印を参照）。３００以上の代謝産物特徴を用いたときに最も低い訓練誤差が達成されるが、その誤差は７個の代謝産物特徴を用いたときよりも数パーセント低いだけであり、また、数百の特徴を使用するのは臨床的有用性の点から非現実的であることに留意することも意味がある。図２Ｂのプロットは、概念的には２Ａのプロットと似ているが、２Ｂのグラフは、ＰＡＭプログラムに不可欠な交差検定処理を行った後にＣＲＣ及び正常個体について訓練した分類器の誤分類エラーを示している。ひし形でつながれた線は前述の結果を反映しており、ＣＲＣ陽性個体についての交差検定された最小の誤分類エラーが、たった７個の代謝産物を用いることで達成され得ることを示している。四角で描かれた正常固体も、たった１個の代謝産物特徴を使用するだけで、正常であると正確に診断することができることが示されている。しかし、この閾値では、ＣＲＣの誤分類エラーが９５％を超えている（矢印参照）。したがって、この方法に基づく、ＣＲＣの陽性及び陰性の両方を診断することができる代謝産物特徴の最良の組合せには、７個の代謝産物特徴の組合せが含まれる。これらは、４４６．３４０６、４５０．３７２６、４６６．３６６１、５３８．４２５９、４６８．３８４、５９２．４７１１、及び５９４．４８５１の質量を有するか又はこれらと実質的に同等の質量を有していた。
本研究における９０個体各々の、個々の交差検定後の診断確率を図３に示す。ＣＲＣ陽性試料を全てグラフの左側に記載し、正常個体を右側に記載する。各試料はグラフ上に２つの点を有し、１つはＣＲＣを有する確率を示し（ひし形）、1つはＣＲＣを有しない（すなわち、正常である）確率を示す（四角）。図に示されているとおり、正常であると分類されたＣＲＣ試料は７検体あり（グラフ左側の丸囲み）、ＣＲＣ陽性であると分類された正常試料は２検体あった（グラフ右側の丸囲み）。予想された確率から、ＪＲＯＣＦＩＴ（http://www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html）を用いて、真陽性率（ＣＲＣに罹患していると予測されたＣＲＣ個体）対擬陽性率（ＣＲＣに罹患していると予測された正常個体）を示す図４の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。曲線下面積は９５％であり、感度は８２．５％、特異度は９６％である。全体として、交差検定した設計に基づくと、診断精度は９０％である。これら７個の代謝産物を、構造的特性を解析するためにさらに選んだ。
訓練例に使用できる試料が多いほど、得られる分類器の未知試料の診断における精度は高くなるはずであるというのが、上述の最適な診断マーカーパネルの同定に試料を９０検体全てを用いた理由であった。しかし、このアプローチの欠点は、（訓練例に含まれていない）盲検テスト例として使用できる試料が残らないことである。この問題に取り組むため、試料を無作為に２つの群に分け、一方は分類器構築用とし、他方はテスト例としての使用用とした。訓練例は、ＣＲＣ試料２１検体及び正常試料２７検体を含んでなる。これらの試料を用いた、誤分類エラーを最も低くするために必要な代謝産物の最適数は１６であった（図５下部に記載）。これら１６個には、上述の７個のサブセットが含まれている。次に、この分類器を用いて、残りの試料（盲検；ＣＲＣ２２検体、正常２７検体）の診断を予測した。盲検試料がＣＲＣ陽性又は正常である予測確率を図５にプロットする。この結果は、ＣＲＣ陽性試料のうちの２検体で、正常である確率の方が高く、正常試料のうちの２検体でＣＲＣ陽性である確率の方が高いことを示している。図６Ａは、テスト例に使用された患者、及びその実際の診断結果及び予想診断結果を示す。その後、図５の確率を図６Ｂに示すＲＯＣ曲線に変換した。盲検テスト例の分類に基づく性能特性は、感度９１％、特異度９２．６％であり、全体の診断精度は９１．８％であった。
分類器により選択された７個の代謝産物が、実際にＣＲＣ血清と正常血清とで差があることを実証するために、生スペクトルデータを視覚化した。正常試料５検体及びＣＲＣ試料５検体について、７個のバイオマーカーのうちの６個についてのスペクトルを、図７Ａ〜７Ｆに示す（各パネル、上部が正常試料、下部がＣＲＣ試料）。各々のケースにおいて、マーカーは、正常試料中には存在し、ＣＲＣ試料中には存在していない。
これらの結果に基づけば、ＣＲＣ陽性患者と健常（非ＣＲＣ）個体の血清の間には明確な識別が可能である。したがって、このような、ＣＲＣ陽性とＣＲＣ陰性の血清を同定し区別できるという発見は、本願に記載されているように、ＣＲＣ診断テストの基礎を形成する。
発見された代謝産物を確認する独立した方法
ＦＴＭＳ法を用いて発見された７個の診断用代謝産物の、正常血清及びＣＲＣ血清の間における強度の差を、独立に、質量分析法を用いて検証した。典型的なＣＲＣ陽性試料抽出物５検体及び典型的な正常試料抽出物５検体を、ABI QSTAR（登録商標）質量分析計に連結されたHP1050高速液体クロマトグラフィーを用いたＬＣ−ＭＳにより分析した。
ＣＲＣ試料抽出物５検体及び正常試料抽出物５検体の酢酸エチル画分を窒素ガス下で蒸発させ、イソプロパノール：メタノール：ギ酸（１０：９０：０．１）７０μＬ中に再構成した。再構成試料のうち１０μＬを、ＨＰＬＣ（Hypersil ODS 5 u, 125 x 4 mmカラムを備えたHP 1050、Agilent Technologies社製）によるフルスキャンにかけ、３０μＬを、流速１ｍｌ／分でＭＳ／ＭＳにかけた。
ＨＰＬＣ溶出物を、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源に取り付けられたABI QSTAR（登録商標）ＸＬ質量分析計を用いて、負モードで分析した。フルスキャンモードのスキャンタイプは、蓄積時間が１．００００秒、質量範囲が５０〜１５００Ｄａ、継続時間が５５分の飛行時間型（ＴＯＦ）とした。源のパラメータは以下の通りである：イオン源ガス１（ＧＳ１）８０；イオン源ガス２（ＧＳ２）１０；カーテンガス（ＣＵＲ）３０；ネブライザー電流（ＮＣ）−３．０；温度４００℃；デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）−６０；フォーカシングポテンシャル（ＦＰ）−２６５；デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ２）−１５。ＭＳ／ＭＳモードは、スキャンタイプは生成イオン、蓄積時間は１．００００秒、スキャン範囲は１０〜６５０Ｄａ、継続時間は５５分とした。源のパラメータは全て上述と同じにし、衝突エネルギー（ＣＥ）を−３５Ｖ、衝突ガス（ＣＡＤ、窒素）圧は５ｐｓｉとした。
バイオマーカー６個について、QSTAR（登録商標）による検出で抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を図８Ａ〜図８Ｆに示す。上のパネルは、５つの正常なＥＩＣを示し、各々の下のパネルは５つのＣＲＣのＥＩＣを示す。また、QSTAR（登録商標）の感度はＦＴＭＳより優れているため、選択したバイオマーカーについて、正常集団とＣＲＣ集団の間の強度の差は、より大きくなる。
図９は、保持時間１６〜１７分のウィンドウにおける、代謝産物６個についての３セットの抽出質量スペクトル（ＥＭＳ）を示す。図９Ａは、正常試料５検体の平均ＥＭＳを示し、一方、図９Ｂは、ＣＲＣ試料５検体の平均ＥＭＳを示している。図９Ｃは、上の２つのスペクトルの純差（net difference）を示す。図に示されているように、質量範囲約４４５〜６００Ｄａの全てのピークが、ＣＲＣのパネルではほとんど検出されていない（四角で囲まれた領域）。ＦＴＭＳプラットフォームで同定されたバイオマーカー７個は全てQ-Trapで検出され、この質量範囲における最も大きなピークの７つであった（矢印で強調表示）。
正常者及びＣＲＣ患者について、ＦＴＭＳ及びQ-Starで検出された７個のマーカーの平均を、それぞれ図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。これら分子について、両方のプラットフォームで、ＣＲＣ陽性集団における再現性のある一貫した減少が観察された。
ＰＡＭアルゴリズムによって、「最適な」診断性能を有する７個の特徴が選ばれたが、最初にＦＴＭＳによって得られた、分子式、化学特性、及びイオン化情報に基づいてこれら７個に関連があると思われた代謝産物のデータを再検証した。ＰＡＭが選んだ７個に関連する、３０を超える分子を同定することができ、これらは全て、ＣＲＣ患者コホートにおいて発現が低下していた。これらは、炭素含量によってさらに分類することができた（すなわち、炭素数２８、３２、又は３６のもの）（図１１参照）。これらの情報に基づいて、どの分子をハイスループットスクリーニング法に用いるべきか再評価し、２集団（ＣＲＣ及び正常）間で一貫して最も強い識別子であると思われた炭素数２８の分子６個を用いることに決定した。
主要代謝産物バイオマーカーの構造解明（ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、及びＭＳＭＳ）
新規代謝産物の構造解明に通常使用される基本的な性質は、精密な質量及び分子式の決定、極性、酸／塩基特性、ＮＭＲスペクトル、及びＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎスペクトルである。しかし、構造決定の際に代謝産物のその他の性質を使用することができることは当業者には明らかであろう。
９個の好ましい診断用マーカーの分子式は、それらの精密な中性質量、極性、及びイオン化特性に基づき、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６６Ｏ６に決定された。
目的の代謝産物を含む抽出物を、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＬＣ−ＭＳにかけ、上述の詳細な方法に記載したＭＳによる分析に供した。前記バイオマーカー全ての保持時間は、これらのＨＰＬＣ条件下で約１６．５分であった。
抽出条件からも、バイオマーカーの化学特性についての洞察が得られる。代謝産物マーカー７個は全て有機酢酸エチル画分に抽出されたことから、これらの代謝産物が酸性条件下で非極性であることが示唆された。さらに、これらは負ＡＰＣＩモードで優先的にイオン化されたことから、分子中の酸性プロトンの存在が示唆された。
分子の構造は、決められた条件下において特異的なフラグメンテーションパターンを与え、そのフラグメンテーションパターンは、その分子に特異的である（人の指紋に相当）。分子構造がわずかに変化しただけでも、フラグメンテーションパターンは異なり得る。分子に固有な指紋が提供されることに加え、ＣＩＤにより生成されたフラグメントは、分子の構造についての洞察を得るために使用することができる。ＭＳ／ＭＳ分析を、ABI-QSTAR（登録商標）XLを用い、パラメータは全て前述のパラメータを用い、窒素を衝突ガスとして５ｐｓｉで使用し、ＣＥのセッティングを−２５、−３５、及び−５０ボルトにして行った。
診断能が最も高く、ＨＴＳ開発に最も適しているとして同定された６個の代謝産物を、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いたＭＳ／ＭＳ用のフラグメント化に供した。最初の９個から上記６個を選び、全て炭素数２８の分子であって、同じ分析モードで全て検出することができる分子へとグループを狭めた。図１２Ａ〜１２Ｆは、検討された６個の分子の式を示している。
要約すると、バイオマーカーのＭＳ／ＭＳスペクトルの総合的解釈より、これらは全て、カルボン酸部分を含み（ＣＯ２の脱離により示される）、ヒドロキシル部分を少なくとも１つ含む（Ｈ２Ｏの脱離により示される）ことが示唆される。さらに、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４以外の全ての構造がＣ１８ＨｘＯｙフラグメント（式中、ｘ≧３１かつｙ≧２）を生成したことから、高度に飽和された脂肪酸側鎖の存在が示唆された。軽微な変更（限定されるものではないが、例えば、二重結合の位置、ヒドロキシル基の位置、特定の炭素原子の立体配向又はキラル配向）は、上述のバイオマーカーの性質（identity）を有意に変えるものではないことは、当業者に明らかであろう。以下でさらに特徴を解明するマーカー６個について、フラグメントを図１３〜２１及び表５〜１０に示す。ＭＳ−ＭＳの結果として記載されている質量は検出された質量であり、中性質量ではない。これらをＭ−１質量と呼ぶ。これらは、負イオン化モードの質量分析計で検出されたことから、以前のセクションで言及したそれらの対応する中性物質と比べ、質量１Ｄａが失われているか又は式中の水素分子１つが脱離していると考えられる。しかし、Ｍ−１質量は、対応する中性物質と同じ分子を表す。続くＮＭＲのセクションで言及されているのは中性質量である。
詳細には、各バイオマーカーについて負イオン化モードで得られたＭＳ／ＭＳデータを、構造の帰属、特に官能基の位置決定のために、個々に分析した。各バイオマーカーのＭＳ／ＭＳスペクトルは、水の脱離によるピーク（Ｍ−１８）及び二酸化炭素の脱離によるピーク（Ｍ−４４）を示した。これらから、第三級又は第二級炭素分子に隣接する遊離ヒドロキシル基、及びカルボン酸基の存在が示唆される。炭素鎖フラグメントの脱離も共通して観察されたが、この鎖の開裂は異なる場所で起こっていた。
Ｃ２８Ｈ４７Ｏ４（表５、図１３）について、最初に水及び二酸化炭素の脱離が観察される（ｍ／ｚ ３８５；Ｃ２７Ｈ４５Ｏ）。次に、ｍ／ｚ ２７９（Ｃ１９Ｈ３５Ｏ）を表すフラグメントは、炭素鎖のＣ１０−Ｃ４部位における開裂を示唆している。
Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５（表６、図１４）は２つの遊離ヒドロキシル官能基を有し、通常の二酸化炭素の脱離に加え、水２分子の脱離を示している（ｍ／ｚ＝３８３；Ｃ２７Ｈ４３Ｏ）。Ｃ１８−Ｃ１９の開裂により、Ｃ２２Ｈ３５Ｏ（ｍ／ｚ ３１５）のフラグメントが生じると思われる。続く、水分子の脱離を示すｍ／ｚ ２９７（Ｃ２２Ｈ３３）に対応するシグナルも観察された。バイオマーカー３（ｍ／ｚ ４４８．３７２６）と違い、炭素鎖の開裂はＣ１２−Ｃ１３で起こっており、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５のＭＳ／ＭＳスペクトル中に、半分に分かれた２つの分子、ｍ／ｚ ２４１（Ｃ１４Ｈ２５Ｏ３）、ｍ／ｚ ２２３（Ｃ１４Ｈ２３Ｏ２）が観察された。
Ｃ２８Ｈ４５Ｏ４（表７、図１５）のＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５のスペクトルと似たパターンを示している。水の脱離（ｍ／ｚ ４２７；Ｃ２８Ｈ４３Ｏ３）、及び二酸化炭素の脱離（ｍ／ｚ ４０１；Ｃ２７Ｈ４５Ｏ２）は、片方だけ脱離したもの、及び両方同時に脱離したもの（ｍ／ｚ ３８３；Ｃ２７Ｈ４３Ｏ）の両方が観察された。Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５同様、炭素鎖の開裂はＣ１２−Ｃ１３で、最初にＣ１７−Ｃ１８間における水の脱離の後に起こっており、ｍ／ｚ ２２３（Ｃ１４Ｈ２３Ｏ２）のフラグメントが生成されている。対となる他方のフラグメントであるＣ１４Ｈ２１Ｏ（ｍ／ｚ２０５）も観察され、これはまた、それぞれＣ２Ｈ８及びＣＨ３の脱離を示す、次の２つの連続するフラグメント、ｍ／ｚ １７７（Ｃ１２Ｈ１７Ｏ）及びｍ／ｚ １６２（Ｃ１１Ｈ １４ Ｏ）の親イオンをも表している。
興味深いことに、Ｃ２８Ｈ４９Ｏ５（表８、図１６）においては、通常の水の脱離（ｍ／ｚ ４４７；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ４）及び二酸化炭素の脱離（ｍ／ｚ ４２１；Ｃ ２７ Ｈ ４９ Ｏ３）に加えて、エタノールフラグメントの脱離（ｍ／ｚ ４３３；Ｃ２７Ｈ４５Ｏ４）、続くエチレンフラグメントの脱離（ｍ／ｚ ４０５；Ｃ２６Ｈ４５Ｏ３）も検出された。炭素側鎖のフラグメント化による、複数の異なるフラグメントが観察された。それらには、Ｃ１８−Ｃ１９における開裂（ｍ／ｚ ３４９；Ｃ２２Ｈ３７Ｏ３）、最初にＣ１８−Ｃ１７間の水が脱離された後のＣ１−Ｃ２における開裂（ｍ／ｚ ２９７；Ｃ１８Ｈ３３Ｏ３）とそれに続く別の水分子の脱離（ｍ／ｚ ２７９；Ｃ１８Ｈ３１Ｏ２）、及びＣ１５−Ｃ１６における開裂（ｍ／ｚ １８５；Ｃ１３Ｈ１９Ｏ３）が含まれる。予測された、Ｃ１２−Ｃ１３間のフラグメンテーションも、２つの対分子イオン（ｍ／ｚ ２４１（Ｃ１５Ｈ２９Ｏ２）及びｍ／ｚ ２２３（Ｃ１３Ｈ１９Ｏ３））として観察された。
Ｃ２８Ｈ４９Ｏ４（表９、図１７）のＭＳ／ＭＳスペクトルも、予想された水及び二酸化炭素の脱離を示した（ｍ／ｚ ４３１；Ｃ２８Ｈ ４７ Ｏ ３ ）、ｍ／ｚ ４０５；Ｃ２７Ｈ４９Ｏ２）。Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５のスペクトル同様、水２分子の脱離によるフラグメントが示された（ｍ／ｚ ４１３；Ｃ２８Ｈ４５Ｏ２）。このことから、構造中に遊離ヒドロキシル基が２個存在することが示唆される。開裂は、Ｃ１５−Ｃ１６間（ｍ／ｚ ２８１；Ｃ１８Ｈ３３Ｏ２）、及び水分子の脱離に先立つＣ１６−Ｃ１７間（ｍ／ｚ ２７７；Ｃ１９Ｈ３３Ｏ）の２ヶ所で起こる。これらのフラグメントから、炭素鎖中にヒドロキシル基が存在しないこと、及びＣ１７−Ｃ１８間が不飽和であることが証明された。
Ｃ２８Ｈ５１Ｏ５（表１０、図１８）のＭＳ／ＭＳスペクトルにより、水２分子の脱離（ｍ／ｚ ４３１；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ３）並びに水及び二酸化炭素分子が同時に脱離した別のフラグメント（ｍ／ｚ ４０５；Ｃ２７Ｈ４９Ｏ２）が示され、これは２個の遊離ヒドロキシル基及び１個のカルボニル官能基の存在を示唆している。個々で観察されたフラグメントのいくつかは、Ｃ２８Ｈ４９Ｏ５で観察されたフラグメントと同じであった。Ｃ２８Ｈ４９Ｏ５がＣ２８Ｈ５１Ｏ５と異なる点は、不飽和度が高いことだけであり、最初にＣ１８−Ｃ１７間の水が脱離した後のＣ１−Ｃ２における開裂（ｍ／ｚ ２９７；Ｃ１８Ｈ３３Ｏ３）と続く別の水分子の脱離（ｍ／ｚ ２７９；Ｃ１８Ｈ３１Ｏ２）がそれである。その後の、Ｃ１８Ｈ３１Ｏ２からのＣＨ４の脱離が、ｍ／ｚ ２６３（Ｃ１７Ｈ２７Ｏ２）の分子イオンピークで表されている。ｍ／ｚ ２１５（Ｃ１２Ｈ２３Ｏ３）の分子イオンピークは、Ｃ１３−Ｃ１４結合の開裂と続くＣＨ３の脱離によって生じた炭素鎖のフラグメントを表している。炭素鎖がＣ１５−Ｃ１６で開裂したことによるフラグメント（ｍ／ｚ １８７；Ｃ１０Ｈ１９Ｏ３）が、次の２つの連続するフラグメント（Ｃ１０Ｈ１９Ｏ３から、それぞれ、水分子の脱離（ｍ／ｚ １６９；Ｃ１０Ｈ１７Ｏ２）及びエチレンフラグメントの脱離（ｍ／ｚ １４１；Ｃ８Ｈ１３Ｏ２）によって生じる）の親イオンとして観察された。
これらの炭素数２８の分子６個に加えて、炭素数２８でない分子のＭＳＭＳ分析も実施した（図１９〜２１に示す）。これらの、炭素数３２及び炭素数３６のバイオマーカーは、代謝副産物と考えられる。
ＮＭＲ法及びＦＴＩＲ法における全ての薬品及び媒体はSigma-Aldrich Canada Ltd.社（Oakville, ON）から購入した。全ての溶媒（solvent）をＨＰＬＣグレードのものを用いた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析を、プレコートしたシリカゲルＴＬＣアルミニウムシート（EM science社製、Kieselgel 60 F254、５×２ｃｍ×０．２ｍｍ）を用いて実施した。化合物は、ＵＶ光（２５４／３６６ｎｍ）で可視化するか、又はヨウ素蒸気のタンク中に置き、プレートに、１％硫酸セリウム（ｗ／ｖ）及び４％Ｈ２ＳＯ４（ｖ／ｖ）を含む５％リンモリブデン酸水溶液（ｗ／ｖ）を滴下し、その後加熱することで可視化した。分取薄層クロマトグラフィー（分取ＴＬＣ）をシリカゲルプレート（EM science社製、60 F254 ２０×２０ｃｍ、厚さ０．２５ｍｍ）上で行った。化合物はＵＶ光下及びヨウ素中で可視化した。クォータナリポンプと、オートインジェクターと、脱気装置と、インラインフィルターを取り付けたセミ分取カラム（シリカ粒子径５μｍ、９．１ｉ．ｄ×２００ｍｍ）及びHypersil ODSカラム（シリカ粒子径５μｍ、４．６ｉ．ｄ×２００ｍｍ）とを備えた高速液体クロマトグラフを用いてＨＰＬＣ分析を行った。移動相は、流速１．０ｍｌ／分で、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨから１００％ＭｅＯＨへのリニアグラジエント（５２分）とした。
ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）のδ値はＣＤＣｌ３（７．２４ｐｐｍにＣＨＣｌ３）を基準に、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．８ＭＨｚ）のδ値はＣＤＣｌ３（７７．２３ｐｐｍ）を基準にして、Bruker Avance社製の分光計で記録した。高分解能（ＨＲ）質量スペクトル（ＭＳ）は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計であるBruker apex 7T、及びＴＯＦ型質量分析計であるQstar XLで、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源を負モードにして記録した。フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）スペクトルは、Bio-Rad FTS-40分光光度計で記録した。スペクトルは、ＫＢｒに分散させた試料について、拡散反射法で測定した。
血清抽出物の粗精製プールＨＰＬＣ画分（３２ｍｇ）は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルで化合物の混合物であることが示され、これを分取ＴＬＣで精製し、図１２Ａ〜１２Ｄに示す構造：Ａ（３、３．６ｍｇ）、Ｂ（４、２．５ｍｇ）、Ｃ（５、３．４ｍｇ）、及びＤ（６、４．６ｍｇ）が得られた。以下のセクションでは、これらについて触れる。
化合物３の分子式（図１２Ａ（３））は、ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳにより、不飽和度５のＣ２８Ｈ４８Ｏ４（中性）に決定された。ＦＴＩＲによる、３３１５（ｂｒ）及び１７４１ｃｍ−１における吸収から、ヒドロキシル基及びカルボニル基が示唆された。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲの分光分析データ（表１１及び１２）を分析した結果、６個のメチル基、４個のオレフィン炭素、及び炭素長鎖の存在が示された。δ Ｈ２．２４メチンプロトン（Ｈ−２２）との長距離相関を示している、δＣ１７３．８に見られる唯一のカルボニル様炭素（Ｃ−２３）は、そのＭＳ／ＭＳスペクトルに二酸化炭素の脱離が観察されたことから、カルボン酸官能基であることが確認された。同様に、δＣ７４．２の炭素（Ｃ−９）は、δＨ２．２８のメチレンプロトン（Ｈ−４）と相関を示し、このプロトンは、δＨ２．２８の別のメチレンプロトン（Ｈ−６）と共に、δＣ１３０．５のｓｐ２炭素（Ｃ−１０）にＨＭＢＣ相関を示した。炭素鎖上に、δＨ１．５５のメチルプロトン（Ｈ−２６）とδＣ１２３．２のｓｐ２炭素（Ｃ−１３）、δＨ１．０１付近のメチレンプロトン（Ｈ−１２、Ｈ−１５）とδＣ１４０．２のｓｐ２炭素（Ｃ−１４）、及びδＨ０．９１付近のメチルプロトン（Ｈ−２５）とδＣ５６．６の第三級炭素（Ｃ−１８）の間で長距離相関が観察された。ＭＳ／ＭＳスペクトル分析から、水及び二酸化炭素の脱離並びに炭素鎖フラグメントの脱離によるフラグメント（ｍ／ｚ ２７９；Ｃ１８Ｈ３１Ｏ２）が確認される。
化合物４（図１２Ｂ（４））はＣ２８Ｈ４８Ｏ５の分子式を有し（ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ）、不飽和度５を示していた。ＦＴＩＲによる、３４３７（ｂｒ）及び１７４３ｃｍ−１の吸収から、ヒドロキシル基及びカルボニル基が示唆された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４のスペクトルと非常によく似ていた。違いは、ヒドロキシ基が１つ多いことだけであった。これは、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４と比べて、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションにおけるＨ２Ｏの脱離が１つ多いことから示唆された。このヒドロキシ基は、Ｈ−５（δＨ２．２１〜２．２５）及びＨ−７（δＨ １．４７〜１．５３）のメチレンプロトンとＨ−６（δＨ ３．６９〜３．７１）のメチンプロトンとの１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ相関を考慮して、Ｃ−６上に帰属された。ＭＳ／ＭＳ分析により、ＣＯ２分子の脱離により示されるカルボン酸基の存在、並びにＣ１２−Ｃ１３間での開裂により生じたＭＳ／ＭＳフラグメントであるＣ１４Ｈ２５Ｏ３（ｍ／ｚ ２４１）及びＣ１４Ｈ２３Ｏ２（ｍ／ｚ ２２３）の存在も確認された。さらにこのことは、炭素鎖上のジエン及びヒドロキシル化を示唆する。
化合物５（図１２Ｃ（５））はＣ２８Ｈ４６Ｏ４の分子式を有し（ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ）、不飽和度６を示していた。ＦＴＩＲによる、３１２５（ｂｒ）及び１７３６ｃｍ−１の吸収から、ヒドロキシル基及びカルボニル基の存在が示唆された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４のスペクトルと非常によく似ていた。違いは、二重結合が１つ多いことだけであった。この二重結合はＣ６−Ｃ７間での脱水によって生じたと考えられる。ＭＳ／ＭＳスペクトルの分析により、カルボン酸基の存在、水の脱離により生じたフラグメント、並びにＣ２８Ｈ４８Ｏ５で観察されたのと同様な、Ｃ１２−Ｃ１３間の開裂により生じたフラグメントであるＣ１４Ｈ２３Ｏ２（ｍ／ｚ ２２３；Ｃ１４Ｈ２５Ｏ３−Ｈ２Ｏ）及びＣ１４Ｈ２１Ｏ（ｍ／ｚ ２０５；Ｃ１４Ｈ２３Ｏ２−Ｈ２Ｏ）が確認された。
化合物６（図１２Ｄ）はＣ２８Ｈ５０Ｏ５の分子式を有し（ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ）、不飽和度４を示していた。ＦＴＩＲによる、３３１４（ｂｒ）及び１７４４ｃｍ−１の吸収から、ヒドロキシル基及びカルボニル基が示唆された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４及びＣ２８Ｈ４８Ｏ５のスペクトルと幾分似ていたが、大きな違いもいくつか観察された。類似点としては、６個のメチル基、４個のｓｐ２混成炭素、及びδＨ２．２８（Ｈ−２２）のメチンプロトンと長距離相関を示しているδＣ１７４．１に見られる1個のカルボニル様炭素（Ｃ−２２）の存在を挙げることができる。相違点としては、 １Ｈ ＮＭＲのスペクトルが、共にδＨ５．１２のメチンプロトン（Ｈ−２、ｍ）とカップリングしているδＨ４．２７〜４．２９（Ｈ−２７ａ、ｄｄ、Ｊ＝４．０、１２．０Ｈｚ）及びδＨ４．０４〜４．１４（Ｈ−２７ｂ、ｄｄ、Ｊ＝６．０、１２．０Ｈｚ）の２個のメチレンプロトンを含むスピン系を示していること等を挙げることができる（このことは１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ及び１Ｈ−１Ｈ同種核デカップリング実験によって示された）。さらに、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５のＨＭＢＣ及び１Ｈ−１ＨＣＯＳＹは、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、及びＣ２８Ｈ４６Ｏ４に共通して見られた、メチルプロトンとｓｐ２炭素との間の長距離相関を示さず、これは炭素鎖が飽和していることを示している。ＭＳ／ＭＳスペクトル分析により、カルボキシル基の存在、水の脱離によるフラグメント、Ｃ１２−Ｃ１３間における開裂の結果生じる２つの共通するフラグメント（ｍ／ｚ ２４１及びｍ／ｚ ２２３）が確認された。このことから、炭素鎖が飽和しているものの、構造に関するその他の点は、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、及びＣ２８Ｈ４６Ｏ４の構造に類似している。
テストした溶媒系を用いた分取ＴＬＣで分離できなかったその他のバイオマーカー２個の構造（Ｃ５８Ｈ５０Ｏ４（７、図１２Ｅ）及びＣ２８Ｈ５２Ｏ５（８、図１２Ｆ））は、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションデータを評価することで、決定された。
代謝産物を血清から単離し、構造をＮＭＲで再確認した。合計２００ｍＬの血清を酢酸エチル（５００ｍＬ、３×）で抽出し、窒素エバポレータ（nitrogen evaporator）を用いて乾燥させ、抽出物をメタノール４ｍＬに再構成した。この抽出物を、１分間分取（1 min window）で５２分間フラクションを回収するように設定したフラクションコレクションモードでＬＣ／ＭＳにかけた（インジェクション１００μＬ、４０×）。１５〜１７分の間に溶出された予想される代謝産物をプールし、窒素エバポレーターを用いて濃縮乾固した（約３２ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲスペクトルで関連化合物混合物を示した半精製フラクションを分取ＴＬＣにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２−ヘキサン（２：１）で展開した結果、化合物３（３．６ｍｇ）及び化合物４（２．５ｍｇ）が得られた。残りのバンドを合わせて（約２２ｍｇ）、シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ（３５：５：１）を用いた分取ＴＬＣにさらに供し（２回）、化合物５（３．４ｍｇ）、化合物６（４．６ｍｇ）及び１つのフラクション（６．６ｍｇ）が得られた。上記１つのフラクションは混合物であることが分かった。
化合物３
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．８１（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３１５（ｂｒ）、２９３５、２８５２、１７４１、１４６５、１３７７、１１７８、７２６。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４４７．３４９０（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ４の計算値は４４７．３４８０）。ＭＳ／ＭＳ m/z（相対強度）：４４７（［Ｍ−Ｈ−、５０％］)、４２９（４５％）、４０３（１００％）、３８５（２０％）、２７９（１０％）。
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．８１（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３１５（ｂｒ）、２９３５、２８５２、１７４１、１４６５、１３７７、１１７８、７２６。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４４７．３４９０（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ４の計算値は４４７．３４８０）。ＭＳ／ＭＳ m/z（相対強度）：４４７（［Ｍ−Ｈ−、５０％］)、４２９（４５％）、４０３（１００％）、３８５（２０％）、２７９（１０％）。
化合物４
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２１（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３４７（ｂｒ）、２９３５、２８６８、１７４３、１４６６、１３７７、１０５７、９５８。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４６３．３４４９（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５の計算値は４６３．３４２９）。ＭＳ／ＭＳ m/z（相対強度）：４６３（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４４５（５０％）、４１９（９０％）、４０１（２５％）、２４１（２０％）。
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２１（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３４７（ｂｒ）、２９３５、２８６８、１７４３、１４６６、１３７７、１０５７、９５８。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４６３．３４４９（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４７Ｏ５の計算値は４６３．３４２９）。ＭＳ／ＭＳ m/z（相対強度）：４６３（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４４５（５０％）、４１９（９０％）、４０１（２５％）、２４１（２０％）。
化合物５
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．７９（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１、ＵＶアクティブスポット）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３１２５（ｂｒ）、２９４１、２８５５、１７３６、１５５６、１４６６、１３７７、１１７７、１００８、７７３。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４４５．３３３３（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４５Ｏ４の計算値は４４５．３３２３）。ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４４５（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４２７（６０％）、４０１（８５％）、３８３（４０％）、２２３（１２％）、２０５（２０％）、１７７（１０％）、１６２（１８％）。
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．７９（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１、ＵＶアクティブスポット）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３１２５（ｂｒ）、２９４１、２８５５、１７３６、１５５６、１４６６、１３７７、１１７７、１００８、７７３。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４４５．３３３３（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４５Ｏ４の計算値は４４５．３３２３）。ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４４５（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４２７（６０％）、４０１（８５％）、３８３（４０％）、２２３（１２％）、２０５（２０％）、１７７（１０％）、１６２（１８％）。
化合物６
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．６２（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１、ＵＶアクティブスポット）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３１４（ｂｒ）、２９２６、２８５４、１７４４、１４６５、１３７９、１２５３、１１４５、７２２。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４６５．３５８８（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４９Ｏ５の計算値は４６５．３５８５）。ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４６５（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４４７（５０％）、４２１（３５％）、４０３（２０％）、３４９（１０％）、２７９（１８％）。
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．６２（シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２−ＥｔＯＡｃ、１０：４：１、ＵＶアクティブスポット）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルについては、表１１及び１２を参照されたい。ＦＴＩＲ（ｃｍ−１）３３１４（ｂｒ）、２９２６、２８５４、１７４４、１４６５、１３７９、１２５３、１１４５、７２２。ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：計測値４６５．３５８８（［Ｍ−Ｈ］−；Ｃ２８Ｈ４９Ｏ５の計算値は４６５．３５８５）。ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４６５（［Ｍ-Ｈ］−、１００％）、４４７（５０％）、４２１（３５％）、４０３（２０％）、３４９（１０％）、２７９（１８％）。
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の開発及び個別試料セットの分析
次に、ＦＴＭＳ法を用いて発見され、ＬＣ−ＭＳ法で確認を行った、主要バイオマーカー６個のハイスループット分析法を開発した。
非標的型ＦＴＭＳ用に、血清試料を記載のとおりに抽出した。各試料の分析には酢酸エチル有機画分を用いた。各試料の酢酸エチル画分１２０μＬずつに、内部標準（１ｎｇ／ｍＬの、メタノール中（２４−１３Ｃ）コール酸）を１５μＬ添加して、最終体積を１３５μＬとした。フローインジェクション分析により、4000QTRAPにオートサンプラーで試料１００μＬを注入した。キャリア溶媒には９０％メタノール：１０％酢酸エチルを用い、ＡＰＣＩ源への流速は３６０μＬ／分とした。
TurboV（商標）源及びＡＰＣＩプローブを備えた四重極リニアイオントラップABI 4000Q質量分析計によるＭＳ／ＭＳ ＨＴＳ法を開発した。ソースガスのパラメータは以下のとおりである：ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：６、ＮＣ：−３．０、ＴＥＭ：４００、ＧＳ１：１５、インターフェースヒーター：オン。「化合物」の設定は以下のとおりである：入口電圧（ＥＰ）：−１０、及び衝突セル出口電圧（ＣＸＰ）:−２０．０。本方法は、各代謝産物の１個の親イオンの推移（transition）、１個の内生ハウスキーパー（housekeeper）の推移、及び１個の内部標準の推移のマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）に基づいている。推移の各々を、２５０ｍｓ、合計サイクル時間２．３秒モニターした。１試料当たりの合計収集時間（total acquisition time）は約１分である。方法全体の概略を図２６に示す。簡潔には、本方法では、（図２７Ａ〜２７Ｆに示されるように）バイオマーカー６個の各々の強度及び内部標準（ＩＳ）の推移を測定し、また、あらかじめヒト血清中に内生的に存在することを確認した「ハウスキーピング（housekeeping）」バイオマーカーの推移も測定する（図２７Ｇ）。ハウスキーピングバイオマーカーとは、疾患状態に伴って変化しないことが確認された代謝産物であり、正しく採取された血清試料であれば検出されるはずのものである。したがって、「ハウスキーピング」バイオマーカーの目的は、複数の部位から採取した試料をＨＴＳ検査に用いることができるようにすることである。次に、各患者について、測定した６個のバイオマーカー：ＩＳの推移の比を平均正規化ｌｏｇ（２）変換したときに最も低いものを決定することで患者スコアを作成する。次いで、この値を、正常個体から作成したスコア分布と比較し、それにしたがってＣＲＣリスク要因を決める。ABI Qtrapで、上述の方法を用いて、６個のバイオマーカー各々及びハウスキーピング代謝産物について、バイオマーカーの推移対内部標準の推移のピーク面積比をプロットすることで、推移ピーク領域を正確に測定することができることを確認した（図２６）。さらに、本ＨＴＳ法は、基準血清材料の段階希釈を含み、これにより、機器の線形性が決定及び保証される。ハウスキーピング代謝産物が検出されないか又は検量線のＲ２値が０．９８を超える場合、試料のラン（run）に不備があると考えられるので、その試料を再度ランする必要がある。
本明細書に記載された分子がＣＲＣに関連しているという最初の発見を検証するために、ＣＲＣ１８６検体、正常２８８検体、前立腺癌２４検体、卵巣癌２５検体、腎細胞癌３０検体、肺癌２５検体、乳癌２０検体を含む独立した試料セットを、上述のＨＴＳ法を用いて分析した。その分析結果の概略を表１３Ａに示す。この結果は、誰をＣＲＣが存在する危険性が高いと見なすかを決定するカットオフ値を−１．３にしたとき、本方法のＣＲＣに対する感度が約７８％であることを示している（正常な分布は図２８、診断出力は図２９を参照）。この結果は、結腸癌の存在に伴うこれらの分子レベルの低下を明白に示している。しかしここで、癌横断的な比較（cross-cancer comparison）から、卵巣癌の感度が７０％であり、腎細胞癌及び肺癌の感度がそれぞれ３６％及び４０％であることも分かった。これらの感度の値は、ＣＲＣについての特異度が８９％となるカットオフ値（これは擬陽性率約５％と等しい。なぜなら、図２８に示される正常分布は結腸内視鏡により疾患がないことが未確認の個体に基づいているため）に基づいて選択された。平均から低リスクの集団の最大１０％が、内視鏡検査で高度異形成に陽性であることが以前に報告されているが、本分布ではこれらは考慮しなかった（Collins, J.F., et al., Accuracy of screening for fecal occult blood on a single stool sample obtained by digital rectal examination: a comparison with recommended sampling practice. Ann Intern Med, 2005. 142(2): p. 81-5）。非ＣＲＣ癌のセットは数が比較的少ないものの、検査結果は有意に卵巣癌と重なっていることから、卵巣癌の診断も特許請求の範囲に含まれる。最終的には、より大きな非ＣＲＣ癌集団を検査してこれらの結果を確認する必要がある。
また、正常個体及びＣＲＣ陽性個体の無作為に抽出したサブセットを用いて、年齢、人種、ＢＭＩ、及び性によるバイアスをチェックし、これら様々なクラスのいずれにおいても前記バイオマーカーレベルに有意な差が無いことを確認した（表１３Ｂ）。さらに、ＣＲＣのステージＩ／II又はIII／IV（ＴＮＭ）に分類された患者群又はポリープ有り若しくは無しに分類された患者群においてもバイアスは見られなかった（表１３Ｂ）。
引用文献
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１又は複数の実施形態に関連して本発明を記載したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更及び修正が可能であることは当業者には明白である。
Claims (66)
- 患者の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の健康状態若しくはＣＲＣの健康状態における変化の判定用データ、又は患者がＣＲＣを発症するリスク若しくは患者におけるＣＲＣの存在の判定用データを取得するための方法であって、
前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を、高分解能質量分析計で分析して精密な質量強度データを取得するステップを含み、
取得した前記精密な質量強度と対応する対照データとの差が、ＣＲＣの存在、又は発症するリスクを示し、かつ、
前記精密な質量強度が、ダルトンで、
１０２．０６２１、１８３．０６６０、１８８．０４９１、１９４．０８０２、１９５．０５３５、２０２．０４５３、２０５．８８６６、２１５．９１５４、２１６．０３９９、２１７．０６９８、２１７．９１２６、２１８．０１９３、２１８．０３６９、２２１．０７３３、２２２．０６９９、２２３．９４９１、２２４．１４１６、２２６．０６８７、２３３．０６４８、２４４．０５６０、２４４．２１８９、２４９．９６４７、２５２．０７６３、２５３．８１６５、２５５．８１３６、２５７．８１０７、２５９．９４１７、２６０．２１３６、２６２．２２９４、２６３．８４５３、２６４．２４５３、２６８．１３２０、２６９．９７０５、２７３．９５７３、２７４．１９３６、２７６．２０９３、２７７．８８６０、２７８．２２５１、２７９．２２８６、２８０．２４１２、２８１．２４４７、２８２．２５５５、２８２．２５７０、２８３．２５８９、２８３．２６００、２８３．９８６３、２８５．１３６５、２９０．０６２８、２９２．２０４０、２９３．０６７９、２９４．２２０５、２９５．２２８６、２９６．２３５９、２９７．２３８６、３００．２０９８、３０３．２２９３、３０４．２３７９、３０７．１１８５、３０８．２７１７、３１０．２１５２、３１０．２８８１、３１２．００１４、３２６．２１９７、３２６．２２６１、３２８．２３９１、３２８．２４１２、３２８．２６０４、３２９．２４４１、３２９．２６４０、３３６．２６６４、３３８．２８２３、３３９．２８５０、３３９．９９６５、３４２．２１９８、３５０．２８２８、３５２．２２９６、３５６．２９２９、３６１．１４３９、３８２．１０８１、３９２．２９３２、４０８．２５４７、４１６．３６６６、４２２．３４０４、４２６．３７１４、４２８．３６５１、４２９．３７４３、４３０．３８１７、４３１．３８５６、４４０．２７１３、４４０．２８９７、４４０．３５２９、４４４．３５９９、４４６．３４０６、４４６．３４０６、４４７．３４３３、４４７．３８４８、４４８．３５６３、４４９．３１５２、４４９．３１７１、４４９．３６１４、４５０．３７２６、４５２．２３８１、４５２．３８７６、４５９．１５８２、４６０．１６０３、４６１．１５５２、４６４．３５２２、４６４．３８７４、４６６．３６６１、４６６．４０１８、４６７．３７１８、４６７．４０５２、４６８．３５７４、４６８．３８４０、４６９．３６０８、４６９．３８６５、４７１．２９５３、４７６．３８７３、４８４．３７８６、４９０．４０２４、４９２．３８２９、４９２．４１８１、４９３．４２２０、４９４．３９７７、４９４．４３４０、４９５．３３１８、４９５．４０２２、４９５．４３７３、４９６．３３５２、４９６．４１６４、４９９．９４０１、５０２．４０５０、５０４．４１８９、５０８．４４８７、５１２．４０８６、５１７．３１３７、５１８．３１７１、５１８．３９７６、５１８．４３４３、５１９．３３１８、５１９．３３２０、５１９．４３７６、５１９．５０２１、５２０．３３５３、５２０．４１４４、５２０．４４９７、５２１．３４７６、５２１．４５２６、５２２．４３１３、５２２．４６３９、５２３．３６３３、５２３．４６７５、５２４．３６６６、５２４．４７２０、５３０．３９９７、５３３．２８８１、５３４．４６５８、５３６．４１０８、５３６．４７９９、５３７．４５０１、５３７．４８２９、５３８．４２５９、５４０．４３９７、５４０．４４０４、５４１．３１３８、５４１．３１３９、５４１．４４３２、５４２．３１７０、５４２．４７００、５４３．３２９２、５４４．４４８３、５４５．３４５１、５４６．３４８２、５５０．４６０５、５５２．３８１９、５５３．３８５３、５５５．３１０３、５５６．４４９６、５５７．４５２８、５５８．４０９３、５５８．４６５９、５５８．４６６５、５５９．４１３１、５５９．４６９５、５５９．４６９８、５６０．４７９６、５６０．４８１６、５６０．４８３１、５６１．４８６９、５６１．５９８３、５６２．４９９３、５６３．３９６０、５６３．５９５０、５６４．５１２７、５６４．５１３０、５６５．３３９１、５６５．３３９８、５６５．５１５７、５６６．３４３３、５６６．３４３７、５６６．４５５６、５６８．３５５９、５６８．４７２９、５６９．３６８４、５７０．４６４９、５７２．４８１３、５７３．４８５０、５７４．４６０７、５７４．４６３０、５７５．２７２６、５７５．４６３５、５７６．４７６６、５７６．４７７１、５７６．５１０９、５７７．４７９８、５７７．５１４２、５７８．４９０３、５７８．４９３１、５７８．５１７６、５７９．４９６３、５８０．５０９２、５８６．４９５７、５８７．３２２８、５８８．３２７３、５８８．５１１５、５８９．３３９６、５８９．５１５９、５９０．３４２６、５９０．４５９７、５９１．５３２０、５９２．３５６９、５９２．４７０１、５９２．４７１１、５９２．５４５３、５９３．４７４２、５９４．４８５１、５９４．４８７６、５９５．４８９６、５９５．４９２５、５９６．４７９６、５９６．５０２９、５９６．５０４８、５９７．４８３９、５９７．５０６８、５９７．５０７６、５９８．４９６３、５９９．５００６、６００．５１２８、６０１．５１６３、６０２．４７２０、６０２．５２８６、６０３．５３２０、６０６．４１５０、６０７．５６１６、６０９．３２４７、６１３．３４０２、６１４．３４２４、６１５．１６９３、６１５．３５４０、６１６．４６７２、６１６．５０４０、６１７．０６１４、６１８．４８３１、６２２．４９７３、６２３．５００６、６２４．５１３０、６２５．５１６５、６２６．５２８６、６３０．４８７４、６３１．４９１０、６３２．５７６１、６３５．３４００、６３８．４８８５、６４２．５１９５、６４７．６０５７、６４８．３８４６、６４８．５８６２、６４９．５８９３、６５８．５９１３、６６０．６０８３、６６１．６２２７、６７０．５７００、６７３．６１９８、６７７．５７６３、６８８．４６８８、６８９．６５２７、６９０．４８６５、６９１．１９５５、６９２．５５７１、６９３．５６００、６９４．５７３０、６９５．６４６０、７０３．５７０９、７１２．４７０４、７１６．４９８８、７２３．５２１７、７２４．５４９４、７２７．５５６３、７３１．４９１０、７３２．４９２３、７３２．５４９６、７３８．５４４５、７３９．５１５７、７４３．５４５５、７４３．５４６３、７４３．５４８３、７４４．４９６０、７４４．５５３７、７４５．４９８６、７４５．５６６３、７４６．５１３９、７４８．５７２０、７４８．５７２６、７４９．５３５８、７４９．５３５９、７４９．５４１０、７４９．５７５７、７４９．５７６７、７５０．５３９７、７５０．５４４１、７５１．５５１４、７５１．５５５４、７５２．５５７７、７５５．５４６３、７５５．５４６６、７５６．５４９８、７５７．５６１９、７５７．５６２７、７５８．５０９６、７５８．５６５４、７５８．５６５７、７５９．５１５４、７５９．５７７７、７６０．５８１１、７６１．５８４４、７６３．５１４６、７６３．５１４７、７６７．５５０１、７６７．５８３０、７６８．４９６４、７６８．５５４５、７７１．５７７８、７７１．５８０６、７７２．５２７９、７７７．５２８５、７７９．５４３９、７７９．５４４５、７８０．５４７３、７８０．５４７５、７８１．５６１９、７８２．５６５３、７８３．５７７７、７８３．５７７８、７８４．５８０９、７８４．５８１１、７８５．５９３２、７８５．５９３３、７８６．５９６５、７８６．５９６７、７８８．６１２８、７８９．５６４９、７９３．５３８３、７９３．５９８７、７９５．５１７９、７９５．５１８２、７９６．５２１３、７９７．５３３８、７９８．５３７０、７９８．６７４１、７９９．６７７６、８０１．５２８３、８０１．５５４２、８０２．５３１７、８０２．５５７６、８０３．５４４１、８０３．５４４６、８０３．５６７６、８０３．５６９２、８０４．５４７４、８０４．５４７７、８０４．５７１１、８０４．５７１７、 ８０５．５６０５、８０５．５６１６、８０５．５８２８、８０５．５８３２、８０６．５６４１、８０６．５６４８、８０６．５８６３、８０７．５７５９、８０７．５７６１、８０７．５８９３、８０８．５７９３、８０８．５７９４、８０９．５９３４、８１０．５９６７、８１２．６１２４、８１７．５０１１、８１７．５８２７、８１９．５１７９、８１９．５６２８、８２０．５２１３、８２１．５３３７、８２２．５３７０、８２３．５４９４、８２４．５５２８、８２４．６８９１、８２５．５５３３、８２５．６９２６、８２６．５５６９、８２６．７０４７、８２７．５４４２、８２７．５４５０、８２７．５６８４、８２７．７０８７、８２８．５４７５、８２８．５７２６、８２９．５５９９、８２９．５６０４、８２９．５８４６、８２９．５８６０、８３０．５６３２、８３０．５８８３、８３０．５８９０、８３０．７３６８、８３１．５５３６、８３１．５７６２、８３１．５９９１、８３１．７４０６、８３２．５７８８、８３２．５７９７、８３２．６０２６、８３２．６０２８、８３２．７５２８、８３３．５９２７、８３３．７５６７、８３４．５９６１、８４２．７３８６、８４３．５１８０、８４４．５２１４、８４５．５３４１、８４７．５４９８、８４７．５９３７、８５０．７０４９、８５１．７０９８、８５２．７２０６、８５３．５５９９、８５３．５８４５、８５３．７２４１、８５４．５８８５、８５４．７３５６、８５４．７３７３、８５５．５７５６、８５５．６００４、８５５．７３９４、８５６．５７８８、８５６．６０４５、８５８．６２０２、８５８．６８５２、８５８．７６６０、８５８．７６７８、８５９．７７０８、８５９．７７１８、８６０．７７５６、８６８．７５３２、８７０．７６９４、８７４．７０６２、８７４．８４７７、８７６．７２２８、８７７．５８１５、８７７．７２６６、８７８．７３８４、８７９．７４２１、８８０．７５３５、８８１．７５７３、８８２．７６８４、８８３．７７２７、９１５．５１９３ 及び９３９．５１９３からなる群から選択される値で測定されるか、又は前記群から選択される値を±５ｐｐｍの水素及び電子で調整した精密な質量、即ち精密な中性質量で測定される
方法。 - 患者の結腸直腸癌（ＣＲＣ）を治療するための治療法の有効性の判定用データを取得するための方法であって、
前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を、高分解能質量分析計で分析して精密な質量強度データを取得するステップを含み、
取得した前記精密な質量強度と対応する対照データとの差が、前記治療法が前記患者の生化学的状態を改善しているかどうかを示し、かつ、
前記精密な質量強度が、ダルトンで、
１０２．０６２１、１８３．０６６０、１８８．０４９１、１９４．０８０２、１９５．０５３５、２０２．０４５３、２０５．８８６６、２１５．９１５４、２１６．０３９９、２１７．０６９８、２１７．９１２６、２１８．０１９３、２１８．０３６９、２２１．０７３３、２２２．０６９９、２２３．９４９１、２２４．１４１６、２２６．０６８７、２３３．０６４８、２４４．０５６０、２４４．２１８９、２４９．９６４７、２５２．０７６３、２５３．８１６５、２５５．８１３６、２５７．８１０７、２５９．９４１７、２６０．２１３６、２６２．２２９４、２６３．８４５３、２６４．２４５３、２６８．１３２０、２６９．９７０５、２７３．９５７３、２７４．１９３６、２７６．２０９３、２７７．８８６０、２７８．２２５１、２７９．２２８６、２８０．２４１２、２８１．２４４７、２８２．２５５５、２８２．２５７０、２８３．２５８９、２８３．２６００、２８３．９８６３、２８５．１３６５、２９０．０６２８、２９２．２０４０、２９３．０６７９、２９４．２２０５、２９５．２２８６、２９６．２３５９、２９７．２３８６、３００．２０９８、３０３．２２９３、３０４．２３７９、３０７．１１８５、３０８．２７１７、３１０．２１５２、３１０．２８８１、３１２．００１４、３２６．２１９７、３２６．２２６１、３２８．２３９１、３２８．２４１２、３２８．２６０４、３２９．２４４１、３２９．２６４０、３３６．２６６４、３３８．２８２３、３３９．２８５０、３３９．９９６５、３４２．２１９８、３５０．２８２８、３５２．２２９６、３５６．２９２９、３６１．１４３９、３８２．１０８１、３９２．２９３２、４０８．２５４７、４１６．３６６６、４２２．３４０４、４２６．３７１４、４２８．３６５１、４２９．３７４３、４３０．３８１７、４３１．３８５６、４４０．２７１３、４４０．２８９７、４４０．３５２９、４４４．３５９９、４４６．３４０６、４４６．３４０６、４４７．３４３３、４４７．３８４８、４４８．３５６３、４４９．３１５２、４４９．３１７１、４４９．３６１４、４５０．３７２６、４５２．２３８１、４５２．３８７６、４５９．１５８２、４６０．１６０３、４６１．１５５２、４６４．３５２２、４６４．３８７４、４６６．３６６１、４６６．４０１８、４６７．３７１８、４６７．４０５２、４６８．３５７４、４６８．３８４０、４６９．３６０８、４６９．３８６５、４７１．２９５３、４７６．３８７３、４８４．３７８６、４９０．４０２４、４９２．３８２９、４９２．４１８１、４９３．４２２０、４９４．３９７７、４９４．４３４０、４９５．３３１８、４９５．４０２２、４９５．４３７３、４９６．３３５２、４９６．４１６４、４９９．９４０１、５０２．４０５０、５０４．４１８９、５０８．４４８７、５１２．４０８６、５１７．３１３７、５１８．３１７１、５１８．３９７６、５１８．４３４３、５１９．３３１８、５１９．３３２０、５１９．４３７６、５１９．５０２１、５２０．３３５３、５２０．４１４４、５２０．４４９７、５２１．３４７６、５２１．４５２６、５２２．４３１３、５２２．４６３９、５２３．３６３３、５２３．４６７５、５２４．３６６６、５２４．４７２０、５３０．３９９７、５３３．２８８１、５３４．４６５８、５３６．４１０８、５３６．４７９９、５３７．４５０１、５３７．４８２９、５３８．４２５９、５４０．４３９７、５４０．４４０４、５４１．３１３８、５４１．３１３９、５４１．４４３２、５４２．３１７０、５４２．４７００、５４３．３２９２、５４４．４４８３、５４５．３４５１、５４６．３４８２、５５０．４６０５、５５２．３８１９、５５３．３８５３、５５５．３１０３、５５６．４４９６、５５７．４５２８、５５８．４０９３、５５８．４６５９、５５８．４６６５、５５９．４１３１、５５９．４６９５、５５９．４６９８、５６０．４７９６、５６０．４８１６、５６０．４８３１、５６１．４８６９、５６１．５９８３、５６２．４９９３、５６３．３９６０、５６３．５９５０、５６４．５１２７、５６４．５１３０、５６５．３３９１、５６５．３３９８、５６５．５１５７、５６６．３４３３、５６６．３４３７、５６６．４５５６、５６８．３５５９、５６８．４７２９、５６９．３６８４、５７０．４６４９、５７２．４８１３、５７３．４８５０、５７４．４６０７、５７４．４６３０、５７５．２７２６、５７５．４６３５、５７６．４７６６、５７６．４７７１、５７６．５１０９、５７７．４７９８、５７７．５１４２、５７８．４９０３、５７８．４９３１、５７８．５１７６、５７９．４９６３、５８０．５０９２、５８６．４９５７、５８７．３２２８、５８８．３２７３、５８８．５１１５、５８９．３３９６、５８９．５１５９、５９０．３４２６、５９０．４５９７、５９１．５３２０、５９２．３５６９、５９２．４７０１、５９２．４７１１、５９２．５４５３、５９３．４７４２、５９４．４８５１、５９４．４８７６、５９５．４８９６、５９５．４９２５、５９６．４７９６、５９６．５０２９、５９６．５０４８、５９７．４８３９、５９７．５０６８、５９７．５０７６、５９８．４９６３、５９９．５００６、６００．５１２８、６０１．５１６３、６０２．４７２０、６０２．５２８６、６０３．５３２０、６０６．４１５０、６０７．５６１６、６０９．３２４７、６１３．３４０２、６１４．３４２４、６１５．１６９３、６１５．３５４０、６１６．４６７２、６１６．５０４０、６１７．０６１４、６１８．４８３１、６２２．４９７３、６２３．５００６、６２４．５１３０、６２５．５１６５、６２６．５２８６、６３０．４８７４、６３１．４９１０、６３２．５７６１、６３５．３４００、６３８．４８８５、６４２．５１９５、６４７．６０５７、６４８．３８４６、６４８．５８６２、６４９．５８９３、６５８．５９１３、６６０．６０８３、６６１．６２２７、６７０．５７００、６７３．６１９８、６７７．５７６３、６８８．４６８８、６８９．６５２７、６９０．４８６５、６９１．１９５５、６９２．５５７１、６９３．５６００、６９４．５７３０、６９５．６４６０、７０３．５７０９、７１２．４７０４、７１６．４９８８、７２３．５２１７、７２４．５４９４、７２７．５５６３、７３１．４９１０、７３２．４９２３、７３２．５４９６、７３８．５４４５、７３９．５１５７、７４３．５４５５、７４３．５４６３、７４３．５４８３、７４４．４９６０、７４４．５５３７、７４５．４９８６、７４５．５６６３、７４６．５１３９、７４８．５７２０、７４８．５７２６、７４９．５３５８、７４９．５３５９、７４９．５４１０、７４９．５７５７、７４９．５７６７、７５０．５３９７、７５０．５４４１、７５１．５５１４、７５１．５５５４、７５２．５５７７、７５５．５４６３、７５５．５４６６、７５６．５４９８、７５７．５６１９、７５７．５６２７、７５８．５０９６、７５８．５６５４、７５８．５６５７、７５９．５１５４、７５９．５７７７、７６０．５８１１、７６１．５８４４、７６３．５１４６、７６３．５１４７、７６７．５５０１、７６７．５８３０、７６８．４９６４、７６８．５５４５、７７１．５７７８、７７１．５８０６、７７２．５２７９、７７７．５２８５、７７９．５４３９、７７９．５４４５、７８０．５４７３、７８０．５４７５、７８１．５６１９、７８２．５６５３、７８３．５７７７、７８３．５７７８、７８４．５８０９、７８４．５８１１、７８５．５９３２、７８５．５９３３、７８６．５９６５、７８６．５９６７、７８８．６１２８、７８９．５６４９、７９３．５３８３、７９３．５９８７、７９５．５１７９、７９５．５１８２、７９６．５２１３、７９７．５３３８、７９８．５３７０、７９８．６７４１、７９９．６７７６、８０１．５２８３、８０１．５５４２、８０２．５３１７、８０２．５５７６、８０３．５４４１、８０３．５４４６、８０３．５６７６、８０３．５６９２、８０４．５４７４、８０４．５４７７、８０４．５７１１、８０４．５７１７、 ８０５．５６０５、８０５．５６１６、８０５．５８２８、８０５．５８３２、８０６．５６４１、８０６．５６４８、８０６．５８６３、８０７．５７５９、８０７．５７６１、８０７．５８９３、８０８．５７９３、８０８．５７９４、８０９．５９３４、８１０．５９６７、８１２．６１２４、８１７．５０１１、８１７．５８２７、８１９．５１７９、８１９．５６２８、８２０．５２１３、８２１．５３３７、８２２．５３７０、８２３．５４９４、８２４．５５２８、８２４．６８９１、８２５．５５３３、８２５．６９２６、８２６．５５６９、８２６．７０４７、８２７．５４４２、８２７．５４５０、８２７．５６８４、８２７．７０８７、８２８．５４７５、８２８．５７２６、８２９．５５９９、８２９．５６０４、８２９．５８４６、８２９．５８６０、８３０．５６３２、８３０．５８８３、８３０．５８９０、８３０．７３６８、８３１．５５３６、８３１．５７６２、８３１．５９９１、８３１．７４０６、８３２．５７８８、８３２．５７９７、８３２．６０２６、８３２．６０２８、８３２．７５２８、８３３．５９２７、８３３．７５６７、８３４．５９６１、８４２．７３８６、８４３．５１８０、８４４．５２１４、８４５．５３４１、８４７．５４９８、８４７．５９３７、８５０．７０４９、８５１．７０９８、８５２．７２０６、８５３．５５９９、８５３．５８４５、８５３．７２４１、８５４．５８８５、８５４．７３５６、８５４．７３７３、８５５．５７５６、８５５．６００４、８５５．７３９４、８５６．５７８８、８５６．６０４５、８５８．６２０２、８５８．６８５２、８５８．７６６０、８５８．７６７８、８５９．７７０８、８５９．７７１８、８６０．７７５６、８６８．７５３２、８７０．７６９４、８７４．７０６２、８７４．８４７７、８７６．７２２８、８７７．５８１５、８７７．７２６６、８７８．７３８４、８７９．７４２１、８８０．７５３５、８８１．７５７３、８８２．７６８４、８８３．７７２７、９１５．５１９３ 及び９３９．５１９３からなる群から選択される値で測定されるか、又は前記群から選択される値を±５ｐｐｍの水素及び電子で調整した精密な質量、即ち精密な中性質量で測定される
方法。 - 精密な質量強度データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、飛行時間型、磁場型、四重極型、又は三連四重極型質量分析計を用いて得られる、請求項１又は２記載の方法。
- 血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 精密な質量強度が、イオン化された代謝産物を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 血液試料について液／液抽出法を実施することにより、非極性代謝産物を有機溶媒中に溶解させ、極性代謝産物を水性溶媒中に溶解させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 精密な質量強度が、正エレクトロスプレーイオン化法、負エレクトロスプレーイオン化法、正大気圧化学イオン化法、負大気圧化学イオン化法、及びそれらの組合せからなる群から選択されるイオン化法を用いた、抽出試料のイオン化により得られる、請求項６に記載の方法。
- 対応する対照データが、１又は２以上のＣＲＣ陰性のヒト由来の１又は２以上の対照血液試料から得られる、請求項１に記載の方法。
- 対応する対照データが、治療前に患者から得た１又は２以上の血液試料から得られる、請求項２に記載の方法。
- 患者由来の少なくとも１つの血液試料を質量分析法により分析して、１又は２以上の内部標準分子について、精密な質量強度データを得るステップと、
前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析することにより得られた精密な質量強度の各々について、前記１又は２以上の内部標準分子について得られた前記精密な質量強度に対する比率を算出するステップとをさらに含み、
前記算出した比率と、１又は２以上の対照血液試料について得られた１又は２以上の対応する比率との間に差がある、
請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 精密な質量強度の低下が確認される、請求項１又は２に記載の方法。
- 精密な質量強度の増加が確認される、請求項２に記載の方法。
- 水素及び電子で調整した精密な質量、即ち精密な中性質量が、４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、５３８．４２５９、５９２．４７１１及び５９４．４８５１からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
- 患者の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の健康状態若しくはＣＲＣの健康状態における変化の判定用データ、又は患者がＣＲＣを発症するリスク若しくは患者におけるＣＲＣの存在の判定用データを取得するための方法であって、
前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについて定量用データを取得するステップを含み、
取得した前記定量用データと対応する対照データとの差が、ＣＲＣの存在、又は発症するリスクを示し、かつ、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６及びＣ３６Ｈ６６Ｏ６からなる分子式から選択される１又は２以上の分子を含む方法。 - 患者の結腸直腸癌（ＣＲＣ）を治療するための治療法の有効性の判定用データを取得するための方法であって、
前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについて定量用データを取得するステップを含み、
取得した前記定量用データと対応する対照データとの差が、前記治療法が前記患者の生化学的状態を改善しているかどうかを示し、かつ、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６、Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６及びＣ３６Ｈ６６Ｏ６からなる分子式から選択される１又は２以上の分子を含む方法。 - 定量用データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、飛行時間型、磁場型、四重極型、又は三連四重極型質量分析計を用いて得られる、請求項１４又は１５に記載の方法。
- 質量分析計が、クロマトグラフィーシステムを備える、請求項１６に記載の方法。
- 血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
- 血液試料について液／液抽出法を実施することにより、非極性代謝産物を有機溶媒中に溶解させ、極性代謝産物を水性溶媒中に溶解させる、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
- 抽出試料が、正エレクトロスプレーイオン化法、負エレクトロスプレーイオン化法、正大気圧化学イオン化法、負大気圧化学イオン化法、又はそれらの組合せにより分析される、請求項１９に記載の方法。
- 抽出試料が、ＭＳ／ＭＳ推移により分析される、請求項１９又は２０に記載の方法。
- 抽出試料が、抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）及びＭＳ／ＭＳ推移によって分析される、請求項１９又は２０に記載の方法。
- 対応する対照データが、１又は２以上のＣＲＣ陰性のヒト由来の１又は２以上の対照血液試料から得られる、請求項１４に記載の方法。
- 対応する対照データが、治療前に患者から得た１又は２以上の血液試料から得られる、請求項１５に記載の方法。
- 患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の内部標準分子について、定量用データを得るステップと、
１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの各々について、１又は２以上の内部標準分子について得られたレベルに対する比率を算出するステップとをさらに含み、
前記算出した比率と、１又は２以上の対照血液試料について得られた１又は２以上の対応する比率との間に差がある、
請求項１４〜２４のいずれかに記載の方法。 - 血液試料中の１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの低下が確認される、請求項１４に記載の方法。
- 血液試料中の１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの増大が確認される、請求項１５に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４５．４／３８３．４、４４５．４／４２７．４、４４５．４／４０１．４、４４５．４／２２３．２、４４５．４／２０５．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４７．４／３８５．４、４４７．４／４２９．４、４４７．４／４０３．４、４４７．４／２７９．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４９．４／４０５．４、４４９．４／４３１．４、４４９．４／４１７．３、４４９．４／３８７．４、４４９．４／３７１．３、４４９．４／２８１．３、４４９．４／２７７．３、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５の分子式を有する代謝産物について、４６３．４／４１９．４、４６３．４／４４５．３、４６３．４／４０１．３、４６３．４／３８３．３、４６３．４／３１５．３、４６３．４／２９７．３、４６３．４／２４１．２、４６３．４／２２３．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５の分子式を有する代謝産物のＭＳ／ＭＳ推移が、４６５．４／４０３．４である、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５の分子式を有する代謝産物について、４６７．４／４２３．４、４６７．４／４４９．４、４６７．４／４８１．４、４６７．４／４０５．４、４６７．４／３８９．４、４６７．４／２９７．３、４６７．４／２７９．３、４６７．４／２６３．３、４６７．４／２１５．２、４６７．４／１８７．１６、４６７．４／１６９．２、４６７．４／１４１．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ３２Ｈ５８Ｏ６の分子式を有する代謝産物について、５３７．５／５１９．５、５３７．５／５０１．５、５３７．５／４９１．４、５３７．５／４５７．５、５３７．５／４５９．４、５３７．５／３１５．３、５３７．５／２９７．３、５３７．５／２８５．１、５３７．５／２３９．２、５３７．５／２３７．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ３６Ｈ６４Ｏ６の分子式を有する代謝産物について、５９１．５／５７３．５、５９１．５／５５９．５、５９１．５／５５５．５、５９１．５／５２７．４、５９１．５／４１５．４、５９１．５／３１３．３、５９１．５／２９７．３、５９１．５／２９５．３、５９１．５／１７５．１、５９１．５／１４９．１、５９１．５／１１３．０、５９１．５／１１５．０、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- Ｃ３６Ｈ６６Ｏ６の分子式を有する代謝産物について、５９３．６／５７５．６、５９３．６／５５７．５、５９３．６／５４９．５、５９３．６／５３１．５、 ５９３．６／５２９．４、５９３．６／５１５．４、５９３．６／３１５．３、５９３．６／３１３．３、５９３．６／２９７．３、５９３．６／２７７．３、５９３．６／２１５．１、５９３．６／２０１．１、５９３．６／１７１．１、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項２１又は２２に記載の方法。
- 疾患状態が未知の被検者について、卵巣癌の健康状態又は卵巣癌の健康状態における変化の判定用データ、或いは卵巣癌を発症するリスクの判定用データを取得するための方法であって、
前記被検者由来の少なくとも１つの血液試料を、高分解能質量分析計で分析して精密な質量強度データを取得するステップを含み、
取得した前記精密な質量強度データと対応する対照データとの差が、前記被検者における卵巣癌の存在、又は発症するリスクを示し、かつ、
前記精密な質量強度が、ダルトンで、４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０、及びその組合せからなる群から選択される値で測定されるか、又は前記群から選択される値を±５ｐｐｍの水素及び電子で調整した精密な質量、即ち精密な中性質量で測定され、かつ、
前記対応する対照データが、卵巣癌に罹患している複数の癌陽性のヒト由来、又は複数の癌陰性のヒト由来である方法。 - 対象の卵巣癌を治療するための治療法の有効性の判定用データを取得するための方法であって、
前記対象由来の少なくとも１つの血液試料を高分解能質量分析計で分析して精密な質量強度データを取得するステップを含み、
取得した前記精密な質量強度データと対応する対照データとの差が、前記治療法が前記対象の生化学的状態を改善しているかどうかを示し、かつ、
前記精密な質量強度が、ダルトンで、４４６．３４０６、４４８．３５６３、４５０．３７２６、４６４．３５２２、４６６．３６６１、４６８．３８４０及びその組合せからなる群から選択される値で測定されるか、又は前記群から選択される値を±５ｐｐｍの水素及び電子で調整した精密な質量、即ち精密な中性質量で測定される方法。 - 精密な質量強度データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、飛行時間型、磁場型、四重極型、又は三連四重極型質量分析計を用いて得られる、請求項３７又は３８に記載の方法。
- 血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法。
- 精密な質量強度が、イオン化された代謝産物を示す、請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。
- 血液試料について液／液抽出法を実施することにより、非極性代謝産物を有機溶媒中に溶解させ、極性代謝産物を水性溶媒中に溶解させる、請求項３７〜４１のいずれかに記載の方法。
- 精密な質量強度が、正エレクトロスプレーイオン化法、負エレクトロスプレーイオン化法、正大気圧化学イオン化法、負大気圧化学イオン化法、及びそれらの組合せからなる群から選択されるイオン化法を用いた、抽出試料のイオン化により得られる、請求項４２に記載の方法。
- 対象由来の少なくとも１つの血液試料を質量分析法により分析して、１又は２以上の内部標準分子について、精密な質量強度データを得るステップと、
前記対象由来の少なくとも１つの血液試料を分析することにより得られた精密な質量強度の各々について、前記１又は２以上の内部標準分子について得られた精密な質量強度に対する比率を算出するステップとをさらに含み、
前記算出した比率と、１又は２以上の対照血液試料について得られた１又は２以上の対応する比率との間に差がある、
請求項３７〜４３のいずれかに記載の方法。 - 精密な質量強度の低下が確認される、請求項３７又は３８に記載の方法。
- 対応する対照データが、治療前に対象から得た１又は２以上の血液試料から得られる、請求項３８に記載の方法。
- 精密な質量強度の増大が確認される、請求項３８に記載の方法。
- 疾患状態が未知の被検者について、卵巣癌の健康状態、又は卵巣癌の健康状態における変化の判定用データ、或いは卵巣癌を発症するリスクの判定用データを取得するための方法であって、
前記被検者由来の血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについて定量用データを取得するステップを含み、
前記定量用データと対応する対照データとの差が、前記被検者における卵巣癌の存在又は発症するリスクを示し、かつ、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５、及びそれらの組合せからなる分子式から選択される１又は２以上の分子を含み、
前記対応する対照データが、卵巣癌に罹患している複数の癌陽性のヒト由来、又は複数の癌陰性のヒト由来である方法。 - 対象の卵巣癌を治療するための治療法の有効性の判定用データを取得するための方法であって、
前記対象由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は２以上の代謝産物マーカーについて定量用データを取得するステップを含み、
取得した前記定量用データと対応する対照データとの差が、前記治療法が前記対象の生化学的状態を改善しているかどうかを示し、かつ、
前記１又は２以上の代謝産物マーカーが、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５、Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５及びそれらの組合せからなる分子式から選択される１又は２以上の分子を含む方法。 - 定量用データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、飛行時間型、磁場型、四重極型、又は三連四重極型質量分析計を用いて得られる、請求項４８又は４９に記載の方法。
- 質量分析計が、クロマトグラフィーシステムを備える、請求項５０に記載の方法。
- 血液試料が、全血試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
- 血液試料について液／液抽出法を実施することにより、非極性代謝産物を有機溶媒中に溶解させ、極性代謝産物を水性溶媒中に溶解させる、請求項４８〜５２のいずれかに記載の方法。
- 抽出試料が、正エレクトロスプレーイオン化法、負エレクトロスプレーイオン化法、正大気圧化学イオン化法、負大気圧化学イオン化法、又はそれらの組合せにより分析される、請求項５３に記載の方法。
- 抽出試料が、ＭＳ／ＭＳ推移により分析される、請求項５４に記載の方法。
- 抽出試料が、抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）及びＭＳ／ＭＳ推移により分析される、請求項５４に記載の方法。
- 対象由来の少なくとも１つの血液試料を分析して１又は２以上の内部標準分子について定量用データを得るステップと、
１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの各々について、前記１又は２以上の内部標準分子について得られたレベルに対する比率を算出するステップとをさらに含み、
前記算出した比率と、１又は２以上の対照血液試料について得られた１又は２以上の対応する比率との間に差がある、
請求項４８〜５６のいずれかに記載の方法。 - 血液試料における１又は２以上の代謝産物のレベルの低下が確認される、請求項４８に記載の方法。
- 対応する対照データが、治療前に対象から得た１又は２以上の血液試料から得られる、請求項４９に記載の方法。
- 血液試料における１又は２以上の代謝産物マーカーのレベルの増大が確認される、請求項４９に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４５．４／３８３．４、４４５．４／４２７．４、４４５．４／４０１．４、４４５．４／２２３．２、４４５．４／２０５．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項５５又は５６に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４７．４／３８５．４、４４７．４／４２９．４、４４７．４／４０３．４、４４７．４／２７９．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項５５又は５６に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５０Ｏ４の分子式を有する代謝産物について、４４９．４／４０５．４、４４９．４／４３１．４、４４９．４／４１７．３、４４９．４／３８７．４、４４９．４／３７１．３、４４９．４／２８１．３、４４９．４／２７７．３、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項５５又は５６に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５の分子式を有する代謝産物について、４６３．４／４１９．４、４６３．４／４４５．３、４６３．４／４０１．３、４６３．４／３８３．３、４６３．４／３１５．３、４６３．４／２９７．３、４６３．４／２４１．２、４６３．４／２２３．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項５５又は５６に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５０Ｏ５の分子式を有する代謝産物のＭＳ／ＭＳ推移が、４６５．４／４０３．４である、請求項５５又は５６に記載の方法。
- Ｃ２８Ｈ５２Ｏ５の分子式を有する代謝産物について、４６７．４／４２３．４、４６７．４／４４９．４、４６７．４／４８１．４、４６７．４／４０５．４、４６７．４／３８９．４、４６７．４／２９７．３、４６７．４／２７９．３、４６７．４／２６３．３、４６７．４／２１５．２、４６７．４／１８７．１６、４６７．４／１６９．２、４６７．４／１４１．２、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ推移が確認される、請求項５５又は５６に記載の方法。
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