WO2024048514A1 - 子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法 - Google Patents

子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法 Download PDF

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WO2024048514A1
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vivo metabolites
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多久磨 藤井
理絵 川崎
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学校法人藤田学園
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    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia. Furthermore, the present invention relates to a biomarker for testing for cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia, and a kit for testing for cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • the number of cases of cervical cancer in Japan is approximately 8,000 to 10,000 per year, with a slight increasing trend.
  • the incidence of cervical cancer is also related to reproductive age. Approximately 3,000 people die from cervical cancer, and the mortality rate from cervical cancer tends to increase with age. It is the second most common cancer in the world after breast cancer. Japan is the only country among developed countries where the number of patients suffering from cervical cancer is increasing. It is thought that the current medical system for cervical cancer is not functioning well.
  • Non-Patent Documents 1 to 8 show that in-vivo metabolites in specimens collected from cervical cancer patient groups or human papilloma virus positive groups were subjected to mass spectrometry.
  • Non-Patent Document 1 shows that glutathione and oxidized glutathione were decreased in a human papillomavirus positive group compared to a human papillomavirus negative group.
  • Non-Patent Document 2 describes the relationship between human papillomavirus and glutathione.
  • Non-Patent Document 3 metabolome analysis was performed using plasma from cervical cancer patients, and bilibin, lysophosphatidylcholine (17:0), n-oleoylthreonine, 12-hydroxydodecanoic acid, and tetracosahexaenoic acid were found to be It has been described that it can be a biomarker for cervical cancer.
  • Non-Patent Document 4 describes the metabolic activity of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) and the survival rate of cervical cancer by mass spectrometry of in-vivo metabolites in the serum of cervical cancer patients.
  • IDO indoleamine-2,3-dioxygenase
  • the relationship between Non-Patent Document 5 discloses that metabolomics profiling was performed in plasma of cervical cancer patients.
  • Non-Patent Document 6 discloses that in-vivo metabolites in the urine of cervical cancer patients were subjected to mass spectrometry.
  • Non-Patent Document 7 discloses that in-vivo metabolites of cervical cancer patient's cervix wash fluid were subjected to mass spectrometry analysis.
  • Non-Patent Document 8 discloses that in-vivo metabolites in tumor tissue of cervical cancer patients were analyzed using high-performance liquid chromatography, and the expression level of mRNA was further analyzed.
  • previous reports do not indicate that comprehensive metabolome analysis was performed using mucus derived from the cervix or vagina of subjects. Furthermore, there is no indication that biomarkers specific to cervical cancer or cervical intraepithelial neoplasia were detected.
  • an object of the present invention is to provide a method for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia with higher accuracy. Furthermore, it is an object of the present invention to provide useful biomarkers for cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • the present inventors conducted extensive research and found that in vivo metabolites were measured from test samples containing mucus derived from the cervix or vagina collected from subjects. The inventors have discovered that by doing so, it is possible to test for cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia, and have completed the present invention.
  • biomarkers in test samples containing these mucus kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, xanthine, ophthalmic acid, 3- They discovered hydroxybutyric acid, fumaric acid, succinic acid, 4-hydroxybutyric acid, cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid, and completed the present invention.
  • the present invention consists of the following. 1. Cervical cancer and/or cervical epithelium, comprising a step of measuring in-vivo metabolites from a test sample containing cervical or vaginal mucus collected from a subject. How to test for internal tumors. 2.
  • In-vivo metabolites include Kynurenine, Oxidized glutathione, Malic acid, 2-Hydroxybutyric acid, Niacinamide, Adenylosuccinic acid, Adenylic acid, Citric acid, Xanthine, Ophthalmic acid, 3-Hydroxybutyric acid, Fumaric acid, Succinic acid , 4-Hydroxybutyric acid, Cystine, Threonine, Serine, Citrulline, and Lactic acid.
  • a method for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia according to item 1 above. 3.
  • the method for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia which includes any of the following steps 1) to 8) and tests for cervical cancer: 1) Measuring at least one selected from kynurenine, oxidized glutathione, and malic acid among in-vivo metabolites; 2) Measuring kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, and niacinamide among in-vivo metabolites; 3) Measuring kynurenine, malic acid and 2-hydroxybutyric acid among in vivo metabolites; 4) Measuring oxidized glutathione and 2-hydroxybutyric acid among in-vivo metabolites; 5) Measuring oxidized glutathione, niacinamide, and 2-hydroxybutyric acid among in-vivo metabolites; 6) Measuring kynurenine, malic acid, adenylosuccinic acid
  • the predicted probabilities calculated from the peak area values by mass spectra or the peak area values by mass spectra of kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, and niacinamide are lower than the cutoff value.
  • in-vivo metabolites when the predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or mass spectrum peak area value of kynurenine, malic acid, and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 5) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of oxidized glutathione and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 6) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of oxidized glutathione, niacinamide, and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 7) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of kynurenine, malic acid, adenylosuccinic acid, and cystine is higher than the cutoff value; 8) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability
  • the predicted probability calculated from the peak area value or peak area value based on the mass spectrum of kynurenine, oxidized glutathione, and cystine is higher than the cutoff value. 5.
  • the cervix is detected. The method for examining cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia according to the preceding clause 2, which determines that 6.
  • the ratio of the predicted probability calculated from the peak area value of the mass spectrum of oxidized glutathione and reduced glutathione or the peak area value of the mass spectrum is lower than the cutoff value.
  • cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia are detected.
  • the cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia is determined to be CIN3 + , and the cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia described in the preceding paragraph 2 inspection method; 1) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, 2-hydroxybutyric acid, xanthine, and cystine is higher than the cutoff value; 2) Among in-vivo metabolites, the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, 2-hydroxybutyric acid, adenylic acid, xanthine, and cystine is higher than the cutoff value.
  • How to test for tumors 1) Measuring at least one in-vivo metabolite selected from malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, adenylic acid, and 4-hydroxybutyric acid; 2) Measuring malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and 4-hydroxybutyric acid among in-vivo metabolites; 3) Measuring malic acid, xanthine and 4-hydroxybutyric acid among in vivo metabolites; 4) Measuring malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, and serine among in-vivo metabolites; 5) A step of measuring malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, threonine, and serine among in-
  • cervical intraepithelial neoplasia determined to be CIN3 in any of the following cases 1) to 5): 1) Calculated from the mass spectrum peak area value or the mass spectrum peak area value of at least one selected from malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, adenylic acid, and 4-hydroxybutyric acid among in-vivo metabolites.
  • the predicted probability is higher than the cutoff value.
  • the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and 4-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value.
  • Cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia according to the preceding paragraph 2, which includes any of the steps 1) to 4) below, and is characterized by examining CIN2 among cervical intraepithelial neoplasia.
  • cervical intraepithelial neoplasia determined to be CIN2 in any of the following cases 1) to 4): 1) Predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or mass spectrum peak area value of at least one selected from malic acid, 3-hydroxybutyric acid, xanthine, succinic acid, and fumaric acid among in vivo metabolites. is higher than the cutoff value; 2) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or mass spectrum peak area value of malic acid and xanthine or malic acid and 3-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value.
  • Cervical cancer and/or cervical intraepithelial tumor according to the preceding paragraph 2, which includes any of the steps 1) to 5) below, and is characterized by examining CIN1 among cervical intraepithelial neoplasia.
  • cervical intraepithelial neoplasia determined to be CIN1 in any of the following cases 1) to 5): 1) Predicted probability calculated from the peak area value of at least one mass spectrum or peak area value of mass spectrum selected from malic acid, adenylosuccinic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and fumaric acid among in-vivo metabolites.
  • in-vivo metabolites when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, xanthine, and 3-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 3) When the predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or the mass spectrum peak area value of malic acid and fumaric acid among in-vivo metabolites is higher than the cutoff value; 4) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of adenylic acid, xanthine, fumaric acid, and lactic acid is higher than the cutoff value; 5) Among the in-vivo metabolites, the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of adenylic acid, xanthine, and lactic acid is higher than the cutoff value.
  • Cervical cancer and/or cervical epithelium comprising the step of measuring in-vivo metabolites from a test sample containing cervical or vaginal mucus collected from a subject. A method to assist in the examination of internal tumors.
  • 20. A biomarker for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia consisting of in vivo metabolites,
  • the in-vivo metabolites include kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, xanthine, ophthalmic acid, 3-hydroxybutyric acid, fumaric acid, succinic acid, 4- A biomarker that is at least one selected from the group consisting of hydroxybutyric acid, cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid.
  • Kit for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia comprising a reagent for measuring at least one selected from the group consisting of type glutathione, cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid. 22.
  • Nomogram for the examination of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia including (a) to (d): (a) Scale row of peak area values of each mass spectrum of in-vivo metabolites; (b) A scale row of points corresponding to (a); (c) A scale column of points summing each point in (b); and (d) A scale column of predicted probabilities of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • a method for testing cervical cancer with higher accuracy can be provided, and furthermore, it is possible to test not only cervical cancer but also cervical intraepithelial neoplasia. Further, according to the present invention, it is possible to determine cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia, and to determine an appropriate treatment strategy.
  • Example 1 The data used to calculate the peak area value of niacinamide is shown.
  • Example 1 The ROC curve of the ratio of peak area values obtained by mass spectra of kynurenine and tryptophan is shown. (Example 1).
  • Figure 4 shows the nomogram of the Normal group versus the SCC group.
  • Figure 5 shows the nomogram of the CIN3 group versus the SCC group.
  • Figure 6 shows the nomogram of the Normal group versus the CIN3 + group.
  • Figure 7 shows the nomogram of the Normal group versus the CIN3 group.
  • Figure 8 shows the nomogram of the Normal group versus the CIN2 + group.
  • the present invention is characterized in that it includes a step of measuring in-vivo metabolites from a test sample containing mucus derived from the cervix or vagina collected from a subject. Concerning methods for testing cervical intraepithelial neoplasia.
  • Cervical cancer is classified into squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. Most squamous cell carcinomas of the uterine cervix are thought to develop through cervical intraepithelial neoplasia. It is important to also check.
  • the "cervical cancer" to be tested in the present invention is preferably squamous cell carcinoma (SCC).
  • Cervical intraepithelial neoplasia which is the subject of this invention, is a pre-stage of cervical cancer, and depending on the degree of the lesion, it can be classified as mild dysplasia (cervical intraepithelial neoplasia 1: CIN1) or moderate dysplasia (cervical intraepithelial neoplasia 1: CIN1). There are three types: neoplasia 2 (CIN2), high-grade dysplasia, and carcinoma in situ (cervical intraepithelial neoplasia 3: CIN3).
  • the "cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia” to be tested in the present invention includes CIN1, CIN2, CIN2 + , CIN3, CIN3 + , cervical cancer, and the like.
  • CIN2 + indicates a lesion of CIN2 or higher, and refers to CIN2, CIN3, and squamous cell carcinoma of the cervix (hereinafter sometimes referred to as SCC).
  • SCC squamous cell carcinoma of the cervix
  • CIN3 + indicates a lesion of CIN3 or higher, and refers to CIN3 and cervical squamous cell carcinoma.
  • “Mucus derived from the cervix or vagina” in the present invention means mucus derived from the cervix or vagina, and particularly preferred as a specimen for use in the testing method of the present invention is mucus derived from the cervix or vagina. It is mucus derived from “Mucus derived from the cervix and vagina” is not particularly limited as long as it exists on and/or around the cervix and the cervix. "Vagina-derived mucus” is not particularly limited as long as it is mucus present on and/or around the vagina.
  • mucus can be easily collected by contacting the cervix or vaginal surface with, for example, a cotton ball, cotton swab, sponge, spatula, brush, or the like.
  • the mucus derived from the cervicovaginal region or vagina may include not only mucus but also cells derived from the cervicovaginal region or vagina, or may be only mucus. Since the specimen used in the testing method of the present invention is mucus derived from the cervix or vagina, it has advantages such as less bleeding after the test compared to cell collection used for cytodiagnosis. Additionally, mucus from the cervix or vagina can cause false negative results in cytology, so mucus is collected before cell collection and is usually discarded.
  • the testing method of the present invention is characterized by using mucus derived from the cervicovaginal region or vagina, and there is less burden on the subject, such as collecting additional specimens. Furthermore, according to the testing method of the present invention, it is also possible to obtain and test mucus from the cervix and vagina by oneself.
  • test sample containing mucus may be mucus itself derived from the cervix or vagina obtained from a living body, or may be one prepared from the mucus. It's okay.
  • the preparation method from the mucus is not particularly limited, and any method known per se or any method to be developed in the future can be applied. For example, when mucus is collected with a cotton ball, the cotton ball is shaken with ice-cold methanol, ice-cold chloroform and water are added to the extracted solution, stirred and centrifuged, the supernatant is collected, filtered, and centrifuged. It can be dried in a container. Then, the dried product can be dissolved in water, and the resulting solution can be used as a test sample in the testing method of the present invention.
  • the step of measuring in-vivo metabolites of the present invention can be performed by any method known per se or any method to be developed in the future. Specifically, it can be measured using the presence, amount, concentration, activity, etc. of biological metabolite molecules as indicators. For example, it can be obtained by ionizing the sample to be analyzed, introducing it, creating a difference in mass using electric or magnetic force, and measuring the mass of the ions. More specifically, particles such as atoms, molecules, and clusters are made into gaseous ions by some method, and the ions are separated and detected according to their mass-to-charge ratio by moving them in a vacuum using electromagnetic force or by using flight time differences. Say something.
  • the equipment for performing mass spectrometry is called a mass spectrometer, and it consists of a sample introduction section, an ion source, an analysis section, an ion detection section, and a data processing section.
  • Ionization methods used in ion sources include electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI), etc. Can be used.
  • ESI electrospray ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • MRM multiple reaction monitoring ionization method
  • CCM continuous reaction monitoring
  • SIM selected ion monitoring
  • mass spectrometer refers to, for example, a high-sensitivity triple quadrupole liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS/MS), a liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS), a liquid chromatograph time-of-flight Examples include LC-TOFMS, gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS), capillary electrophoresis mass spectrometer (CE-MS), and capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometer (CE-TOFMS).
  • HPLC high-performance liquid chromatograph
  • GC gas chromatograph
  • CE capillary electrophoresis
  • LC-MS/MS and LC-MS are particularly preferred.
  • the step of measuring in-vivo metabolites of the present invention can also be performed using HPLC, immunoassay, or the like.
  • MS mass spectrum
  • the peak area value based on the mass spectrum of the present invention can be obtained.
  • the peak area can be determined by integrating each in-vivo metabolite using mass spectrum data, for example, using analysis software.
  • the peak area value is, for example, a portion surrounded by a peak curve and a straight line shown in FIG.
  • the predicted probability of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia can be calculated from the peak area values of the mass spectrum using logistics regression analysis or the like.
  • the predicted probability for cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia can also be determined using a nomogram created in advance using peak area values from mass spectra.
  • nomogram is a mathematical model that uses calculation charts to predict from multiple parameters (variables), and is widely used in the medical field because it enables highly accurate predicted probabilities. It is a method. Examples of nomograms include FIGS. 4 to 8.
  • the nomogram used in the testing method of the present invention can be created by a known statistical method using peak area values of mass spectra of in vivo metabolites determined in advance. When determining the predicted probability using a nomogram, (a) the peak area value of each mass spectrum of the in vivo metabolite is determined, and a line is drawn toward the point corresponding to the peak area value to determine the point. (b) Calculate the total points by adding up each such point. (c) By drawing a line downward from the position of the total points and reading the predicted probability, it is possible to predict the diagnosis of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • in vivo metabolites are products produced and consumed by metabolism essential for the life activities of living organisms, such as organic molecules and inorganic molecules produced by the metabolism of proteins, lipids, sugars, etc. can be mentioned.
  • the in-vivo metabolite may be an intermediate metabolite of a metabolic process, a final metabolite, or a substance that is consumed.
  • kynurenine oxidized glutathione (GSSG), malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, Adenylic acid (AMP), Citric acid, Xanthine, Ophthalmic acid, 3-Hydroxybutyric acid, Fumaric acid, Succinic acid acid), 4-Hydroxybutyric acid, Cystine, Threonine, Serine, Citrulline, and Lactic acid.
  • the in-vivo metabolites used in the testing method of the present invention may be used alone or in combination.
  • At least one selected from kynurenine, oxidized glutathione, and malic acid is particularly preferred, and the combination of multiple in-vivo metabolites includes i) kynurenine, oxidized ii) Kynurenine, malic acid and 2-hydroxybutyrate; iii) Oxidized glutathione and 2-hydroxybutyric acid; iv) Oxidized glutathione, niacinamide and 2-hydroxybutyric acid.
  • kynurenine malic acid, adenylosuccinic acid and cystine
  • kynurenine oxidized glutathione, malic acid, adenylosuccinic acid and cystine
  • kynurenine oxidized glutathione and cystine.
  • Malic acid is preferred when testing for cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia.
  • a combination of multiple biological metabolites should be used: i) malic acid, 2-hydroxybutyric acid, xanthine and cystine, ii) malic acid, 2-hydroxybutyric acid, adenylic acid, xanthine, and cystine are preferred.
  • At least one selected from malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, adenylic acid, and 4-hydroxybutyric acid is preferable, and as a combination of multiple in-vivo metabolites.
  • malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid and 4-hydroxybutyric acid i) malic acid, xanthine and 4-hydroxybutyric acid, iii) malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid and serine
  • iv) malic acid, Xanthine, 4-hydroxybutyric acid, threonine and serine are preferred.
  • the combination of multiple in-vivo metabolites should include i) malic acid, adenylate and serine, ii) malic acid, xanthine and Serine is preferred.
  • At least one selected from malic acid, 3-hydroxybutyric acid, xanthine, succinic acid, and fumaric acid is preferable, and as a combination of multiple in-vivo metabolites, , i) malic acid and xanthines, ii) malic acid and 3-hydroxybutyric acid, iii) malic acid, threonine and citrulline, iv) malic acid, fumaric acid, threonine, serine and citrulline.
  • At least one selected from malic acid, adenylosuccinic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and fumaric acid is preferable, and the plurality of in vivo metabolites include i) Preferred are malic acid, xanthine and 3-hydroxybutyric acid, ii) malic acid and fumaric acid, iii) adenylic acid, xanthine, fumaric acid and lactic acid, iv) adenylic acid, xanthine and lactic acid.
  • the ratio of the amount, concentration, etc. of kynurenine and tryptophan may be determined.
  • the ratio of the amount, concentration, etc. of oxidized glutathione and reduced glutathione may be determined.
  • the present inventors conducted metabolome analysis of test samples containing mucus from the cervix or vagina, as shown in the Examples below, and found that the peak area values of the mass spectra of in-vivo metabolites differed from that of the normal group and children. They found that cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia are different groups, and found that these in-vivo metabolites are useful in methods for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • the cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia group has higher levels of kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, It was confirmed that the contents of adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, xanthine, ophthalmic acid, 3-hydroxybutyric acid, fumaric acid, succinic acid, and 4-hydroxybutyric acid were high. On the other hand, it was confirmed that the cervical cancer and/or cervical intraepithelial tumor group contained lower amounts of in-vivo metabolites such as cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid than the normal group.
  • sensitivity and specificity can be determined using, for example, the ROC curve (receiver operating characteristic curve) and the area under the curve (abbreviated as AUC) in the ROC curve. degree and accuracy can be evaluated. For example, when the threshold value is changed, an ROC curve is created in which the sensitivity at each threshold value is plotted on the vertical axis and 1-specificity (Specificity) is plotted on the horizontal axis. The further to the upper left this ROC curve is located, the better the inspection method can be judged. Furthermore, the closer the AUC is to 1, the better the test method can be judged.
  • AUC Akaike's Information Criterion
  • cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia can be determined in the following cases.
  • cervical cancer can be determined in any of the following cases 1) to 9). 1) When the peak area value of the in-vivo metabolite based on the mass spectrum or the predicted probability calculated from the peak area value based on the mass spectrum is higher than the cutoff value; 2) Among in-vivo metabolites, the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of at least one selected from kynurenine, oxidized glutathione, and malic acid is higher than the cutoff value.
  • the predicted probabilities calculated from the peak area values by mass spectra or the peak area values by mass spectra of kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, and niacinamide are lower than the cutoff value.
  • in-vivo metabolites when the predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or mass spectrum peak area value of kynurenine, malic acid, and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 5) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of oxidized glutathione and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 6) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of oxidized glutathione, niacinamide, and 2-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 7) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of kynurenine, malic acid, adenylosuccinic acid, and cystine is higher than the cutoff value; 8) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability
  • the peak area value of kynurenine and tryptophan in the mass spectrum or the ratio of predicted probabilities calculated from the peak area value in the mass spectrum (hereinafter referred to as kynurenine/tryptophan) (Sometimes referred to as Kynurenine/Tryptophan) can be diagnosed as cervical cancer if it is higher than the cutoff value.
  • oxidized glutathione among in-vivo metabolites when oxidized glutathione among in-vivo metabolites is used as an indicator, the ratio of the predicted probability calculated from the peak area value of the mass spectrum of oxidized glutathione and reduced glutathione or the peak area value of the mass spectrum (hereinafter sometimes referred to as oxidized glutathione/reduced glutathione (GSSG/GSH)) is higher than the cutoff value, cervical cancer can be determined.
  • cervical cancer is detected. and can be diagnosed as cervical intraepithelial neoplasia.
  • cervical cancer and/or cervical intraepithelial tumor can be determined to be CIN3 + in the following cases 1) or 2).
  • cervical intraepithelial neoplasia can be determined to be CIN3 in any of the following cases 1) to 5). 1) Calculated from the mass spectrum peak area value or the mass spectrum peak area value of at least one selected from malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, adenylic acid, and 4-hydroxybutyric acid among in-vivo metabolites. If the predicted probability is higher than the cutoff value; 2) Among in-vivo metabolites, the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and 4-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value.
  • cervical cancer and/or cervical intraepithelial tumor can be determined to be CIN2 + in the following cases 1) or 2).
  • cervical intraepithelial neoplasia can be determined to be CIN2 in any of the following cases 1) to 4).
  • cervical intraepithelial neoplasia can be determined to be CIN1 in any of the following cases 1) to 5).
  • in-vivo metabolites when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of malic acid, xanthine, and 3-hydroxybutyric acid is higher than the cutoff value; 3) When the predicted probability calculated from the mass spectrum peak area value or the mass spectrum peak area value of malic acid and fumaric acid among in-vivo metabolites is higher than the cutoff value; 4) Among in-vivo metabolites, when the predicted probability calculated from the peak area value by mass spectrum or the peak area value by mass spectrum of adenylic acid, xanthine, fumaric acid, and lactic acid is higher than the cutoff value; 5) Among in-vivo metabolites, adenylic acid, xanthine, and lactic acid have peak area values determined by mass spectra or predicted probabilities calculated from peak area values determined by mass spectra that are higher than the cutoff value.
  • the "cutoff value" can be determined by a method known per se from the viewpoint of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc. For example, it is determined based on the Youden index (sensitivity + specificity -1), and the cutoff value is the point at which the maximum value occurs, and the cutoff value is the point farthest from the diagonal dotted line where AUC is 0.500. It can also be set. For example, the cutoff value can also be determined by ROC analysis. To set the cutoff value, for example, based on the fact that the ROC curve of an independent variable with excellent sensitivity and specificity approaches the upper left corner, the cutoff value is determined to be the point at which the distance from this upper left corner is the minimum. be able to.
  • analysis software can be used to calculate the predicted probabilities calculated from the mass spectrum peak area values or mass spectrum peak area values of in-vivo metabolites in normal subjects and patients with cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia. to create an ROC curve.
  • the optimal cutoff value for the created ROC curve can be determined based on the Youden index, and the point at which this is the maximum can be set as the cutoff value.
  • the cutoff value is a mass concentration of kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, and xanthine.
  • the cutoff values of the peak area values according to the spectrum can be set to, for example, 0.94, 0.60, 1.69, 0.17, 8.54, 0.05, 7.27, 1.90, and 1.88, respectively.
  • the cutoff values for the peak area values by mass spectra of kynurenine, oxidized glutathione, niacinamide, 2-hydroxybutyric acid, and ophthalmic acid may be set to, for example, 1.36, 0.61, 24.29, 0.19, and 0.18, respectively. Can be done.
  • the cutoff value for kynurenine/tryptophan can be set to, for example, 0.01 or 0.04
  • the cutoff value for oxidized glutathione/reduced glutathione can be set to, for example, 0.06 or 0.16.
  • the cutoff value of the peak area value based on the mass spectrum of malic acid can be, for example, 1.66.
  • the cutoff value of the peak area value by mass spectrum of malic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, adenylic acid, and 4-hydroxybutyric acid is, for example, 1.54, It can be 1.41, 0.13, 7.27, 0.04.
  • the cutoff values for the peak area values by mass spectra of malic acid, 3-hydroxybutyric acid, xanthine, succinic acid, and fumaric acid are, for example, 1.69, 0.22, respectively. It can be 1.09, 20.08, 6.63.
  • the cutoff values for the peak area values by mass spectra of malic acid, adenylosuccinic acid, xanthine, 3-hydroxybutyric acid, and fumaric acid are, for example, 1.81, 0.01, Can be 1.80, 0.08, 7.89.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of kynurenine, malic acid, adenylosuccinic acid, and cystine can be set to, for example, 0.77. can.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, adenylosuccinic acid, and cystine can be, for example, 0.67.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of kynurenine, oxidized glutathione, and cystine can be, for example, 0.39.
  • cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia is determined to be CIN3 + , it is determined from the peak area value of the mass spectrum of malic acid, 2-hydroxybutyric acid, xanthine, and cystine.
  • the cutoff value of the calculated predicted probability can be, for example, 0.73.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of malic acid, 2-hydroxybutyric acid, adenylic acid, xanthine, and cystine can be, for example, 0.71.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values in the mass spectra of malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, and serine is , for example, 0.69.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, threonine, and serine can be, for example, 0.62.
  • the predicted probability calculated from the peak area values of malic acid, adenylic acid, and serine mass spectra is The cutoff value can be, for example, 0.77.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of malic acid, xanthine, and serine can be, for example, 0.81.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of malic acid, threonine, and citrulline is, for example, 0.64. be able to.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of malic acid, fumaric acid, threonine, serine, and citrulline can be, for example, 0.61.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of adenylic acid, xanthine, fumaric acid, and lactic acid is, for example, It can be 0.17.
  • the cutoff value of the predicted probability calculated from the peak area values of the mass spectra of adenylic acid, xanthine, and lactic acid can be, for example, 0.17.
  • subject refers to a person who is unknown whether or not they have cervical cancer, a person who is suspected of having cervical cancer, and a person who has cervical intraepithelial neoplasia or not.
  • Unknown persons persons suspected of having cervical intraepithelial neoplasia, persons judged to have an abnormality by cytology, persons infected or suspected to be infected with HPV, persons whose cervix is This includes people who have been determined not to be suffering from the disease.
  • the testing method of the present invention it is possible to not only determine cervical cancer, but also determine cervical intraepithelial neoplasia, stage classification of histological diagnosis of cervical cancer, predict prognosis of cervical cancer, and perform appropriate diagnosis. It becomes possible to select a treatment method, confirm the treatment effect, etc.
  • the testing method of the present invention if the peak area value or predicted probability calculated from the peak area value from the mass spectrum of the in-vivo metabolite is higher than the cutoff value, the test subject has cervical cancer and/or uterine cancer. This can be an indicator for determining whether you have cervical intraepithelial neoplasia.
  • the timing of performing the testing method of the present invention is not particularly limited, but can be performed, for example, before, after, or simultaneously with methods such as cytology, histology, and HPV genetic testing. Specifically, for example, it may be performed after cytodiagnosis has determined that there is an abnormality, it may be performed at the same time as cytodiagnosis, or it may be performed before cytodiagnosis.
  • test method of the present invention confirms that the peak area value or the predicted probability calculated from the peak area value from the mass spectrum of the in-vivo metabolite is higher than the cutoff value, cytology, histology, HPV gene
  • the test method of the present invention was performed before cytology or histology, and it was confirmed that the predicted probability calculated from the peak area value or peak area value from the mass spectrum of the in vivo metabolite was higher than the cutoff value.
  • the results obtained by the testing method of the present invention can also be used to assist in determining whether a person is suffering from cervical cancer and/or has cervical intraepithelial neoplasia.
  • Treatment methods for cervical cancer are not particularly limited, and include, for example, surgery, radiation therapy, anticancer drug therapy, chemotherapy, and the like.
  • Methods for treating cervical intraepithelial neoplasia are not particularly limited, and include, for example, surgery to remove a portion of the uterus.
  • the present invention further includes a step of measuring in-vivo metabolites from a test sample containing cervicovaginal or vaginal mucus collected from a subject. It also covers methods to aid in the examination of cervical intraepithelial neoplasia.
  • the present invention further provides a biomarker for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia consisting of in vivo metabolites
  • the in-vivo metabolites include kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, xanthine, ophthalmic acid, 3-hydroxybutyric acid, fumaric acid, succinic acid, 4- It also extends to biomarkers that are at least one selected from the group consisting of hydroxybutyrate, cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid.
  • the present invention further includes kynurenine, oxidized glutathione, malic acid, 2-hydroxybutyric acid, niacinamide, adenylosuccinic acid, adenylic acid, citric acid, xanthine, ophthalmic acid, 3-hydroxybutyric acid, fumaric acid, succinic acid, 4-hydroxybutyric acid. , tryptophan, reduced glutathione, cystine, threonine, serine, citrulline, and lactic acid.
  • the reagent of the present invention include reagents for measuring these in-vivo metabolites using a mass spectrometer, an immunoassay method, and the like.
  • the invention further extends to nomograms for testing cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia, including the following (a) to (d): (a) Scale row of peak area values of each mass spectrum of in vivo metabolites; (b) A scale row of points corresponding to (a); (c) A scale column of points summing each point in (b); and (d) A scale column of predicted probabilities of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • Example 1 Metabolome analysis of cervical cancer or cervical intraepithelial tumor
  • metabolome analysis was performed on cervical cancer or cervical intraepithelial tumor.
  • Sensitivity and specificity of in vivo metabolites were evaluated using ROC curves and area under curves (AUC) (Tables 2 to 6). Interpretations of AUC are exact match: 1.0, high precision: 1.0 to 0.9, medium precision: 0.9 to 0.7, and low precision: 0.7 to 0.5.
  • the optimal cutoff value for the ROC curve was determined based on the Youden Index (sensitivity + specificity -1), and the point at which this index reached the maximum value was defined as the cutoff value.
  • AIC Akaike's information criterion
  • Tables 2 to 6 The results of statistical analysis are shown in Tables 2 to 6.
  • the results in Tables 2 to 6 are from the Experimental cohort.
  • Tables 2 to 6 show the results for the Normal group vs. the SCC group, the CIN3 group vs. the SCC group, the Normal group vs. the CIN3 group, the Normal group vs. the CIN2 group, and the Normal group vs. the CIN1 group, respectively.
  • Detection of these in-vivo metabolites was effective in differentiating between the Normal group and the SCC group, and showed high sensitivity, specificity, and accuracy. Similar trends were observed in the Normal group and cervical intraepithelial neoplasia (CIN1, 2, and 3) groups, although the performance was slightly inferior.
  • detection of the metabolites shown in Table 3 was effective in differentiating between the CIN3 group and the SCC group, so detection of these in-vivo metabolites is an effective means for determining cancer.
  • Tables 7 to 11 show the results of combinations of multiple in-vivo metabolites.
  • Table 7 shows the results of the Normal group versus the SCC group, in which 1 represents oxidized glutathione, 2 represents malic acid, 3 represents kynurenine, 4 represents 2-hydroxybutyric acid, and 5 represents niacinamide.
  • Table 8 shows the results of the CIN3 group versus the SCC group, and in Table 8, 1 indicates oxidized glutathione, 2 indicates niacinamide, 3 indicates kynurenine, 4 indicates 2-hydroxybutyric acid, and 5 indicates ophthalmic acid.
  • Table 9 shows the results of the Normal group versus the CIN3 group, in which 1 indicates malic acid, 2 indicates xanthine, 3 indicates 3-hydroxybutyric acid, 4 indicates adenylic acid, and 5 indicates 4-hydroxybutyric acid.
  • Table 10 shows the results of the Normal group versus the CIN2 group. In Table 10, 1 indicates malic acid, 2 indicates 3-hydroxybutyric acid, 3 indicates xanthine, 4 indicates succinic acid, and 5 indicates fumaric acid.
  • Table 11 shows the results of the Normal group versus the CIN1 group, in which 1 represents malic acid, 2 represents adenylosuccinic acid, 3 represents xanthine, 4 represents 3-hydroxybutyric acid, and 5 represents fumaric acid.
  • Example 2 Cervical cancer or cervical intraepithelial tumor metabolome analysis 2
  • data was collected using the Experimental cohort of Example 1, and then verified using a Validation cohort for confirmation.
  • Tables 12 to 16 show the results for the Normal group vs. the SCC group, the CIN3 group vs. the SCC group, the Normal group vs. the CIN3 group, the Normal group vs. the CIN2 group, and the Normal group vs. the CIN1 group, respectively.
  • Example 3 Cervical cancer and/or cervical intraepithelial tumor metabolome analysis 3
  • a predicted probability was calculated from the peak area value of the mass spectrum determined in Example 1, and a Combination ROC analysis and an AIC analysis were performed based on the predicted probability.
  • the Normal group vs. SCC group, CIN3 group vs. SCC group, Normal group vs. CIN3 group, Normal group vs. CIN2 group, and Normal group vs. CIN1 group were compared, and significantly increased in vivo metabolism was determined.
  • the Combination ROC analysis of this example Normal group vs. SCC group, CIN3 group vs. SCC group, Normal group vs.
  • CIN3 + group Normal group vs. CIN3 group, Normal group vs. CIN2 + group, Normal group Comparisons were made between the CIN2 group and the Normal group and the CIN1 group to include not only significantly increased in-vivo metabolites but also significantly decreased in-vivo metabolites.
  • Binomial logistic regression analysis was performed using SPSS Statics ver. 29 to calculate the predicted probability of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • the data used in the binomial logistics regression analysis are the peak area values of each in vivo metabolite.
  • AIC and Combination ROC analyzes were performed based on the results of binary logistics regression analysis using SPSS Statics ver29.
  • AIC was calculated based on the formula shown in Equation 1 using the -2 log likelihood value automatically calculated by binomial logistics regression analysis.
  • the AUC of Combination ROC analysis calculates and stores the predicted probabilities of each in vivo metabolite combination for SCC, CIN3 + , CIN3, CIN2 +, CIN2, and CIN1 during the binomial logistics regression analysis, and further calculates the predicted probability based on the values.
  • AUC was calculated by ROC curve analysis. The results are shown in Tables 17-23. As a representative example of an ROC curve, an ROC curve of the predicted probability for SCC of oxidized glutathione, kynurenine, and cystine in Table 18 is shown in FIG.
  • Table 19 shows the results for the Normal group versus the CIN3 + group.
  • Table 20 shows the results of the Normal group versus the CIN3 group.
  • Table 21 shows the results for the Normal group versus the CIN2 + group.
  • Table 22 shows the results of the Normal group versus the CIN2 group.
  • Table 23 shows the results for the Normal group versus the CIN1 group.
  • malic acid, 2-hydroxybutyric acid, xanthine and cystine or a combination of malic acid, 2-hydroxybutyric acid, adenylic acid, xanthine and cystine are preferred (Table 19).
  • malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, and serine or a combination of malic acid, xanthine, 4-hydroxybutyric acid, threonine, and serine are good (Table 20).
  • a combination of malic acid, adenylic acid and serine, or malic acid, xanthine and serine is good (Table 21).
  • a combination of malic acid, threonine, and citrulline, or a combination of malic acid, fumaric acid, threonine, serine, and citrulline is preferable (Table 22).
  • adenylic acid, xanthine, fumaric acid and lactic acid, or a combination of adenylic acid, xanthine and lactic acid are good (Table 23).
  • Example 4 Creation of a nomogram for the examination of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia
  • a nomogram for the examination of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia is It was created.
  • the peak area values were determined by mass spectra using the same method as in Example 1 (1-3) and (1-4), and the Normal group, SCC group, and CIN3 group were determined from among the 83 types of in-vivo metabolites detected. Comparisons were made between the SCC group, Normal group vs. CIN3 +, Normal group vs. CIN3 group, and Normal group vs.
  • Figure 4 is a nomogram of the Normal group versus the SCC group.
  • Figure 5 is a nomogram of the CIN3 group versus the SCC group.
  • Figure 6 is a nomogram of the Normal group versus the CIN3 + group.
  • Figure 7 is a nomogram of the Normal group versus the CIN3 group.
  • Figure 8 is a nomogram of the Normal group versus the CIN2 + group.
  • the nomogram predicts cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia by summing individual points (top row: Points) corresponding to peak area values in the mass spectrum of in vivo metabolites. Once the total points are marked, the predicted outcome score (bottom row: Predicted Value) can be read as the predicted probability of cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • the memory of some metabolites that should normally be high in SCC is in the opposite direction, and the remaining values after removing the influence of biometabolites that are too highly correlated are in the opposite direction.
  • the nomogram itself can be used, so there is no problem. It is thought that the ROC of the combination of biometabolites was good, and the nomogram did not show the good quality.
  • the metabolome results in this example were highly accurate because if a single biometabolite exceeds the cutoff, it can be determined to be cervical cancer and/or cervical intraepithelial neoplasia.
  • cervical cancer and/or cervical epithelial tumor can be accurately determined. Furthermore, among cervical epithelial tumors, CIN1, CIN2, or CIN3 can be accurately determined. Among cervical cancer and/or cervical epithelial tumors, CIN2 + and CIN3 + can be accurately determined. Furthermore, since the present invention uses mucus derived from the cervix or vagina as a sample, it is less invasive in that there is less bleeding after the test compared to samples in conventional cervical cancer testing methods. In addition, by using it on subjects who have been determined to have an abnormality through testing methods such as cytology, it is possible to reduce the number of biopsies and further reduce the physical and mental burden on the subject. .

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Abstract

より精度の高い子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法を提供する。さらには子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍に有用なバイオマーカーを提供する。被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液から、生体内代謝物を測定することで、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を有することについての検査をすることによる。

Description

子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法
　本発明は、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法に関する。さらに、本発明は子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用バイオマーカー、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用キットに関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2022-135707号優先権を請求する。
　日本の子宮頸がんの罹患数は、年間約8,000～10,000人であり微増傾向にある。また子宮頸がんの罹患率は生殖年齢と関係している。子宮頸がんの死亡数は約3,000人であり、子宮頸がんの死亡率は年齢とともに高い傾向にある。世界では、乳がんについで2番目に多いがんである。日本は先進諸国の中で唯一子宮頸がんの罹患患者数が増加している国である。現在の子宮頸がんの医療システムがうまく機能していないと考えられる。
　子宮頸がんのスクリーニングは、細胞診またはヒトパピローマウイルス（HPV）の遺伝子検査が行われている。子宮頸がんの細胞診は、子宮頸腟部の細胞を独特のヘラやブラシを用いて子宮頸腟部を擦過することにより行われるが、感度が低いのが問題である。子宮頸がんの発がん因子の１つとしてHPV持続感染が挙げられる。しかしながら、HPV感染の多くは一過性であるため、HPV遺伝子検査の特異度は低い。このため、子宮頸がんの検査方法として、精度の高い検査方法の開発が望まれている。
　子宮頸がん患者群またはヒトパピローマウイルス陽性群から採取した検体中の生体内代謝物を、質量分析したことが非特許文献１～８に示されている。非特許文献１には、ヒトパピローマウイルス陽性群において、ヒトパピローマウイルス陰性群に比べグルタチオンおよび酸化型グルタチオンが低下したことが示されている。非特許文献２には、ヒトパピローマウイルスとグルタチオンの関係について示されている。非特許文献３には、子宮頸がん患者の血漿を用いてメタボローム解析を行い、ビルリビン、リゾホスファチジルコリン（17:0）、n-オレオイルトレオニン、12-ヒドロキシドデカン酸およびテトラコサヘキサエン酸が子宮頸がんのバイオマーカーとなり得ることが記載されている。非特許文献４には、子宮頸がん患者の血清中の生体内代謝物を質量分析することにより、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）代謝活性と子宮頸がんの生存率等の関係性について示されている。非特許文献５には、子宮頸がん患者等の血漿中におけるメタボロミクスプロファイリングを行ったことが示されている。非特許文献６には、子宮頸がん患者の尿中の生体内代謝物を質量分析したことが示されている。非特許文献７には、子宮頸がん患者の子宮腟部洗浄液の生体内代謝物を質量分析したことが示されている。非特許文献８には、子宮頸がん患者の腫瘍組織中の生体内代謝物を高速液体クロマトグラフにより分析し、さらにmRNAの発現量を分析したことが示されている。しかしながら、従来の報告では、被検者の子宮頸腟部または腟由来の粘液を用いて網羅的なメタボローム解析を行ったことは示されていない。また子宮頸がん、子宮頸部上皮内腫瘍に各々特異的なバイオマーカーを検出したことについては示されていない。
BJOG.2020 January;127(2):182-192 European Journal of Gynaecological Oncology.1997 January;18(3):196-199 SCIENTIFIC REPORTS.2017 February;7(43353) Oncolummunology.2015 Februray;4:2,e981457 Cancer(Basel).2019 April;11(4):511.doi:10.3390/cancers11040511 Analytical Methods.2014 October;6(12) DOI:10.1039/c4ay00399c EbioMedicine.2019 April;44:675-690 Clinical Biochemistry.2016;49:919-924
　子宮頸がんの既存の検査である細胞診は感度が低く、HPV遺伝子検査は特異度が低いといった問題があるため、より精度の高い検査が望まれている。従って、本発明はより精度の高い子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法を提供することを課題とする。さらには子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍に有用なバイオマーカーを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねたところ、被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定することで、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を有することについての検査が可能となることを見出し、本発明を完成した。さらには、これらの粘液を含む被検試料中のバイオマーカーとして、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸を見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
２．生体内代謝物が、キヌレニン（Kynurenine）、酸化型グルタチオン（Oxidized glutathione）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、ナイアシンアミド（Niacinamide）、アデニロコハク酸（Adenylosuccinic acid）、アデニル酸（Adenylic acid）、クエン酸（Citric acid）、キサンチン（Xanthine）、オフタルミン酸（Ophthalmic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、フマル酸（Fumaric acid）、コハク酸（Succinic acid）、4-ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyric acid）、シスチン（Cystine）、トレオニン（Threonine）、セリン（Serine）、シトルリン（Citrulline）、および乳酸（Lactic acid）からなる群から選択される、少なくとも１つである、前項１に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
３．以下の１）～８）のいずれかの工程を含み、子宮頸がんを検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミドを測定する工程；
３）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
４）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
５）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
６）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンを測定する工程；
７）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸、およびシスチンを測定する工程；
８）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンを測定する工程。
４．以下の１）～９）のいずれかの場合に子宮頸がんと判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミドのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
６）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
７）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
８）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
９）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
５．生体内代謝物のうちキヌレニンを指標とする場合、キヌレニンとトリプトファンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
６．生体内代謝物のうち酸化型グルタチオンを指標とする場合、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
７．子宮頸がんが扁平上皮がんである、前項３～６のいずれかに記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
８．生体内代謝物のうち、少なくともリンゴ酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合、子宮頸がんおよび子宮頸部上皮内腫瘍と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
９．以下の１）または２）の工程を含み、
子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3+を検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンを測定する工程。
１０．以下の１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN3+と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法；
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
１１．以下の１）～５）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3を検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸およびセリンを測定する工程；
５）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンを測定する工程。
１２．以下の１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN3と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
１３．以下の１）または２）の工程を含み、
子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2+を検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよびセリンを測定する工程。
１４．以下の１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN2+と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法；
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
１５．以下の１）～４）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2を検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびキサンチン、またはリンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンを測定する工程；
４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンを測定する工程。
１６．以下の１）～４）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN2と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびキサンチン、またはリンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；。
４）生体代謝産物のうち、リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
１７．以下の１）～５）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN1を検査することを特徴とする、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびフマル酸を測定する工程；
４）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸を測定する工程；
５）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチンおよび乳酸を測定する工程。
１８．以下の１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN1と判定する、前項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびフマル酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチンおよび乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
１９．被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査を補助する方法。
２０．生体内代謝物からなる、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用バイオマーカーであって、
前記生体内代謝物がキヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つである、バイオマーカー。
２１．キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、トリプトファン、還元型グルタチオン、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つ以上を測定する試薬を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用キット。
２２．以下の（ａ）～（ｄ）を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用ノモグラム：
（ａ）生体内代謝物の各マススペクトルのピーク面積値の目盛り列；
（ｂ）（ａ）に対応するポイントの目盛り列；
（ｃ）（ｂ）の各ポイントを合計したポイントの目盛り列；および
（ｄ）子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の予測確率の目盛り列。
　本発明によれば、より精度が高い子宮頸がんの検査方法を提供することができ、さらには子宮頸がんのみではなく、子宮頸部上皮内腫瘍から検査可能である。さらに本発明によれば、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を判定することが可能となり、適切な治療方針を決定することができる。
ナイアシンアミドのピーク面積値を算出するために使用したデータを示す。（実施例１） キヌレニンとトリプトファンのマススペクトルによるピーク面積値の比におけるROC曲線を示す。（実施例１）。 酸化型グルタチオン、キヌレニンおよびシスチンのSCCに対する予測確率のROC曲線を示す。（実施例３）。 図４はNormal群対SCC群のノモグラムを示す。（実施例４） 図５はCIN3群対SCC群のノモグラムを示す。（実施例４） 図６はNormal群対CIN3+群のノモグラムを示す。（実施例４） 図７はNormal群対CIN3群のノモグラムを示す。（実施例４） 図８はNormal群対CIN2+群のノモグラムを示す。（実施例４）
　本発明は被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法に関する。
　子宮頸がんは扁平上皮がんと腺がんに分別される。子宮頸がんの扁平上皮がんの大部分は、子宮頸部上皮内腫瘍を経て発生すると考えられているので、子宮頸がんのうち扁平上皮がんの検査においては子宮頸部上皮内腫瘍も検査することが重要である。本発明の検査対象の「子宮頸がん」は扁平上皮がん（squamous cell carcinoma：SCC）が好ましい。本発明の検査対象の「子宮頸部上皮内腫瘍」は、子宮頸がんの前段階であり、その病変の程度によって軽度異形成（cervical intraepithelial neoplasia 1：CIN1）、中等度異形成（cervical intraepithelial neoplasia 2：CIN2）、高度異形成と上皮内がん（cervical intraepithelial neoplasia 3：CIN3）の３種類がある。本発明の検査対象の「子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍」は、CIN1、CIN2、CIN2+、CIN3、CIN3+、子宮頸がん等が含まれる。ここで、「CIN2+」とは、CIN2以上の病変を示し、CIN2、CIN3および子宮頸がん扁平上皮がん（以下、SCCという場合もある。）を指す。「CIN3+」とは、CIN3以上の病変を示し、CIN3および子宮頸がん扁平上皮がんを指す。
　本発明における「子宮頸腟部または腟由来の粘液」は、子宮頸腟部由来の粘液または腟由来の粘液を意味し、本発明の検査方法に用いる検体として特に好ましいのは、子宮頸腟部由来の粘液である。「子宮頸腟部由来の粘液」とは、子宮頸部および子宮腟部の表面および／または周囲に存在する粘液であれば、特に限定されない。「腟由来の粘液」とは、腟表面および／または周囲に存在する粘液であれば、特に限定されない。これら粘液は子宮頸腟部または腟表面に、例えば綿球、綿棒、スポンジ、ヘラ、ブラシ等を接触されることにより簡便に採取することができる。子宮頸腟部または腟由来の粘液には、粘液だけでなく子宮頸腟部または腟由来の細胞が含まれてもよく、粘液のみであってもよい。本発明の検査方法に用いる検体は、子宮頸腟部または腟由来の粘液であるため、細胞診に用いる細胞採取に比べ検査後の出血が少ない等のメリットがある。また、細胞診において子宮頸腟部または腟由来の粘液は偽陰性の原因となるため、細胞採取の前に粘液を採取され、通常は廃棄される。しかしながら、本発明の検査方法では子宮頸腟部または腟由来の粘液を用いることが特徴であり、被検者にとってさらに検体を採取する等の負担が少ない。さらに、本発明の検査方法は、自分自身で子宮頸腟部または腟由来の粘液を取得し検査することもできる。
　本発明の「粘液を含む被検試料」（以下、被検試料）とは、生体から取得した子宮頸腟部または腟由来の粘液そのものであってもよく、該粘液から調製されたものであってもよい。該粘液からの調製方法は特に限定されず、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えば粘液を綿球等で採取した場合、該綿球を氷冷メタノールで振盪し、抽出した溶液に氷冷クロロホルムおよび水を加え、攪拌し遠心分離し上清を回収し濾過した後、遠心濃縮器を用いて乾固することができる。そして、乾固物を水に溶解させ、得られた溶液を被検試料として本発明の検査方法に供することができる。
　本発明の生体内代謝物を測定する工程は、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法によって測定することができる。具体的には生体代謝産物の分子の存在、量、濃度、活性等を指標として測定することができる。例えば分析する被検試料をイオン化させて導入し、電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を計測することで得られる。より詳しくは、原子、分子、クラスター等の粒子をなんらかの方法で気体状のイオンとし、真空中で運動させ電磁気力を用いて、または飛行時間差によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出することをいう。質量分析をする為の機器を質量分析計といい、試料導入部、イオン源、分析部、イオン検出部そしてデータ処理部から構成される。イオン源で用いられるイオン化法は例えばエレクトロスプレー（electrospray ionization：ESI）、大気圧化学イオン化（Atmospheric pressure chemical ionization：APCI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization： MALDI）等を用いることができる。イオン検出部としては、例えば多重反応モニタリングイオン化法（multiple reaction monitoring：MRM）、連続反応モニタリング（consecutive reaction monitoring：CRM）、選択イオンモニタリング（Selected Ion Monitoring： SIM）等を用いることができる。また、質量分析計を高速液体クロマトグラフ（HPLC）、ガスクロマトグラフ（GC） 、キャピラリー電気泳動（CE） に直結し、移動相を導入することも可能である。本明細書において「質量分析計」は、例えば高感度トリプル四重極型液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS/MS）、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）、液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計（LC-TOFMS）、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）、キャピラリー電気泳動質量分析計（CE-MS）、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析計（CE-TOFMS）等が挙げられ、特にLC-MS/MS、LC-MSが好ましい。本発明の生体内代謝物を測定する工程は、HPLC、免疫学的測定法等を用いて測定することもできる。質量分析計により得られるマススペクトル（Mass spectrum：MS）データからマススペクトルのピークを網羅的に検出し、そのピーク面積を求めることより、本発明のマススペクトルによるピーク面積値とすることができる。ピーク面積は、マススペクトルデータを用い、例えば解析ソフト等により、生体内代謝物ごとに積分して求めることができる。ピーク面積値は、例えば図１に示すピークの曲線と直線で囲われた部分である。さらに、マススペクトルによるピーク面積値からロジスティックス回帰分析等を用いて子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍に対する予測確率を算出することができる。子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍に対する予測確率は、マススペクトルによるピーク面積値を用いて、予め作成したノモグラムを用いて求めることもできる。
　本明細書において、「ノモグラム」とは計算図表を使用して、複数のパラメータ（変数）から予測する数学モデルであり、精度の高い予測確率が可能となるため、医学分野で広く活用されている手法である。ノモグラムの例として、図４～図８が挙げられる。本発明の検査方法に用いるノモグラムは、予め求めた生体内代謝物のマススペクトルのピーク面積値を用いて、公知の統計学的方法により作成することができる。ノモグラムを用いて予測確率を求める場合、（ア）生体内代謝物の各マススペクトルのピーク面積値を求め、係るピーク面積値に対応するポイントに向かって線を引きポイントを決定する。（イ）係る各ポイントを合計して合計ポイントを算出する。（ウ）合計ポイントの位置から下に線を引き、予測確率を読み取ることで子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の判定を予測することができる。
　本発明の「生体内代謝物」とは、生体の生命活動に必須な代謝によって生成・消費される産物であり、例えばタンパク質、脂質、糖等が代謝されて産生された有機分子・無機分子等が挙げられる。本明細書において、生体内代謝物は、代謝過程の中間代謝産物であってもよいし、最終代謝産物であってもよく、消費される物質であってもよい。具体的にはキヌレニン（Kynurenine）、酸化型グルタチオン（Oxidized glutathione：GSSG）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、ナイアシンアミド（Niacinamide）、アデニロコハク酸（Adenylosuccinic acid）、アデニル酸（Adenylic acid：AMP）、クエン酸（Citric acid）、キサンチン（Xanthine）、オフタルミン酸（Ophthalmic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、フマル酸（Fumaric acid）、コハク酸（Succinic acid）、4-ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyric acid）、シスチン（Cystine）、トレオニン（Threonine）、セリン（Serine）、シトルリン（Citrulline）、および乳酸（Lactic acid）からなる群から選択される。本発明の検査方法にて用いる生体内代謝物は、単独でもよいし複数でもよい。
　本発明の検査方法において、子宮頸がんを検査する場合は特にキヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つが好ましく、複数の生体内代謝物の組み合わせとしては、ｉ）キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミド、ｉｉ）キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸、ｉｉｉ）酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸、ｉｖ）酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸、ｖ）キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチン、ｖｉ）キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸、およびシスチン、ｖｉｉ）キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンが好ましい。子宮頸がんおよび子宮頸部上皮内腫瘍を検査する場合には、リンゴ酸が好ましい。
　子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3+を検査する場合は、複数の生体代謝産物の組み合わせとしてｉ）リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチン、ｉｉ）リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチン、およびシスチンが好ましい。
　子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3を検査する場合は、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される少なくとも１つが好ましく、複数の生体内代謝物の組み合わせとしては、ｉ）リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸、ｉｉ）リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸、ｉｉｉ）リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸およびセリン、ｉｖ）リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンが好ましい。
　子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2+を検査する場合は、複数の生体内代謝物の組み合わせとして、ｉ）リンゴ酸、アデニル酸およびセリン、ｉｉ）リンゴ酸、キサンチンおよびセリンが好ましい。
　子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2を検査する場合は、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される少なとも１つが好ましく、複数の生体内代謝物の組み合わせとしては、ｉ）リンゴ酸およびキサンチン、ｉｉ）リンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸、ｉｉｉ）リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリン、ｉｖ）リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンが好ましい。
　子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN1を検査する場合は、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸およびフマル酸から選択される少なくとも１つが好ましく、複数の生体内代謝物としては、ｉ）リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸、ｉｉ）リンゴ酸およびフマル酸、ｉｉｉ）アデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸、ｉｖ）アデニル酸、キサンチンおよび乳酸が好ましい。
　本発明の検査方法において、生体内代謝物のうちキヌレニンを指標とする場合、キヌレニンとトリプトファンの量、濃度等の比を求めてもよい。本発明の検査方法において、生体内代謝物のうち酸化型グルタチオンを指標とする場合、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの量、濃度等の比を求めてもよい。
　本発明者らは、後述する実施例に示すように子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料をメタボローム解析し、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値が、正常群と子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍群異なることを見出し、これら生体内代謝物が子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法に有用であることを見出した。より詳細には、正常群とSCC群、CIN3群とSCC群、正常群とCIN3+群、正常群とCIN3群、正常群とCIN2+群、正常群とCIN2群、正常群とCIN1群において、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値が異なることを見出した。具体的には子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍群は、正常群に比べ、これら生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸の含量等が多いことが確認された。一方、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍群は、正常群に比べ、生体内代謝物のうち、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、乳酸の含量等が少ないことが確認された。
　子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の判定に関し、例えばROC曲線（receiver operating characteristic curve）とROC曲線における面積下曲線（area under the curve、AUCと略称される）により、感度、特異度および精度を評価することができる。例えば、ROC曲線では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Sensitivity）を縦軸に、1-特異度（Specificity）を横軸にプロットしたROC曲線が作成される。このROC曲線がより左上方に位置するほど、検査方法として優れていると判断することができる。さらにAUCが１に近いほど、検査方法として優れていると判断することができる。また、複数の生体内代謝物の組み合わせは、AUC以外に多変量ロジスティック回帰解析により、赤池常法量基準（Akaike's Information Criterion：AIC）を算出し、Combination ROC解析を行って確認することができる。AUCが最大またはAICが最小である場合、最適な組み合わせモデルであると判定することができる。
　本発明の検査方法において、具体的には以下の場合に子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍と判定することができる。
　本発明の検査方法において、以下１）～９）のいずれかの場合に子宮頸がんと判定することができる。
１）生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミドのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
６）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
７）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
８）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
９）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
　本発明の検査方法において、生体内代謝物のうちキヌレニンを指標とする場合、キヌレニンとトリプトファンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比（以下、キヌレニン／トリプトファン（Kynurenine/Tryptophan）という場合もある。）が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定することができる。
　本発明の検査方法において、生体内代謝物のうち酸化型グルタチオンを指標とする場合、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比（以下、酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン（GSSG/GSH）という場合もある。）が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定することができる。
　本発明の検査方法において、生体内代謝物のうち、少なくともリンゴ酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合、子宮頸がんおよび子宮頸部上皮内腫瘍と判定することができる。
　本発明の検査方法において、以下１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN3+と判定することができる。
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
　本発明の検査方法において、以下１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN3と判定することができる。
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
　本発明の検査方法において、以下の１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN2+と判定することができる。
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
　本発明の検査方法において、以下１）～４）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN2と判定することができる。
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびキサンチン、またはリンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率がカットオフ値よりも高い場合；
４）生体代謝産物のうち、リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
　本発明の検査方法において、以下１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN1と判定することができる。
１）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、およびフマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびフマル酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
４）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、フマル酸、および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
５）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率がカットオフ値よりも高い場合 。
　ここで「カットオフ値」は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率等の観点から、自体公知の方法により決定することができる。例えば、ヨーデン指標（Youden index、感度＋特異度-1）に基づいて決定し、その最大値となるポイントをカットオフ値に、AUCが0.500となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値に設定することもできる。例えばカットオフ値はROC解析によって求めることもできる。カットオフ値の設定としては、例えば感度と特異度の優れた独立変数のROC曲線は左上隅に近づいているという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値と決定することができる。例えば、正常者並びに子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍有する患者における生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率について、解析ソフトを使用してROC曲線を作成する。作成したROC曲線における最適なカットオフ値は、ヨーデン指標に基づいて決定し、これが最大となるポイントをカットオフ値と設定することができる。
　本発明の検査方法において、カットオフ値は例えば子宮頸がんを判定する場合、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチンのマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば各々を0.94、0.60、1.69、0.17、8.54、0.05、7.27、1.90、1.88とすることができる。さらに上述した以外にもキヌレニン、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミド、2-ヒドロキシ酪酸、オフタルミン酸のマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば各々を1.36、0.61、24.29、0.19、0.18とすることができる。また、キヌレニン／トリプトファンのカットオフ値は例えば0.01、0.04とすることができ、酸化型グルタチオン／還元型グルタチオンのカットオフ値は、例えば0.06、0.16とすることができる。例えば子宮頸がんおよび子宮頸部上皮内腫瘍を判定する場合、リンゴ酸のマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば1.66とすることができる。例えば子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3を判定する場合、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば各々を1.54、1.41、0.13、7.27、0.04とすることができる。例えば子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2を判定する場合、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸、フマル酸のマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば各々を1.69、0.22、1.09、20.08、6.63とすることができる。例えば子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN1を判定する場合、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸のマススペクトルによるピーク面積値のカットオフ値は、例えば各々を1.81、0.01、1.80、0.08、7.89とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸がんを判定する場合、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.77とすることができる。キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.67とすることができる。キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.39とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN3+と判定する場合は、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.73とすることができる。リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチン、およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.71とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸部上皮内腫瘍がCIN3と判定する場合、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.69とすることができる。リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニン、およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.62とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN2+と判定する場合、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.77とすることができる。リンゴ酸、キサンチンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.81とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸部上皮内腫瘍がCIN2と判定する場合、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.64とすることができる。リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.61とすることができる。
　本発明の検査方法において、例えば子宮頸部上皮内腫瘍がCIN1と判定する場合、アデニル酸、キサンチン、フマル酸、および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.17とすることができる。アデニル酸、キサンチン、および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率のカットオフ値は、例えば0.17とすることができる。
　本発明において、「被検者」は子宮頸がんに罹患しているどうか不明の者、子宮頸がんに罹患していると疑われる者、子宮頸部上皮内腫瘍を有しているかどうか不明の者、子宮頸部上皮内腫瘍を有していると疑われる者、細胞診により異常あると判定された者、HPVに感染しているまたは感染していると疑われる者、子宮頸がんに罹患していないと判定された者等が挙げられる。本発明の検査方法によれば、子宮頸がんの判定のみならず、子宮頸部上皮内腫瘍の判定、子宮頸がんの組織診の病期分類、子宮頸がんの予後予測、適切な治療方法の選択、治療効果の確認等が可能となる。
　本発明の検査方法によれば、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはピーク面積値から算出した予測確率がカットオフ値よりも高い場合、被検者が子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を有するとの判断の指標になりえる。本発明の検査方法を行うタイミングとしては、特に限定されないが、例えば細胞診、組織診、HPV遺伝子検査等の方法の前後または同時に行うことできる。具体的には、例えば細胞診で異常があると判定された後に行う、細胞診と同時に行う、細胞診の前に行う等が挙げられる。
　本発明の検査方法により、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはピーク面積値から算出した予測確率がカットオフ値よりも高いことが確認された場合、さらに細胞診、組織診、HPV遺伝子検査等の方法と組み合わせることで、より正確な子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の有無を判定することができ、生検回数を減らすことができる。さらに、細胞診または組織診の前に本発明の検査方法を行い、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはピーク面積値から算出した予測確率がカットオフ値よりも高いことが確認された場合は、細胞診または組織診を受ける指標とすることもできる。本発明の検査方法により得られた結果は、子宮頸がんに罹患しているおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を有するとの判定の補助のために利用することもできる。本発明の検査方法は他の検査方法と組み合わせることで、被検者に対して子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の治療を行うことが可能となり、より効率的により確実に治療することが可能となる。子宮頸がんの治療方法は特に限定されないが、例えば手術、放射線治療、抗がん剤治療、化学療法等が挙げられる。子宮頸部上皮内腫瘍の治療方法は特に限定されないが、例えば子宮の一部を切り取る手術等が挙げられる。
　本発明はさらに被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査を補助する方法にも及ぶ。
　本発明はさらに生体内代謝物からなる、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用バイオマーカーであって、
前記生体内代謝物がキヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つである、バイオマーカーにも及ぶ。
　本発明はさらにキヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、トリプトファン、還元型グルタチオン、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つ以上を測定する試薬を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用キットにも及ぶ。本発明の試薬は、例えば質量分析計、免疫学的測定法等を用いてこれら生体内代謝物を測定する試薬等が挙げられる。
　本発明は、さらに以下の（ａ）～（ｄ）を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用ノモグラムにも及ぶ。
（ａ）生体内代謝物の各マススペクトルのピーク面積値の目盛り列；
（ｂ）（ａ）に対応するポイントの目盛り列；
（ｃ）（ｂ）の各ポイントを合計したポイントの目盛り列；および
（ｄ）子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の予測確率の目盛り列。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。なお、本実施例は、藤田医科大学倫理委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが各患者から得られたものである。全ての方法は、関連するガイドライン及び規制に従って実施した。
　（実施例１）子宮頸がんまたは子宮頸部上皮内腫瘍メタボローム解析
　本実施例では、子宮頸がんまたは子宮頸部上皮内腫瘍に分類し、メタボローム解析を行った。
（1-1）検体の採取
　2020年1月から2021年9月まで婦人科検査のために、藤田医科大学病院の外来診療に通っていた298人の患者から子宮頸腟部由来の粘液および組織を採取した。メタボローム解析用の子宮頸腟部由来の粘液は直径1cmの滅菌綿球で拭き取り、-80°Cで保存した。
（1-2）組織診による病期分類
　（1-1）で得られた組織検体を用いて子宮頸がんの組織診を行い、病期分類に従って分類した。その結果、Normal(n=48)、CIN1(n=19)、CIN2(n=80)、CIN3(n=82)、およびSCC(n=69)に分類した。各群の年齢、BMIおよび中央値については表１に示す。全てのNormal群は不妊症患者である。なお、Normalは正常を示し、CIN1は軽度異形成を示し、CIN2は中等度異形成を示し、CIN3は高度異形成と上皮内がんを示し、SCCは扁平上皮がんを示す。表１中のAge BMIの数値は中央値（25%、75%）である。 
（1-3）被検試料の調製
　（1-1）で検体採取した綿球を10μM内部標準（2-Morpholinoethanesulfonic acid）の入った氷冷メタノール500μLで30分振盪し、抽出液を回収した。抽出液200μLに対して氷冷クロロホルムを200μLと水125μLを加え、攪拌後、4°C 10分 13500×gで遠心分離した。上清200μLを回収し、10 kDa分子フィルター （Millipore） を用いて濾過後、遠心濃縮器を用いて乾固し、水50μLに溶解し被検試料とした。
（1-4）生体内代謝物の測定
　（1-3）で調製した被検試料を用い、高感度トリプル四重極型液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS/MS、LCMS-8060（島津製作所、日本））を使用し生体内代謝物を測定した。高速液体クロマトグラフィー（High performance liquid chromatography：HPLC）では、Supelco reversed-phase Discovery HS F5-3カラム（2.0 mm× 150 mm、3μm）（Supelco）を解析に用いた。移動相Aはギ酸0.1%水溶液、移動相Bは0.1%(v/v)ギ酸/アセトニトリルを用いた。流速は250 μL/分、被検試料注入量は1 μLで行った。カラムオーブン温度は40℃で行った。質量分析条件におけるイオン検出部は、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring : MRM）を用いた。イオン化法はエレクトロスプレーイオン化（electorospray ionization : ESI）を用いた。分析条件は島津製作所のメソッドパッケージ一次代謝物ver.2 に従いMSデータを得た。生体内代謝物についてのピーク強度解析はLabSolutionsソフトウェア（島津製作所、日本）を用いて、MSデータからマススペクトルのピークを網羅的に検出し、生体内代謝物ごとのピーク面積を求めることより、生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値を求めた。SCC患者1検体のみにおけるナイアシンアミドのピーク面積値を算出するために使用したデータを図１に示す。ピーク面積値とは図１に示すピークの曲線と直線で囲われた部分を示す。
（1-5）統計解析
　マススペクトルによるピーク面積値を統計解析により解析した。全ての統計解析は、SPSSソフトウェアバージョン22.0.0.0;（IBM Corporation, Armonk, NY, USA）とMetaboAnalyst 5.0. （https://www.metaboanalyst.ca/）web解析フリーソフトを用いて解析を行った。検定におけるp < 0.05を統計学的に有意とした。疾患カテゴリー群間の有意な傾向を評価するためにJonckheerre-Terpstraトレンド検定を行い、グループ間全体の差を比較するためにKruskal-Wallis解析を行った。2群間比較は、ウィルコクソン順位和検定とMann-Whitney U検定後、ボンフェローニ補正をし比較した。ROC曲線と面積下曲線（AUC）により、生体内代謝物の感度、および特異性を評価した（表２～６）。AUCの解釈は、完全一致：1.0、高精度：1.0 ～0.9、中程度：0.9～0.7、低精度：0.7～0.5である。ROC曲線における最適なカットオフ値は、Youden Index（感度＋特異度-1）に基づいて決定し、これが最大値となるポイントをカットオフ値とした。また、複数の生体内代謝物を組み合わせて、多変量ロジスティック回帰解析により、赤池情報量基準（AIC）を算出し、Combination ROC解析を行った。AICは以下の式１で示す。AICは、最小値であるとき、最適な組み合わせモデルであると判定する（表７～１１）。ROC曲線において、代表例として表２におけるキヌレニン／トリプトファンのROC曲線を図２に示す。図２中のTrue positive rate（真陽性率）は感度を示し、Fales positive rate（擬陽性率）は1-特異度を示す。また図２中のROC曲線上に、求めたカットオフ値を〇で示した。
　統計解析の結果を表２～６に示す。表２～６の結果はExperimental cohortの結果である。表２～６はそれぞれNormal群対SCC群、CIN3群対SCC群、Normal群対CIN3群、Normal群対CIN2群、Normal群対CIN1群の結果である。Normal群とSCC群との鑑別にこれらの生体内代謝物の検出は有効で高い感度・特異度・精度を示した。性能はやや劣るもののNormal群と子宮頸部上皮内腫瘍（CIN1・2・3）群でも同様の傾向を示した。特にCIN3群とSCC群との鑑別には表３に示す代謝産物の検出が有効であったことから、これらの生体内代謝物の検出はがんの判定に有効な手段である。
　さらに複数の生体内代謝物の組み合わせの結果を表７～１１に示す。表７はNormal群対SCC群の結果であり、表７中の１は酸化型グルタチオン、２はリンゴ酸、３はキヌレニン、４は2-ヒドロキシ酪酸、５はナイアシンアミドを示す。表８はCIN3群対SCC群の結果であり、表８中の１は酸化型グルタチオン、２はナイアシンアミド、３はキヌレニン、４は2-ヒドロキシ酪酸、５はオフタルミン酸を示す。表９はNormal群対CIN3群の結果であり、表９中の１はリンゴ酸、２はキサンチン、３は3-ヒドロキシ酪酸、４はアデニル酸、５は4-ヒドロキシ酪酸を示す。表１０はNormal群対CIN2群の結果であり、表１０中の１はリンゴ酸、２は3-ヒドロキシ酪酸、３はキサンチン、４はコハク酸、５はフマル酸を示す。表１１はNormal群対CIN1群の結果であり、表１１中の１はリンゴ酸、２はアデニロコハク酸、３はキサンチン、４は3-ヒドロキシ酪酸、５はフマル酸を示す。
　AICの値が低く、AUCの高い代謝産物について分析したところ、Normal群とSCC群との鑑別では１－５の組み合わせが一番成績がよい（表７）。CIN3群とSCC群では１，２，４または１，４の組み合わせが良い（表８）。Normal群とCIN3群では１，２，３，５の組み合わせが良い（表９）。Normal群とCIN2群では１，３の組み合わせが良い（表１０）。Normal群とCIN1群では１，３，４の組み合わせが良い（表１１）。
（実施例２）子宮頸がんまたは子宮頸部上皮内腫瘍メタボローム解析２
　本実施例では、実施例１のExperimental cohortにてデータを集めた後、確認のためにValidation cohortにより検証した。
　実施例１の（1-1）及び（1-2）と同手法により、得られた組織検体を病期分類に従って分類した。その結果、Normal(n=18)、CIN1(n=10)、CIN2(n=22)、CIN3(n=22)、およびSCC(n=29)に分類した。実施例１の（1-3）及び（1-4）と同手法によりマススペクトルによるピーク面積値を求め、Experimental cohortの表２～６におけるピーク面積値のカットオフ値以下又は以上で検体数を各々カウントし、Validation cohortの感度（Sensitivity:Sec）、1-特異度（Specificity:spec）、陽性尤度比（Positive likelihood ratio:PLR）、陰性尤度比（Negative likelihood ratio:NLR）、精度（accuracy）、陽性的中率（Positive Predictive Value:PPV）、陰性的中率（Negative Predictive Value:NPV）を算出した。
　上記の結果を表１２～１６に示す。表１２～１６はそれぞれNormal群対SCC群、CIN3群対SCC群、Normal群対CIN3群、Normal群対CIN2群、Normal群対CIN1群の結果である。
（実施例３）子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍メタボローム解析３
　本実施例では、実施例１で求めたマススペクトルによるピーク面積値から予測確率を算出し、予測確率を基にCombination ROC解析およびAIC解析を行った。実施例１のCombination ROC解析では、Normal群対SCC群、CIN3群対SCC群、Normal群対CIN3群、Normal群対CIN2群、Normal群対CIN1群を各々比較し、有意に増加した生体内代謝物を対象としたが、本実施例のCombination ROC解析では、Normal群対SCC群、CIN3群対SCC群、Normal群対CIN3+群、Normal群対CIN3群、Normal群対CIN2+群、Normal群対CIN2群、Normal群対CIN1群を各々比較し、有意に増加した生体内代謝物だけでなく、有意に減少した生体内代謝物を含み検討した。
　SPSS Statics ver29 を用いて、2項ロジスティクス回帰分析を行い、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍に対する予測確率を算出した。2項ロジスティクス回帰分析における使用データは、各生体内代謝物のピーク面積値である。SPSS Statics ver29 を用い解析した2項ロジスティクス回帰分析結果を基に、AICとCombination ROC解析を行った。AICは、2項ロジスティクス回帰分析で自動算出された、-2 対数尤度の値を使用し、式１に示す計算式に基づき算出した。Combination ROC解析のAUCは、2項ロジスティクス回帰分析時に、各生体内代謝物の組み合わせのSCC、CIN3+、CIN3、CIN2+、CIN2、CIN1に対する予測確率を算出、保存し、その値を基にさらにROC曲線解析を行いAUCが算出された。その結果を表１７～２３に示す。ROC曲線の代表例として、表１８の酸化型グルタチオン、キヌレニンおよびシスチンのSCCに対する予測確率のROC曲線を図３に示す。
　Combination ROC解析では、Normal群対SCC群、CIN3群対SCC群、Normal群対CIN3+群、Normal群対CIN3群、Normal群対CIN2+群、Normal群対CIN2群、Normal群対CIN1群を各々比較し、有意に減少した生体内代謝物を含み検討したところ、診断精度が向上した。ここで、有意に減少した生体内代謝物は、シスチン（Cystine）、トレオニン（Threonine）、セリン（Serine）、シトルリン（Citrulline）、および乳酸（Lactic acid）である。表１７はNormal群対SCC群の結果である。表１８はCIN3群対SCC群の結果である。表１９はNormal群対CIN3+群の結果である。表２０はNormal群対CIN3群の結果である。表２１はNormal群対CIN2+群の結果である。表２２はNormal群対CIN2群の結果である。表２３はNormal群対CIN1群の結果である。
　AICの値が低く、AUCの高い代謝産物について分析したところ、感度、特異度、精度がいずれも高い傾向があり、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の判定におけるバイオマーカーの最適な組み合わせがAICとAUCの評価により抽出されていることが確認された。Normal群とSCC群との鑑別では、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸、およびシスチン、またはキヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンがよい（表１７）。CIN3群とSCC群ではキヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンの組み合わせが良い（表１８）。Normal群とCIN3＋群では、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチン、またはリンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンの組み合わせがよい（表１９）。Normal群とCIN3群では、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、およびセリン、またはリンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンの組み合わせが良い（表２０）。Normal群とCIN2＋群ではリンゴ酸、アデニル酸およびセリン、またはリンゴ酸、キサンチンおよびセリンの組み合わせが良い（表２１）。Normal群とCIN2群では、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリン、またはリンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンの組み合わせがよい（表２２）。Normal群とCIN1群ではアデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸、またはアデニル酸、キサンチンおよび乳酸の組み合わせが良い（表２３）。
（実施例４）子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査のためのノモグラムの作成
　本実施例では、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査のためのノモグラムを作成した。
　実施例１の（1-1）及び（1-2）と同手法により、得られた組織検体を病期分類に従って分類した。その結果、Normal(n=48)、CIN1(n=19)、CIN2(n=80)、CIN3(n=82)、およびSCC(n=69)に分類した。実施例１の（1-3）及び（1-4）と同手法によりマススペクトルによるピーク面積値を求め、検出された83種類の生体内代謝物の中からNormal群とSCC群、CIN3群とSCC群、Normal群対CIN3+、Normal群とCIN3群、Normal群とCIN2群とで各々比較し、有意に差のある生体内代謝物を選別した。実施例１の（1-5）と同手法により複数の生体内代謝物におけるAICを求めた。AICを指標として最適な組み合わせとなる5種類の生体内代謝物を選抜し、ノモグラムを作成した。
　ノモグラムを図４～８に示す。図４はNormal群対SCC群のノモグラムである。図５はCIN3群対SCC群のノモグラムである。図６はNormal群対CIN3+群のノモグラムである。図７はNormal群対CIN3群のノモグラムである。図８はNormal群対CIN2+群のノモグラムである。ノモグラムは生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値に対応する個々のポイント（最上段：Points）を合計して、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍を予測する。合計ポイントがマークされると、予測された結果スコア（最下段：Predicted Value）を子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の予測確率として読み取ることができる。
　Normal vs SCCのGSSGでは、本来SCCで高くなるはずの代謝物のメモリが逆向きになっているものがあり、相関が高すぎる生体代謝産物の影響を取り除いた残りの数値が逆向きになる。ノモグラム自体は使えるので問題ないと考えられる。生体代謝産物の組み合わせのROCが良く、ノモグラムの良さが出ていなかったと考えられる。本実施例におけるメタボロームの結果は単独の生体代謝産物がCut off以上になったら、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍と判断できるため、精度が良い結果であった。
　以上詳述したように、本発明の検査方法によれば、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮腫瘍を正確に判定することができる。さらには子宮頸部上皮腫瘍のうちCIN1、CIN2またはCIN3を正確に判定することができる。子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮腫瘍のうちCIN2+、CIN3+を正確に判定することができる。さらに本発明は子宮頸腟部または腟由来の粘液を検体とすることから、従来の子宮頸がんの検査方法における検体に比べ、検査後の出血が少ない等の点で低侵襲である。また細胞診等の検査方法にて異常があると判定された被検者に使用することで、生検回数を減らすことが可能となり、さらには被検者の心身の負担を軽減することができる。

Claims (22)

  1. 被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  2. 生体内代謝物が、キヌレニン（Kynurenine）、酸化型グルタチオン（Oxidized glutathione）、リンゴ酸（Malic acid）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）、ナイアシンアミド（Niacinamide）、アデニロコハク酸（Adenylosuccinic acid）、アデニル酸（Adenylic acid）、クエン酸（Citric acid）、キサンチン（Xanthine）、オフタルミン酸（Ophthalmic acid）、3-ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid）、フマル酸（Fumaric acid）、コハク酸（Succinic acid）、4-ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyric acid）、シスチン（Cystine）、トレオニン（Threonine）、セリン（Serine）、シトルリン（Citrulline）、および乳酸（Lactic acid）からなる群から選択される、少なくとも１つである、請求項１に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  3. 以下の１）～８）のいずれかの工程を含み、子宮頸がんを検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミドを測定する工程；
    ３）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ４）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ５）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ６）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンを測定する工程；
    ７）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸、およびシスチンを測定する工程；
    ８）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンを測定する工程。
  4. 以下の１）～９）のいずれかの場合に子宮頸がんと判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオンおよびリンゴ酸から選択される少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ３）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸およびナイアシンアミドのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ４）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸および2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ５）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオンおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ６）生体内代謝物のうち、酸化型グルタチオン、ナイアシンアミドおよび2-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ７）生体内代謝物のうち、キヌレニン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ８）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、アデニロコハク酸およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ９）生体内代謝物のうち、キヌレニン、酸化型グルタチオン、およびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
  5. 生体内代謝物のうちキヌレニンを指標とする場合、キヌレニンとトリプトファンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  6. 生体内代謝物のうち酸化型グルタチオンを指標とする場合、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率の比が、カットオフ値よりも高い場合に子宮頸がんと判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  7. 子宮頸がんが扁平上皮がんである、請求項３～６のいずれかに記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  8. 生体内代謝物のうち、少なくともリンゴ酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合、子宮頸がんおよび子宮頸部上皮内腫瘍と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法。
  9. 以下の１）または２）の工程を含み、
    子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3+を検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンを測定する工程。
  10. 以下の１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN3+と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法；
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸、キサンチンおよびシスチンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
  11. 以下の１）～５）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN3を検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸およびセリンを測定する工程；
    ５）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンを測定する工程。
  12. 以下の１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN3と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、アデニル酸および4-ヒドロキシ酪酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸および4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび4-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ５）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチン、4-ヒドロキシ酪酸、トレオニンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
  13. 以下の１）または２）の工程を含み、
    子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2+を検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよびセリンを測定する工程。
  14. 以下の１）または２）の場合に、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍が、CIN2+と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法；
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニル酸およびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよびセリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
  15. 以下の１）～４）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN2を検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびキサンチン、またはリンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンを測定する工程；
    ４）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンを測定する工程。
  16. 以下の１）～４）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN2と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、3-ヒドロキシ酪酸、キサンチン、コハク酸およびフマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびキサンチン、またはリンゴ酸および3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、トレオニン、およびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；。
    ４）生体代謝産物のうち、リンゴ酸、フマル酸、トレオニン、セリンおよびシトルリンのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。 
  17. 以下の１）～５）のいずれかの工程を含み、子宮頸部上皮内腫瘍のうちCIN1を検査することを特徴とする、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、およびフマル酸から選択される、少なくとも１つを測定する工程；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸を測定する工程；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびフマル酸を測定する工程；
    ４）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸を測定する工程；
    ５）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチンおよび乳酸を測定する工程。
  18. 以下の１）～５）のいずれかの場合に、子宮頸部上皮内腫瘍がCIN1と判定する、請求項２に記載の子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査方法：
    １）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、アデニロコハク酸、キサンチン、3-ヒドロキシ酪酸、およびフマル酸から選択される、少なくとも１つのマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ２）生体内代謝物のうち、リンゴ酸、キサンチンおよび3-ヒドロキシ酪酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ３）生体内代謝物のうち、リンゴ酸およびフマル酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ４）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチン、フマル酸および乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合；
    ５）生体内代謝物のうち、アデニル酸、キサンチンおよび乳酸のマススペクトルによるピーク面積値またはマススペクトルによるピーク面積値から算出した予測確率が、カットオフ値よりも高い場合。
  19. 被検者から採取された子宮頸腟部または腟由来の粘液を含む被検試料から、生体内代謝物を測定する工程を含むことを特徴とする、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査を補助する方法。
  20. 生体内代謝物からなる、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用バイオマーカーであって、
    前記生体内代謝物がキヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つである、バイオマーカー。
  21. キヌレニン、酸化型グルタチオン、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ナイアシンアミド、アデニロコハク酸、アデニル酸、クエン酸、キサンチン、オフタルミン酸、3-ヒドロキシ酪酸、フマル酸、コハク酸、4-ヒドロキシ酪酸、トリプトファン、還元型グルタチオン、シスチン、トレオニン、セリン、シトルリン、および乳酸からなる群から選択される、少なくとも１つ以上を測定する試薬を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用キット。
  22. 以下の（ａ）～（ｄ）を含む、子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の検査用ノモグラム：
    （ａ）生体内代謝物の各マススペクトルのピーク面積値の目盛り列；
    （ｂ）（ａ）に対応するポイントの目盛り列；
    （ｃ）（ｂ）の各ポイントを合計したポイントの目盛り列；および
    （ｄ）子宮頸がんおよび／または子宮頸部上皮内腫瘍の予測確率の目盛り列。
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