KR20180041556A - 유방암의 조기 진단을 위한 지질 마커 - Google Patents

Abstract

대상체에서 유방암을 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 생물학적 샘플에서, LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계이며, 여기서 측정은 적어도 5종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 단계를 포함한다.

Description

유방암의 조기 진단을 위한 지질 마커 {LIPID MARKERS FOR EARLY DIAGNOSIS OF BREAST CANCER}

본 발명은 유방암을 진단하는 방법, 특히 유방암을 진단하기 위해 지질 바이오마커의 패널을 사용하여 유방암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

유방암은 가장 빈번하게 진단되는 암이고, 미국에서 여성 중 암-관련 사망의 제2 주요 원인이다 [1]. 2015년 미국 암 학회 (ACS) 추정에 따르면, 231,840건의 새로운 유방암 사례가 진단되었으며, 이는 모든 새로이 진단된 여성 암 환자의 29%를 차지한다. 그리고 유방암 사망의 40,290건은 여성 중 암-관련 사망의 15%에 이른다 [1]. 조기 진단은 환자의 예후에서 주요 역할을 한다. 유방촬영은 유방암 스캐닝에서 현재 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나, 결과는 높은 가양성률 때문에 만족스럽지 않다 [2].

스크리닝 유방촬영에서 유방암의 과다진단은 0%에서 30% 이상까지로 넓다 [3]. 비정상적 스크리닝 유방촬영상을 갖는 여성은 추가의 고가의 자기 공명 영상화 (MRI) 및 조직 샘플링 (미세-바늘 흡인, 핵 생검 또는 절제 생검에 의함)을 겪는다. 심지어 더 나쁘게는, 여성의 약 10%는 추가의 시험을 위해 각각의 스크리닝 시험이 다시 요구될 것이지만, 이들 여성 중 단지 5%만이 암을 가질 것이고, 나머지는 양성인 것으로 판명된다 [4]. 치아렐리(Chiarelli) 등 [5]은 유방 MRI 플러스 유방촬영이 유방암 스크리닝을 위한 효과적인 방법인 것으로 보고한 바 있다. 그러나, 이는 매우 고가이고, MRI를 받은 고-위험 집단을 스크리닝하는 것이 생존 이익으로 해석되는 것으로 입증된 바 없다 [6]. 추가로, MRI는 높은 가양성률을 갖고, 이는 추가의 스트레스 및 비용이 드는 높은 빈도의 쓸모없는 생검으로 이어질 수 있다 [7]. 양성 환자를 위한 불필요하고 고가이며 침습적인 스크리닝을 피하기 위해, 더 나은 방법이 긴급히 필요하다. 혈액-기반 종양 마커는 암의 진단에서 연구 핫스팟 중 하나이다. 그러나, 이는 현재까지 임상 시험에서 사용되지 않는다 [8-10]. 혈청 종양 마커 예컨대 CA15.3 및 BR27.29는 낮은 감수성을 갖고, 따라서 유방암 검출에 사용되지 않는다 [11]. 따라서, 최소한으로 침습적인 방법 및 악성 유방 병변의 조기 진단에 대한 절실한 필요가 있다.

지질은 많은 생리학적 활성, 예컨대 에너지 저장, 구조, 아폽토시스 및 신호전달을 조절하는데 수반된다 [12]. 많은 연구는, 대사 증후군의 주요 성분으로서, 이상지혈증이 전립선암, 난소암 및 신장암을 포함한 다양한 암의 발암에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고한 바 있다 [13-15]. 유방암의 경우에, 대사체학 또는 지질체학이 암 진단 및 진행에 대해 잠재력을 갖는 것으로 널리 제시되어 왔다 [16-18]. 그러나, 대부분의 이들 연구는 암 환자에서 지질의 총 수준에 대해서만 집중되어 왔고, 이들 중 단지 소수만이 양성 유방 질환을 갖는 환자를 포함하였다. 최근에, 양(Yang) 등은 단지 5건의 유방암 사례 및 6명의 양성 환자에서 양성 유방 질환 환자와 함께 혈장 지질 프로파일의 포괄적 평가를 수행하였고, 이들 질환에서 지질 마커의 진단상 효율을 보여주었다 [19].

본 연구는 지질체학 기술 및 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (ESI-MS/MS)을 사용하여 총 84명의 유방암 환자 및 110명의 양성 환자를 포함한 훈련 세트 및 검증 세트 둘 다에서 혈장 샘플에 대한 정량 분석을 수행한다. 전체 세트 (조합된 훈련 및 검증 세트)는 결과의 신뢰성을 입증하는데 사용되었다. 본 연구에서, 초기 암을 양성 병변과 구별할 수 있고 유방암의 조기 진단을 위한 잠재적 바이오마커로서의 역할을 하는, 혈장 지질 종의 패널이 확인되었다.

필요한 것은 유방암을 진단하기 위한 바이오마커 패널이다.

대상체에서 유방암을 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및 생물학적 샘플에서, LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계이며, 여기서 측정은 패널에서 적어도 5종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널로부터의 측정을, 유방암을 갖지 않는 대조군 코호트로부터의 LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 참조 프로파일과 비교하는 단계, 및 암을 갖지 않는 대조군 코호트로부터의 참조 프로파일에서의 수준과 비교 시 생물학적 샘플에서 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에서의 수준의 변화를 확인하여 대상체가 유방암을 갖는지를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

도 1은 유방암 및 양성 샘플에서의 C19:1 CE의 질량 스펙트럼을 예시한다.
도 2A-2O는 바이오마커의 패널의 15종의 지질 종의 혈장 농도를 예시한다. 흑색 수평선은 중앙값이다. p 값은 스튜던트 T-검정에 의해 결정되었다. 도 2A는 LPC(18:3)를 제시한다. 도 2B는 LPC(20:2)를 제시한다. 도 2C는 LPC(20:1)를 제시한다. 도 2D는 LPC(20:0)를 제시한다. 도 2E는 PC(32:1)를 제시한다. 도 2F는 PC(34:4)를 제시한다. 도 2G는 PC(38:3)를 제시한다. 도 2H는 PC(40:5)를 제시한다. 도 2I는 PC(40:3)를 제시한다. 도 2J는 PC(44:11)를 제시한다. 도 2K는 ePC(32:2)를 제시한다. 도 2L은 ePC(38:3)를 제시한다. 도 2M은 C19:1 CE를 제시한다. 도 2N은 C19:0 CE를 제시한다. 도 2O는 C20:0 CE를 제시한다. (도 2a-2o에 대한 약어: LPC 리소포스파티딜콜린; PC 포스파티딜콜린; ePC 에테르-연결된 포스파티딜콜린; CE 콜레스테롤 에스테르).
도 3A-3C는 유방암의 예측을 위한 15종의 지질 바이오마커의 패널의 ROC 곡선을 제시한다. 15종의 지질 바이오마커의 패널은 도 2A-2O에서 확인된다. 도 3A는 훈련 세트에서의 유방암 대 양성을 제시한다. 도 3B는 검증 세트에서의 유방암 대 양성을 제시한다. 도 3C는 전체 세트에서의 유방암 대 양성을 제시한다.

본 발명은 유방암을 갖는 대상체를 확인하기 위해 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정된 바이오마커의 패널을 이용할 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커의 패널은 지질 바이오마커를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "바이오마커"는 생물계의 생리학적 상태의 지표로서 측정될 수 있는 임의의 생물학적 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 지질을 포함할 수 있다. 예시적인 지질은 리소포스파티딜콜린 (LPC), 포스파티딜콜린 (PC), 에테르-연결된 포스파티딜콜린 (ePC) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"측정하는 것" 또는 "측정"은 샘플 내에서 주어진 물질의 정성적 또는 정성적 농도 수준의 도출을 포함하여, 이러한 물질의 존재, 부재, 수량 또는 양 (유효량일 수 있음)을 평가하는 것, 또는 달리 대상체의 임상 파라미터의 값 또는 카테고리화를 평가하는 것을 의미한다. 대안적으로, 용어 "검출하는 것" 또는 "검출"이 사용될 수 있고, 본원에 기재된 것과 같은 모든 측정하는 것 또는 측정을 포괄하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 수득된 건강한 및/또는 병리학적 상태의 생물학적 유체, 조직 또는 세포의 샘플을 지칭한다. 이러한 샘플은 혈액, 기관지 세척액 유체, 객담, 타액, 소변, 양수, 림프액, 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플, 복막액, 뇌척수액, 유두 흡인물을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 세포 용해물, 용해된 세포, 세포 추출물 및 핵 추출물로부터의 상청액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전혈 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플로 추가로 가공된다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다.

바이오마커 패널

사용될 수 있는 바이오마커는 지질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 대상체로부터 수득된 유체 샘플로부터 검출될 수 있는, 대상체에서 순환하는 지질일 수 있다.

일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15종의 바이오마커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 10종 이하의 바이오마커를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 바이오마커 패널은 2, 3, 6 또는 7종의 바이오마커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 15종의 바이오마커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 바이오마커의 후보 풀로부터 최적화될 수 있다. 비제한적 예로서, 바이오마커 패널은 대상체가 유방암을 갖는지 여부를 결정하기 위해 최적화될 수 있다. 바이오마커 패널은 LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 군으로부터 선택된 15종의 후보 바이오마커로부터 시작하는 후보 바이오마커 패널을 사용하여 유방암과 양성 질환을 구별하기 위해 최적화될 수 있다.

바이오마커 패널 측정

바이오마커 패널의 측정은 일반적으로 복수의 지질 바이오마커의 정량적 측정에 관한 것이다. 대상체의 바이오마커 패널의 측정은 유방암이 없는 대상체와 비교 시 유방암을 갖는 대상체에서의 지질 농도의 차이를 검출한다. 각각의 개별 바이오마커의 농도는 유방암이 없는 대상체와 비교 시 유방암을 갖는 대상체에서 더 높거나 더 낮을 수 있다. 복수의 바이오마커의 패널은 단일 바이오마커에 비해 개선된 예측치를 제공한다.

바이오마커의 측정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 지질을 측정하는 방법은 질량 분광측정법에 대한 연성 이온화 기술, 예컨대 전기분무 이온화 (ESI) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI)를 포함한 분광측정 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 삼중 사중극자 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI-MS/MS)이 사용될 수 있다. 바이오마커의 패널로부터의 지질이 대상체에서 측정되고, 하기 기재된 대상체의 코호트로부터 수득된 바이오마커의 패널의 수준과 비교된다.

바이오마커 패널 측정의 분석

일부 실시양태에서, 대상체가 유방암을 갖는지 여부를 결정하는 방법은 바이오마커 패널 측정을 참조 프로파일과 비교하는 것에 기반하며, 이는 통계적 분석과 함께 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, SPSS 소프트웨어가 통계적 분석에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2원 논리적 회귀 분석이 선택된 지질 종의 진단 효율을 예측하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체를 군으로 분류하기 위해 통계적 알고리즘 (그 통계적 알고리즘을 구현하는 컴퓨터와 함께 사용됨)이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 통계적 알고리즘은 학습 통계적 분류기 시스템이다. 학습 통계적 분류기 시스템은 랜덤 포레스트 (RF), 분류 및 회귀 트리 (CART), 부스티드 트리, 뉴럴 네트워크 (NN), 서포트 벡터 머신 (SVM), 일반 카이-제곱 자동 상호작용 검출기 모델, 상호작용 트리, 다중적응형 회귀 스플라인, 기계 학습 분류기 및 그의 조합을 포함하는 비제한적 예의 목록으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 적어도 80%의 감수성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 적어도 80% 또는 적어도 85%의 양성 예측치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널은 적어도 80% 또는 적어도 85%의 음성 예측치를 갖는다.

치료 계층화

일부 실시양태에서, 바이오마커 패널의 분석은 대상체에 대한 치료 요법을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 패널에서의 1종 이상의 바이오마커의 측정은 치료를 시작할지, 동일한 치료를 계속할지 또는 대상체에 대한 치료 요법을 변형할지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널의 분석은 대상체가 유방암을 갖지 않는다는 것을 결정할 수 있고, 치료는 개시될 수 없다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널의 분석은 대상체가 유방암을 갖는다는 것을 결정할 수 있고, 추가의 시험이 개시될 수 있거나 치료가 시작될 수 있다. 치료는 화학요법, 방사선 요법, 생물학적 요법, 수술 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에게 투여되는 약물을 변화시키는 것, 기존 약물 치료 요법에 추가의 약물을 첨가하는 것, 투여량을 변화시키는 것 또는 다른 변화에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 패널 분석의 음성 결과를 갖는 대상체는, 예를 들어 6-12개월 내에 추적 시험을 위한 군으로 계층화될 수 있다.

결과

환자의 특징

초기 유방암 (0-II기)을 갖는 총 84명의 환자 및 양성 유방 질환을 갖는 110명이 본 발명자들의 연구에 포함되었다. 평균 연령은 유방암 군에서 57.7±12.0세, 양성 군에서 47.8±10.9세였다. 이들 환자 중에서, 유방암 군은 79명 (94%) 백인 및 5명 (6%) 비-백인을 가졌다. 양성 군에서는, 103명 (94%) 백인 및 7명 (6%) 비-백인이 존재하였다. 따라서, 본 발명자들의 연구에서 대부분의 환자가 백인이었다 (>90%). 유방암의 병기는 하기와 같았다: 15명 (18%) 환자는 0기였고, 58명 (69%) 환자는 I기였고, 11명 (13%) 환자는 II기였다. 상이한 부문으로부터의 샘플에 따라, 유방암 및 양성 샘플은 90명 환자의 훈련 세트 및 94명 환자의 검증 세트로 나뉘어졌다. 훈련 및 검증 세트 샘플은 대략 연령- 및 인종-매칭되었다. 상세사항은 표 1에 제시되었다.

지질 종의 지질 프로파일링

13종 부류의 인지질 및 1종 부류의 CE로부터의 367종의 지질 종을 포함한 혈장 지질 프로파일은 총 194개의 혈장 샘플 (유방암을 갖는 84개 및 양성 유방 질환을 갖는 110개)로부터의 지질체학에 의해 확인되었다. 지질 마이크로-추출 방법을 이용한 본 발명자들의 시험으로 인해, 0.0007 nmol/uL 미만의 지질 종 수준은 신뢰할 수 없을 가능성이 있는 것으로 간주되었다. 지질 종의 품질을 보증하기 위해, 본 발명자들은 40% 초과의 누락 데이터 또는 이상치 평균 발현을 갖는 지질을 제거하였다. 따라서, 367종의 지질 종은 191종의 지질 종으로 감소되었다. 예로서, 유방암을 갖는 환자 및 양성 유방 질환을 갖는 환자에 대해 C19:1 CE의 질량 스펙트럼이 도 1에 도시되었다.

유방암 및 양성 혈장 시편 둘 다로부터의 지질 종의 농도가 분석되었다. 훈련 세트에서, 평균 혈장 농도에서의 최대 유의차는 PC(38:3) (p = 2.50297E-08, 스튜던트 t-검정)였다. 유의한 배수 변화는 LPC (20:0) (배수-변화=4.08)였다. 검증 세트에서, 평균 혈장 농도에서의 최대 유의차는 PC(38:3) (p=5.70481E-11, 스튜던트 t-검정)였다. 유의한 배수 변화는 C 19:0 CE (배수-변화=4.39)였다. 전체 세트 (조합된 훈련 및 검증 세트)에서, 평균 혈장 농도에서의 최대 유의차는 PC(38:3) (p=1.00749E-17, 스튜던트 t-검정)였다. 유의한 배수 변화는 C 19:0 CE (배수-변화=3.73)였다. 이들 데이터는 혈장 지질 종이 유방암의 진단을 위한 바이오마커일 수 있다는 것을 나타냈다.

초기 유방암에 대한 바이오마커로서의 지질 종의 확인

훈련 세트에서 191종의 지질 종의 농도의 변화가 분석되었다. 스튜던트 t-검정의 p 값 및 각각의 지질 종의 농도의 평균의 배수-변화가 유방암 샘플과 양성 샘플 사이에서 계산되었다. 여과 조건 (p<0.05 및 배수 변화>1.5)에 따라, 단지 15종의 지질 종만이 유방암의 진단을 위한 바이오마커로서 선택되었다 (표 2). 이들 선택된 지질 종의 농도 분포가 도 2에 제시되었다. 이들 15종의 지질 종 중에는, 4종의 LPC, 6종의 PC, 2종의 ePC 및 3종의 CE 종이 존재하였다 (표 2). 양성 환자에서의 경우와 비교 시, 암 환자에서 LPC 및 CE의 2종 부류의 혈장 농도가 감소된 것으로 관찰된 반면, 다른 지질 종은 증가되었다 (표 2).

유방암에 대해 15종의 선택된 지질의 예측치를 시험하기 위해, 2원 로지스틱 회귀가 예측 모델을 구축하는데 사용되었다. 예측 모델에 따라, 본 발명자들은 유방암 환자를 양성 환자와 구별하는데 있어서 선택된 지질 종의 성능을 추가로 평가할 수 있었다. 본 발명자들은 단일 지질 종이 유방암 환자를 양성 환자와 구별하는데 있어서 우수한 진단 성능을 갖지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나, 이들 15종의 지질 종의 조합은 최고의 진단 성능을 가졌다. 이들 15종의 지질 종의 조합의 감수성, 특이성, 양성 예측치 (PPV) 및 음성 예측치 (NPV)는 각각 83.3%, 92.7%, 89.7% 및 87.9%였다. AUC는 0.926 (95% CI 0.869-0.982)이었다 (도 3A).

유방암의 진단에서 잠재적 바이오마커로서의 이들 15종의 지질 종을 추가로 검증하기 위해, 본 발명자들은 동일한 방법을 사용하여 검증 세트의 데이터를 분석하였다 (표 2). 유사한 결과가 검증 세트에서 발견되었다. 감수성, 특이성, PPV 및 NPV는 각각 81.0%, 94.5%, 91.9% 및 86.7%였다. AUC는 0.938 (95% CI 0.889-0.986)이었다 (도 3B). 전체 세트 (훈련 세트 및 검증 세트의 조합)에서, 감수성, 특이성, PPV 및 NPV는 각각 81.0%, 90.0%, 86.1% 및 86.1% (AUC 0.916, 95% CI 0.874-0.957)였다 (도 3C).

논의

유방암은 여성에서 매우 통상적이고 고도로 치명적이다. 유방촬영은 현재 유방암 스크리닝에서 사용되고 있으며, 감수성은 단지 54% 내지 77%이다 [20]. 대부분의 비정상적 유방촬영상은 생리학적 고통을 유발할 수 있는 고비용 유방 영상화 및 생검을 포함한 추가의 조사를 요구하는 가양성이다. 유방촬영의 한계로 인해, 양성 또는 악성으로서의 불확실한 미세석회화의 방사선학적 해석은 신뢰할 수 없을지도 모른다 [21]. 따라서, 특히 초기 암을 양성 병변과 구별하기 위한, 유방암의 진단에 대해 높은 정확도를 갖는 새로운 진단 기술이 임상 실시에서 여전히 필요하다.

지질은 티오에스테르의 탄소음이온계 축합 및/또는 이소프렌 단위의 탄소양이온계 축합에 의해 전적으로 또는 부분적으로 기원하는 소수성 또는 양친매성 소분자로 광범위하게 정의될 수 있다 [22]. 지질은 유방암을 포함한 여러 인간 질환에서 역할을 하는 것으로서 연루되어 왔다 [23]. 특히, 복합 극성 지질은 유방암 발생 및 전이를 포함한 종양성 과정에 참여할 수 있다 [16]. 본 발명자들의 연구에서, 15종의 지질 종이 유방암과 양성 환자 사이의 혈장 농도의 유의차를 나타내는 것으로 확인되었다. PC 및 ePC 부류의 혈장 농도는 유방암 환자에서 증가한 반면, 다른 것은 감소하였다. 이들 결과는 세포 대사의 조절 메카니즘에 의해 유발되었을 수 있다. 포유동물 세포의 막에서 발견된 주요 인지질로 공지된 PC는 유방암 세포에서 포스포리파제 A2 (PLA2)에 의해 매개되었다 [24]. 일부 연구는 PLA2가 유방암 세포에서 과다발현된다는 것을 보고한 바 있다 [25-27]. PC의 수준은 PLA2의 보다 높은 활성을 반영할 수 있다. ePC는 PC의 하위부류에 속하고, ePC는 Pl-3-키나제를 활성화시키며, 유사분열촉진 반응에 참여할 수 있다 [28]. LPC 및 CE는 PC로부터 유래되었다 [29]. LPC의 감소된 수준은 암 환자에서 활성화된 염증성 스테이터스와 연관되었다 [30]. LPC는 염증성 활성을 가질 뿐만 아니라 티로신 키나제를 포함한 신호전달 분자를 활성화시킨다 [31-33]. LPC의 그의 수용체에 대한 결합은 염증 및 세포 이동을 포함한 신호전달 경로를 조절할 수 있다 [31, 34-35]. LPC의 보다 낮은 수준은 유방암 환자에서 보다 높은 대사율을 반영할 수 있다. 유방암에서의 CE의 대사 효과는 부족하게 이해된 채로 남아있다. 그러나 인간 유방암에서 CE와 부족한 임상 결과 사이의 관계가 보고된 바 있다 [36]. 이들 연구는 이들 선택된 지질 종이 유방암의 진단을 위한 바이오마커로서 분류될 수 있다는 것을 나타냈다.

본 발명자들의 현재 데이터는 단일 혈장 지질 종이 유방암을 양성 환자와 구별하는데 있어서 잘 기능할 가능성이 없다는 것을 제시하였다. 그러나 선택된 지질 종의 조합은 훈련 세트, 검증 세트 및 전체 세트에서 제시된 바와 같이, 높은 감수성, 특이성, PPV, NPV 및 AUC로 유방암 예측에 대한 높은 진단 값을 가졌다. 게다가, 유방암에 대한 15종의 선택된 지질 종의 조합의 특이성 (훈련 세트: 92.7%, 검증 세트: 94.5%)은 유방촬영상보다 더 높았으며, 이는 이들 지질 마커가 비정상적 유방촬영상을 갖는 여성 중에서 유방암의 진단을 위한 잠재적 바이오마커일 것임을 시사한다.

본 발명자들이 알기로는, 이것은 거대 샘플 세트에서 초기 유방암을 양성 병변과 구별하는데 있어서의 혈장 지질 바이오마커에 대한 최초 연구이다. 본 발명자들의 목표는 스크리닝 유방촬영과 함께 동반 진단 도구로서 신뢰할 만하게 사용될 수 있는 순환 지질 서명을 확인하여, 불필요한 추적 조사, 특히 침습적 생검의 횟수를 감소시키는 것이다. 삼중 사중극자 LC-ESI-MS/MS를 사용하여, 지질 프로파일링은 신속한 높은 효율 및 고처리량 검출을 얻을 수 있다. 시험은 단지 3uL의 혈장만을 요구하였으며, 이는 최소 침습적 절차였다. 생물통계적 분석 후에, 고도 감수성 및 특이적 예측 모델이 유방암의 진단을 위해 획득되었다. 전반적 지질 프로파일링의 검출 비용은 높다. 그러나, 3-15종의 혈장 지질 종의 패널의 측정은 임상 실험실에서 실행가능할 수 있다. 그 이유로, 선택된 지질 종은 진단 바이오마커로서 뿐만 아니라 스크리닝 바이오마커로서의 것이다.

본 발명자들의 연구에는 일부 한계가 있었다. 첫번째로, 양성 군에는 이러한 기관에서 진단된 많은 양성 질환, 예컨대 증식증, 섬유선종, 낭 및 일부 상세불명 소견이 포함되었다. 각각의 양성 질환에 대한 소형 샘플 크기에 따라, 본 발명자들은 하위군 분석을 수행할 수 없었다. 두번째로, 본 발명자들의 연구에서 대부분의 환자가 백인이었다 (>90%). 세번째로, 종양 크기에 대한 불완전한 정보로 인해, 본 발명자들은 지질 종과 종양 크기 사이의 상관관계 분석을 수행할 수 없었다.

결론

본 연구는 유방암의 진단을 위한 패널로서 지질 종의 조합을 평가하였다. 본 발명자들의 발견은 지질 프로파일에 대한 생물통계적 분석을 사용하는 절차가 양성과 악성 유방암 사이의 환자를 분류하는 고도 감수성 및 특이적 예측 모델을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 지질 프로파일이 유방암에 대한 진단 바이오마커를 조사하는 유망한 통로일 수 있다는 것을 제시하였다.

물질 및 방법

환자 및 혈장 샘플 수집

훈련 코호트는 39개의 유방암 및 51개의 양성 샘플을 포함하였으며, 이를 러시 유방암 저장소(Rush Breast Cancer Repository)로부터 수득하였다. 환자는 하기 기준으로서 선택하였다: (1) 모든 환자는 병리상태에 의해 진단 및 확인되었다; (2) 유방암을 갖는 환자는 임상 병기결정 방법에 따라 초기 (0, I, II기)였다; (3) 환자는 지질 대사, 예컨대 고지혈증, 당뇨병 및 다른 암에 영향을 미칠 수 있는 어떠한 다른 질환도 갖지 않았다; (4) 모든 환자는 여성이었다; (5) 환자 중 아무도 수술전 아주반트 화학요법 또는 방사선요법을 받지 않았다. 유방 양성 병변은 이러한 기관에서 진단된 증식증, 섬유선종, 낭 및 일부 상세불명 소견으로 정의된다. 대조군 혈액 샘플은 악성 질환의 병력이 없고 염증성 상태가 없는 건강한 여성으로부터 수집하였다.

이들 기준에 따라, 혈장 샘플을 협동 인간 조직 네트워크(The Cooperative Human Tissue Network; CHTN) 서부 지부 및 남부 지부로부터 초기 유방암 (0-II기)을 갖는 45명의 환자 및 양성 유방 질환을 갖는 59명의 환자로부터 수집하였다. 모든 암 환자 조직병리학 결과는 종양의 외과적 절제 및 임상조직병리학적 특징에 의해 확인하였고, 종양 병기는 조직생검 결과에 기반하여 평가하였다. 어떠한 수술전 화학요법 또는 방사선요법도 본 연구에 포함된 암 환자에 적용하지 않았다. 모든 이들 암, 양성 및 대조군 샘플은 표 1에 제시된 바와 같이 대략 연령- 및 인종-매칭되었다. 러시 유니버시티 메디칼 센터(Rush University Medical Center) IRB는 모든 대상체 정보 및 생체시편을 사용하는 것에 대한 서면 동의와 함께 연구에 대한 승인을 제공하였다.

혈장 샘플의 수집 전에, 환자는 적어도 12시간 단식하였다. 간략하게, 혈장 단리를 위해, 혈액을 EDTA를 함유하는 바큐테이너(Vacutainer) 튜브 (BD, 뉴저지주 프랭클린 레이크스) 내로 수집하고, 정맥천자 2시간 내에 4℃에서 10분 동안 2,600g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 동일한 방식으로 두 번째로 원심분리하고, 혈장을 -80℃에서 0.5 mL 분취물로 저장하였다. 모든 혈장 샘플을 드라이 아이스와 함께 지질 분석을 위해 캔자스 지질체학 연구 센터(Kansas Lipidomics Research Center; KLRC)로 수송하였다.

LC-ESI-MS/MS 지질 프로파일링

블리(Bligh) 및 다이어(Dyer)의 방법 [37]에 따라, 지질을 일부 변형을 갖는 혈장으로부터 추출하였다. 3μL의 혈장을 각각의 샘플 분석에 사용하였다. 각각의 샘플을 검출 전 단백질을 펠렛화하기 위해 테이블 튜브 유닛 상에서 실온에서 20분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하였다. 모든 지질 종의 정확한 확인을 수득하기 위해, 정확한 양의 내부 표준을 첨가하였다. 각각의 부류의 지질 종에 대해 2종의 내부 표준을 사용하였다. 원심분리한 후에, 지질 추출물을 HPLC 주입을 위해 용매 중에 재용해시켰다. 용매는 물 (μL) 중 클로로포름/메탄올/300mM 아세트산암모늄의 비율이 360/840/44였다. 모든 사용된 용매는 HPLC 등급이었다.

지질 프로파일링을 삼중 사중극자 LC-ESI-MS/MS (API 4000, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)에 의해 수행하였으며, 이는 구조 확인을 위해 충돌-유도 해리 (CID)에 기반하였다. 샘플 도입은 전기분무 이온화 (ESI) 공급원의 연속 주입이다. 이는 스펙트럼 혼잡에 의해 유발된 이온화 억제 효과를 감소시킬 수 있었다 [38]. 복합 지질의 ESI는 CID에 의해 단편을 생성할 수 있는 단일 하전 이온을 생성한다. LC-ESI-MS/MS의 보조로, 지질은 그의 극성 머리 및 그의 쇄 길이에 의해 구별될 수 있다.

지질 데이터 획득을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [39-42]. 2종 유형의 스캔을 사용하여 극성 지질 프로파일을 수득하였다: 전구체 및 중성 손실 스캔. 한 부류에서의 지질 종은 통상적인 머리기 단편의 전구체로서 또는 중성 손실을 겪는 이온으로서 확인된다. 맞춤 스크립트 및 어플라이드 바이오시스템즈 애널리스트 소프트웨어를 크로마토그래피 피크의 분해에 사용하였다. 질량 여과, 정렬, 내부 표준 정규화 후에, 데이터를 nmol/μL의 단위로 정량화하였다.

통계 분석

통계적 분석을 위해 SPSS 17.0 소프트웨어를 사용하였다. 2종의 혈장 샘플 세트 사이의 차이를 스튜던트 t-검정에 의해 평가하였다. 모든 p 값은 양측 검정으로부터 유래되었다. p 값이 0.05 미만이고 배수-변화가 1.5 초과일 때 차이가 통계상 유의한 것으로 간주하였다.

추가의 통계적 분석을 SPSS 소프트웨어로 수행하였다. 2원 논리적 회귀 분석에 따라, 본 발명자들은 선택된 지질 종의 진단 효율을 예측할 수 있었다. "엔터(Enter)" 방법을 선택하여 지질의 진단 정확도를 추정하였다. 수신자 작동 특징 (ROC) 곡선을 플롯팅하여 감수성 및 특이성의 관계를 평가하였다. ROC 곡선하 면적 (AUC)과 95% 신뢰 구간 (CI)을 또한 계산하였다. 윈도우용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 5에 의해 산점도를 생성하였다.

상기 도면 및 개시내용은 예시적인 것으로 의도되며 포괄적이 아니다. 본 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 많은 변경 및 대안을 시사할 것이다. 모든 이러한 변경 및 대안은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 구체적 실시양태에 대한 다른 등가물을 인식할 수 있으며, 상기 등가물은 또한 첨부된 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

참고문헌

Claims (16)

1. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
   생물학적 샘플에서, LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계이며, 여기서 측정은 패널에서 적어도 5종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 단계;
   적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널로부터의 측정을, 유방암을 갖지 않는 대조군 코호트로부터의 LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 참조 프로파일과 비교하는 단계;
   암을 갖지 않는 대조군 코호트로부터의 참조 프로파일에서의 수준과 비교 시 생물학적 샘플에서 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에서의 수준의 변화를 확인하여 대상체가 유방암을 갖는지를 확인하는 단계
   를 포함하는, 대상체에서 유방암을 검출하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 바이오마커의 패널이 15종의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 바이오마커의 패널에서 적어도 1종의 바이오마커의 수준이 참조 패널에서 상응하는 바이오마커의 수준에 비해 감소된 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 참조 패널에서 상응하는 바이오마커의 수준에 비해 감소된, LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), C19:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 패널로부터 선택된 적어도 1종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것이 대상체가 유방암에 대한 위험이 있음을 확인하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 바이오마커의 패널에서 적어도 1종의 바이오마커의 수준이 참조 패널에서 상응하는 바이오마커의 수준에 비해 증가된 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 참조 패널에서 상응하는 바이오마커의 수준에 비해 증가된, PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), 및 ePC(38:3)를 포함하는 패널로부터 선택된 적어도 1종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것이 대상체가 유방암에 대한 위험이 있음을 확인하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 바이오마커 패널이 적어도 80%의 감수성을 갖는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 바이오마커 패널이 적어도 80%의 특이성을 갖는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 바이오마커 패널이 적어도 80%의 양성 예측치를 갖는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 바이오마커 패널이 적어도 80%의 음성 예측치를 갖는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI-MS/MS)을 사용하여 바이오마커 패널을 측정하는 것을 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 전구체 및 중성 손실 스캔을 사용하여 극성 지질 프로파일을 수득하는 것을 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장을 포함하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 화학요법 또는 방사선요법 전에 수집되는 것인 방법.
15. 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플에서, LPC(18:3), LPC(20:2), LPC(20:1), LPC(20:0), PC(32:1), PC(34:4), PC(38:3), PC(40:5), PC(40:3), PC(44:11), ePC(32:2), ePC(38:3), C10:1 CE, C19:0 CE, 및 C20:0 CE를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 5종의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계이며, 측정은 a)-o):
    a) 생물학적 샘플에서 LPC(18:3)의 수준을 측정하는 것;
    b) 생물학적 샘플에서 LPC(20:2)의 수준을 측정하는 것;
    c) 생물학적 샘플에서 LPC(20:1)의 수준을 측정하는 것;
    d) 생물학적 샘플에서 LPC(20:0)의 수준을 측정하는 것;
    e) 생물학적 샘플에서 PC(32:1)의 수준을 측정하는 것;
    f) 생물학적 샘플에서 PC(34:4)의 수준을 측정하는 것;
    g) 생물학적 샘플에서 PC(38:3)의 수준을 측정하는 것;
    h) 생물학적 샘플에서 PC(40:5)의 수준을 측정하는 것;
    i) 생물학적 샘플에서 PC(40:3)의 수준을 측정하는 것;
    j) 생물학적 샘플에서 PC(44:11)의 수준을 측정하는 것;
    k) 생물학적 샘플에서 ePC(32:2)의 수준을 측정하는 것;
    l) 생물학적 샘플에서 ePC(38:3)의 수준을 측정하는 것;
    m) 생물학적 샘플에서 C10:1 CE의 수준을 측정하는 것;
    n) 생물학적 샘플에서 C19:0 CE의 수준을 측정하는 것;
    o) 생물학적 샘플에서 C20:0 CE의 수준을 측정하는 것
    으로부터의 적어도 5종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 단계
    를 포함하는, 대상체에서 유방암을 검출하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 15종의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.

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