CN113567584A - 一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物及试剂盒。本发明提供的用于早期贲门癌诊断的标志物为胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中的至少一种，该标志物的检测试剂能够用于制备贲门癌筛查产品。本发明还提供一种用于贲门癌筛查的试剂盒，该试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂，检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱‑质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。本发明通过检测人血清中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的表达水平，可以有效检测贲门癌，其检测灵敏度高达91.94%，特异性达到了98.28%，可用于贲门癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物及试剂盒。

背景技术

贲门癌是我国北方最常见的上消化道恶性肿瘤之一，其定义为食管胃交界线下约2cm范围内的腺癌，又称食管-胃交界腺癌。历史上，我国曾把贲门癌纳入食管癌，上世纪八十年代以后，按照病理分类又把贲门癌划分到胃癌，但贲门癌有相对独立的病因、临床表现和病理，应该当做一种独立的肿瘤用于临床和研究。

癌症的发病是多种因素参与、涉及多次病变的过程，贲门癌也不例外。研究显示，贲门癌的发生主要与环境和遗传因素有关。癌症的分子生物学研究目前已经取得很大的进步，癌基因和抑癌基因的发现成为攻克癌症道路上的重要成果，研究发现各种因素导致癌基因、抑癌基因和细胞凋亡基因的表达改变，破坏了贲门粘膜上皮细胞增殖和凋亡的动态平衡，导致了贲门癌的发生。早期发现肿瘤是治疗肿瘤、提高肿瘤术后生存率的重要途径之一，早期贲门癌患者术后年生存率可达90％，而中期和晚期患者预后相对较差。所以，贲门癌患者预后的决定性因素就是早期发现、早期诊断、早期治疗。现代医学科学的进步和先进的医疗手段对于早期阶段的肿瘤，特别是原位肿瘤的治疗具有显著的疗效。因此，现代医学已经把重点聚焦于肿瘤的早期发现，使肿瘤在发展到晚期之前得到有效地治疗。人们期望探索和建立一种敏感性高、特异性强的贲门癌早期诊断指标以及贲门癌预后预测指标，并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。

随着医学科技的高速发展，越来越多的先进医疗器械被用于贲门癌的检查。目前临床贲门癌的检测方法主要有临床检查、胃镜检查、影像学检查、病理学检查和血清学检查。胃镜检查和病理学检查有创；影像学检查的灵敏度有限，且价格贵；血清学检查方法简便，价格低，患者容易接受，因此寻找贲门癌相关血清标志物十分重要。血清标志物是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。理想的血清标志物应有以下特征：(1)灵敏度高；(2)特异性好；(3)能对肿瘤进行定位；(4)与病情严重程度、肿瘤大小或分期有关；(5)能监测对肿瘤治疗的效果；(6)监测肿瘤的复发；(7)预测肿瘤的预后。

早期发现是降低贲门癌的发病率和死亡率的关键；早期发现指的是对无症状重度癌前病变患者和早期癌患者。因此，对于血液中肿瘤标志物的筛查与发现变的至关重要。血清各代谢物水平与食管贲门癌的生长浸润等生物学行为密切相关，较高的代谢物水平提示肿瘤较大、浸润较深及分期较晚，且肿瘤可切除性明显降低，可为食管贲门癌的临床诊治提供有价值的信息。通过检测各指标胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸3种代谢物的早期发现与正常人血清对比的升高数值能更准确的发现其特征也为将来对贲门癌的进一步研究提供思路。

发明内容

针对现有技术总存在的问题和不足，本发明的目的之一在于提供一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供贲门癌筛查的标志物的检测试剂在制备贲门癌筛查产品中的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于贲门癌筛查的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物，所述标志物为胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中的至少一种。

根据上述的标志物，优选地，所述标志物为血清标志物。

第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述标志物的检测试剂在制备用于贲门癌筛查产品中的应用。

根据上述逇应用，优选地，所述产品的检测样本为血清。

根据上述逇应用，优选地，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。

根据上述逇应用，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。

根据上述逇应用，优选地，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

第三方面，本发明提供了一种用于贲门癌筛查的试剂盒，所述试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂，所述标志物为胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中的至少一种。

根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有上述第一方面所述标志物的标准品和内标。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。

根据上述的试剂盒，优选地，所述内标为L-2-氯苯丙氨酸。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：

(1)本发明通过代谢组学的方法发现胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸这三种物质能够用于贲门癌诊断检测，通过检测人血清中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的表达水平，可以有效检测贲门癌，尤其是早期贲门癌；经验证，本发明单独采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中任意一个标志物进行贲门癌筛查时，ROC曲线的AUC值均在0.7以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于贲门癌筛查的标志物可用于贲门癌的早期筛查。

(2)本发明将胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸这三种标志物作为一个组合用于早期贲门癌筛查检测时，其检测灵敏度高达91.94％(即早期贲门癌患者中应用这三个标志物进行诊断时被正确的诊断为早期贲门癌的比率为91.94％)，特异度达到了98.28％(即非贲门癌患者中应用这三个标志物进行诊断时确定为未患贲门癌者的比率为98.28％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期贲门癌的检出率，而且，对贲门癌的检出率远高于现有临床内镜筛查贲门癌的检出率(2％-3％)，可用于贲门癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查，同时也为实现贲门癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，有利于无症状贲门癌高危人群早期发现，从而大大降低了贲门癌患者的死亡率，为贲门癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明用于贲门癌筛查的标志物为血清检测标志物，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可在早期获得贲门癌的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(4)本发明用于贲门癌筛查的试剂盒的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸在正常对照组与贲门癌组的含量结果图，其中，a为胞嘧啶，b为十六基二酸，c为邻甲氧基苯甲酸；

图2为采用胞嘧啶诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图3为采用十六基二酸诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图4为采用邻甲氧基苯甲酸诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图5为采用胞嘧啶、十六基二酸组合诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图6为采用胞嘧啶、邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图7为采用十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线；

图8为采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分健康受试者与贲门癌患者的ROC曲线。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：贲门癌血清差异代谢标志物的筛选

一、实验样本

按照严格的实验筛选和排除标准收集安阳肿瘤医院经过年龄与性别匹配的60例贲门癌患者(贲门癌组)和60例健康受试者(正常对照组)用于研究，按照以下的标准进行检测。

健康受试者与贲门癌患者的入组标准如下：

健康受试者的入组标准：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病。无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内。

贲门癌患者的入组标准：呕血、便血。吞咽异物感。吞咽滞留或咽下困难。胃镜是诊断贲门癌的金标准，以此来对贲门癌与健康人进行区分。

二、实验方法

1、血清样本的采集及储存

采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm的速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。

2、测定血清中目标代谢物的相对含量

(1)检测仪器：Agilent 1290高效液相色谱仪、安捷伦6545四极杆-飞行时间质谱联用仪测定。

(2)主要试剂：

甲醇及乙腈(UPLC纯)购于美国merk公司，色谱级甲酸及乙酸铵购于美国ROE公司；去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制备；标准品包括胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸购于美国Sigma-Aldrich公司。

(3)UPLC-Q/TOF-MS检测：

a)色谱条件：色谱柱：Waters BEH C8(100mm×2.1mm I.D.,1.7μm)；正离子流动相：乙腈(B)-水(A)溶液(均含0.1％甲酸)；负离子流动相：甲醇(B)-水(A)溶液(均含10mmol/L醋酸铵)；流速：0.4mL/min；柱温：50℃。流动相比例：0-1min，5％B；1-4min，5％-30％B；4-9min，30％-90％B；9-10min，90％-100％B；10-12min，100％B。运行时间为12分钟，后运行时间为3分钟。

b)质谱条件：碎片电压：100V；雾化气体：35psig；毛细管电压：3500V；干燥气体流量：10L/min；干燥气体温度：300℃。

c)样品的处理：取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇复溶液100μL进行复溶，L-2-氯苯丙氨酸终浓度分别为100ng/mL、1μg/mL，分别作为正负离子模式检测样本。复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。

3、数据处理方法

(1)数据的前处理

基于UPLC-Q/TOF-MS得到的数据，在R软件平台下采用XCMS程序代码进行峰的提取，对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间Rt，质荷比m/z)、观测和峰强的三维可视化矩阵，将此数据矩阵导入SIMCA-P软件(版本13.0)进行多变量统计分析。

(2)多变量统计分析

为了考察贲门癌组与正常对照组相比代谢的变化，首先对所有变量采用无监督的主成分分析(PCA)，观察各组数据的聚类情况并去除离群值，最后采用正交偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型进行有监督的数据分析，放大组间差异，以获得最显著的组间分离。

(3)基UPLC-Q/TOF-MS检测贲门癌组和正常对照组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定：

采用贲门癌组和正常对照组PLS-DA模型下的VIP值与单因素统计分析的P值相结合，VIP>1.0且P<0.05的变量认为有显著差异性，有显著差异性的变量认为是差异代谢生物标志物。筛选出的差异变量，需要归属其所代表的生物标志物。基于UPLC-Q/TOF-MS技术的代谢物鉴定主要是通过代谢物谱库进行匹配：在UPLC-Q/TOF-MS总离子流图上找到差异变量的质谱图，将差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如HMDB(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)和KEGG(http://www.kegg.jp)，初步鉴定上述差异代谢物的结构，最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，确定差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液，通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。

三、实验结果

按照上述实验方法，最终鉴定出3个区分贲门癌组和正常对照组的差异代谢物，具体如表1所示。基于胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸3种区分贲门癌组和正常对照组的差异代谢物在癌症患者血清中表达和正常血清中的表达的趋势如图1所示。由图1可知，与正常对照组相比，贲门癌组患者血清中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的含量显著上调。

表1基于UPLC-Q/TOF-MS检测贲门癌组和正常对照组差异代谢物统计数据结果

差异代谢物	VIP	P值
			胞嘧啶	1.2	0.033
十六基二酸	1.4	0.021
			邻甲氧基苯甲酸	1.3	0.037

实施例2：差异代谢物诊断区分贲门癌患者和健康人的能力评估

(1)单个差异代谢物诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

基于实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(60例贲门癌患者)和正常对照组(60例健康受试者)血清样本中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的含量数据进行分析，采用受试者工作曲线(ROC曲线)来评估每一种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的能力。胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸单独诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线分别如图2、图3、图4所示。根据ROC曲线统计各差异代谢物的ROC曲线的曲线下面积AUC、灵敏度和特异度，结果如表2所示。

表2三种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的AUC

差异代谢物	AUC	灵敏度	特异度
				胞嘧啶	0.7372	78.33％	71.67％
十六基二酸	0.7481	75.00％	73.33％
				邻甲氧基苯甲酸	0.7978	83.33％	73.33％

ROC曲线的曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。由表2和图2、图3、图4可知，胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸三种标志物单独用于区分贲门癌患者和健康受试者的ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，表明胞嘧啶、十六基二酸或邻甲氧基苯甲酸能够单独诊断区分贲门癌患者和正常人，且具有较好的准确性。

进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的代谢物相对含量为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，具体如表3所示。

表3三种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的约登指数和最佳截断值

差异代谢物	约登指数	最佳截断值
			胞嘧啶	0.5000	0.5000
十六基二酸	0.4833	0.4834
			邻甲氧基苯甲酸	0.5666	0.5833

(2)多个差异代谢物组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

1)：胞嘧啶和十六基二酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(60例贲门癌患者)和正常对照组(60例健康受试者)血清样本中胞嘧啶和十六基二酸的相对含量作为两个变量(设A列胞嘧啶相对含量的各数值，B列十六基二酸相对含量的各数值)，联合诊断贲门癌的疾病。列表即A和B列均为血液指标，数值变量；金标准为疾病状态，分类变量：0为无病，1为有病。以金标准列与A和B列联合进行logistic回归分析。此时A和B数列后又多了一列即A和B通过logistic产生的预测概率值数列，此列可综合反应A和B的诊断能力，此时我们又可以用Medcalc软件中的logistic产生的预测概率值数列与金标准数列即可绘制出ROC曲线并计算曲线下面积。也可得出灵敏度和特异度，ROC曲线如图5所示。由ROC曲线可知，胞嘧啶和十六基二酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.9640，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值0.8365。

2)：胞嘧啶和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(60例贲门癌患者)和正常对照组(60例健康受试者)血清样本中胞嘧啶和十六基二酸的相对含量作为两个变量(设A列胞嘧啶相对含量的各数值，C列甲氧基苯甲酸相对含量的各数值)，联合诊断贲门癌的疾病。列表即A和C列均为血液指标，数值变量；金标准为疾病状态，分类变量：0为无病，1为有病。以金标准列与A和C联合列进行logistic回归分析。此时A和C数列后又多了一列即A和C通过logistic产生的预测概率值数列，此列可综合反应A和C的诊断能力，此时我们又可以用Medcalc软件中的logistic产生的预测概率值数列与金标准数列即可绘制出ROC曲线并计算曲线下面积。也可得出灵敏度和特异度，ROC曲线如图6所示。由ROC曲线可知，胞嘧啶和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.9780，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值0.8826。

3)：十六基二酸和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(60例贲门癌患者)和正常对照组(60例健康受试者)血清样本中胞嘧啶和十六基二酸的相对含量作为两个变量(设B列十六基二酸相对含量的各数值，C列邻甲氧基苯甲酸相对含量的各数值)，联合诊断贲门癌的疾病。列表即B和C列均为血液指标，数值变量；金标准为疾病状态，分类变量：0为无病，1为有病。以金标准列与B和C联合列进行logistic回归分析。此时B和C数列后又多了一列即B和C通过logistic产生的预测概率值数列，此列可综合反应B和C的诊断能力，此时我们又可以用Medcalc软件中的logistic产生的预测概率值数列与金标准数列即可绘制出ROC曲线并计算曲线下面积。也可得出灵敏度和特异度，ROC曲线如图7所示。由ROC曲线可知，十六基二酸和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.9650，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值0.8815。

4)：胞嘧啶、十六基二酸和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(60例贲门癌患者)和正常对照组(60例健康受试者)血清样本中胞嘧啶和十六基二酸的相对含量作为三个变量(设A列胞嘧啶相对含量的各数值，B列十六基二酸相对含量的各数值，C列邻甲氧基苯甲酸相对含量的各数值)，联合诊断贲门癌的疾病。列表即A、B和C均为血液指标，数值变量；金标准为疾病状态，分类变量：0为无病，1为有病。以金标准列与A、B和C联合进行logistic回归分析。此时A、B和C数列后又多了一列即A、B和C通过logistic产生的预测概率值数列，此列可综合反应A、B和C三列组合的诊断能力，此时我们又可以用Medcalc软件中的logistic产生的预测概率值数列与金标准数列即可绘制出ROC曲线并计算曲线下面积。也可得出灵敏度和特异度，ROC曲线如图8所示。由ROC曲线可知，胞嘧啶、十六基二酸和邻甲氧基苯甲酸组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.9840，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值0.9022。

将上述单个、多个差异代谢物组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线AUC值、灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值进行统计，具体如表4所示。

表4不同差异代谢物及其组合用于诊断区分贲门癌患者和正常人的AUC值

由表4可知，与单标志物相比，采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中两种或三种组合标志物联合诊断区分贲门癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC明显高于单标志物诊断；当采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸三种标志物联合诊断区分贲门癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到最大为0.9840，且贲门癌诊断的灵敏度也达到了最高，说明三个标志物联合时诊断效果最佳。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着标志物组合数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明3种标志物组合用于诊断贲门癌的方法具有较好的诊断价值。

实施例3：三种差异代谢物在贲门癌筛查中的应用

1、血清样本的采集

收集河南地区及安阳市肿瘤医院，按照严格的筛选和排除标准的120例健康受试者(正常对照组)和120例贲门癌患者(贲门癌组)。

健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内。

贲门癌患者的入组标准为：经过内镜确定和组织病理学证实的贲门癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。

2、实验方法

(1)血清样本的采集及储存：

采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm的速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。

3、实验及分析方法

按照实施例1所述的UPLC-Q/TOF-MS实验方法对120例健康受试者(正常对照组)和120例贲门癌患者(贲门癌组)血清进行三种代谢物(胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸)的定性与定量测定。

其中，单独采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸用于贲门癌诊断时，根据血清样本中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的含量与实施例2计算得到的对应差异代谢物的最佳截断值大小判断样本的阴性与阳性，血清样本中差异代谢物的含量高于最佳截断值，则判断为贲门癌患者，反之，则判断为正常人。

用胞嘧啶、十六基二酸二种代谢标志物组合用于贲门癌诊断时，将血清样本中胞嘧啶、十六基二酸含量代入实施例2相同的方法得到胞嘧啶、十六基二酸的组合时的预测概率值，然后根据预测概率值与实施例2对应的组合诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若预测概率值高于最佳截断值0.8365，则判断为贲门癌，反之，则判断为正常人。

用胞嘧啶、邻甲氧基苯甲酸二种代谢标志物组合用于贲门癌诊断时，将血清样本中胞嘧啶、邻甲氧基苯甲酸含量代入实施例2相同的方法得到胞嘧啶、邻甲氧基苯甲酸的组合时的预测概率值，然后根据预测概率值与实施例2对应的组合诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若预测概率值高于最佳截断值0.8826，则判断为贲门癌，反之，则判断为正常人。

用十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸两种代谢标志物组合用于贲门癌诊断时，将血清样本中十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸含量代入实施例2相同的方法得到十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的组合时的预测概率值，然后根据预测概率值与实施例2对应的组合诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若预测概率值高于最佳截断值0.8815，则判断为贲门癌，反之，则判断为正常人。

若采用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸三种代谢标志物组合用于贲门癌诊断时，将血清样本中胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸含量代入实施例2相同的方法得到胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸的组合时的预测概率值，然后根据预测概率值与实施例2对应的组合诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若预测概率值高于最佳截断值0.9022，则判断为贲门癌，反之，则判断为正常人。

4、检测结果

检测结果如表5所示。

表5差异代谢物及其组合诊断贲门癌的结果

由表5可知，单个代谢物、多个代谢物组合都可应用于贲门癌的筛查，其阳性预测值均能够达到90％以上，阴性预测值也能够达到70％以上；而且，胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸三种代谢标志物联合进行贲门癌诊断时，其阳性预测值和阴性预测值均达到了最高，分别为98.18％、90.77％。由此可见，使用胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸三种代谢标志物联合诊断贲门癌的效果最佳。

实施例4：基于本发明的代谢标志物的贲门癌筛查试剂盒的制备

基于本发明的筛选得到的三个与贲门癌相关的代谢标志物，设计了贲门癌筛查试剂盒，该试剂盒包括如下成分：

标志物的标准品：胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中的至少一种，该试剂盒可以包含其中一种、两种或者三种代谢标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当包含三种代谢标志物的标准品时，可以将三个标志物的标准品单独封装，也可以将三个标志物的标准品混合制成混合物封装。

内标：L-2-氯苯丙氨酸

试剂盒的使用过程为：收集受试者血清于-80℃冰箱冻存，实验前将血清样本在4℃冰箱中解冻后，取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇复溶液100μL进行复溶，复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。UPLC-Q/TOF-MS检测是按照实施例1的UPLC-Q/TOF-MS仪器设定方法对处理后的血清样本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。

使用此贲门癌检测试剂盒时，建议同时检测三个标志物，以进一步提高检测效能。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种基于血清代谢组学的贲门癌筛查的标志物，其特征在于，所述标志物为胞嘧啶、十六基二酸、邻甲氧基苯甲酸中的至少一种。

2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备用于贲门癌筛查产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

7.一种用于贲门癌筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述标志物的检测试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法或高效液相色谱-质谱联用法。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有权利要求1所述标志物的标准品和内标。

Images