CN113433239A

CN113433239A - 一种用于贲门癌诊断的标志物及试剂盒

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Publication number: CN113433239A
Application number: CN202110710865.7A
Authority: CN
Inventors: 王立东; 谢叶真; 李志强; 徐瑞华; 魏梦霞; 韩文莉; 雷玲玲; 赵学科; 宋昕; 王盼盼; 杨苗苗; 胡景峰; 钟侃; 王苒
Original assignee: Huixian Third People's Hospital; First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: Huixian Third People's Hospital; First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-09-24
Also published as: CN116297938A

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于贲门癌诊断的标志物及试剂盒。本发明提供的用于贲门癌诊断的标志物为3,4‑Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5‑Anhydro‑D‑Glucitol、3‑Methylxanthine中的至少一种，该标志物的检测试剂能够用于制备贲门癌诊断产品。本发明还提供一种用于贲门癌诊断的试剂盒，该试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂，检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱‑质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。本发明通过检测人血清中3,4‑Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5‑Anhydro‑D‑Glucitol、3‑Methylxanthine的表达水平，可以有效检测贲门癌，其检测灵敏度高达90.0%，特异性达到了91.0%，可用于贲门癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于贲门癌诊断的标志物及试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于贲门癌诊断的标志物及试剂盒。

背景技术

贲门癌是我国北方最常见的上消化道恶性肿瘤之一，其定义为食管胃交界线下约2cm范围内的腺癌，又称食管-胃交界腺癌或贲门腺癌。历史上，我国曾把贲门癌纳入贲门癌，上世纪八十年代以后，按照病理分类又把贲门癌划分到胃癌，但贲门癌有相对独立的病因、临床表现和病理，应该当作一种独立的肿瘤用于临床和研究。

癌症的发病是多种因素参与、涉及多次病变的过程，贲门癌也不例外。研究显示，贲门癌的发生主要与环境和遗传因素有关。癌症的分子生物学研究目前已经取得很大的进步，癌基因和抑癌基因的发现成为攻克癌症道路上的重要成果，研究发现各种因素导致癌基因、抑癌基因和细胞凋亡基因的表达改变，破坏了贲门粘膜上皮细胞增殖和凋亡的动态平衡，导致了贲门癌的发生。早期发现肿瘤是治疗肿瘤、提高肿瘤术后生存率的重要途径之一，早期贲门癌患者术后年生存率可达90％，而中期和晚期患者预后相对较差。所以，贲门癌患者预后的决定性因素就是早期发现、早期诊断、早期治疗。现代医学科学的进步和先进的医疗手段对于早期阶段的肿瘤，特别是原位肿瘤的治疗具有显著的疗效。因此，现代医学已经把重点聚焦于肿瘤的早期发现，使肿瘤在发展到晚期之前得到有效地治疗。

目前，贲门癌的最可靠的诊断方法仍为胃镜取活组织检查，或依靠X线造影、CT扫描等，此类检查对患者创伤较大，对仪器设备的要求也较高。适用于贲门癌预测的标志物主要有血清癌胚抗原(CEA)等，但经日渐广泛应用及进一步分析，发现在胃癌(49％～60％)、肺癌(52％～77％)、乳癌(30％～50％)，胰腺(64％)、甲状腺(60％)及膀胱等肿瘤亦存在CEA，检测缺乏特异性。人们期望探索和建立一种敏感性高、特异性强的贲门癌早期诊断指标并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。近年来有关研究表明，肿瘤细胞代谢异常主要表现在糖代谢、核苷代谢、氮基酸代谢及脂代谢等，其代谢产物可在体液中检测分析，因此，小分子代谢组学在贲门癌的早期诊断与治疗中，具有重要意义。3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine是贲门癌患者的血液中的代谢物，这些代谢物与癌症的发病情况有着密切的关系，现已发现多种癌症(非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等)患者血液中的3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine水平较正常人有不同程度的升高，表明3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine可能是一种优秀的肿瘤标志物。针对该发现，本研究团队利用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine作为检测指标制备用于贲门癌检测的产品，用于对贲门癌高发区无症状人群进行贲门癌早期筛查(无创、简便、经济)，以期提高贲门癌早期检出率，改善患者生存质量，减轻家庭和社会负担。

发明内容

针对现有技术总存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于贲门癌诊断的标志物，本发明的目的之二旨在提供用于贲门癌诊断的标志物的检测试剂在制备贲门癌诊断产品中的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于贲门癌诊断的试剂盒。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于贲门癌诊断的标志物，所述标志物为所述标志物为3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid(3,4-二羟基苯乙酸)、1,5-Anhydro-D-Glucitol(1,5-酐-D-山梨糖醇)、3-Methylxanthine(3-甲基黄嘌呤)中的至少一种。

根据上述的标志物，优选地，所述标志物为血清标志物。

本发明第二方面提供了一种上述第一方面所述标志物的检测试剂在制备用于贲门癌诊断产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为血清。

根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。

根据上述的应用，优选地，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

本发明第三方面提供了一种用于贲门癌诊断的试剂盒，所述试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂，所述标志物为3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine中的至少一种。

根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有上述第一方面所述标志物的标准品。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：

(1)本发明通过代谢组学的方法首次发现3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine这三种物质能够用于贲门癌诊断检测，通过检测人血清中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine的表达水平，可以有效检测贲门癌，尤其是早期贲门癌；经验证，本发明单独采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine中任意一个标志物进行贲门癌筛查时，ROC曲线的AUC值均在0.7以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于贲门癌筛查的标志物可用于贲门癌的早期筛查。

(2)本发明将3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine这三种标志物作为一个组合用于早期贲门癌筛查检测时，其检测灵敏度高达90.0％(即早期贲门癌患者中应用这三个标志物进行诊断时被正确的诊断为早期贲门癌的比率为90.0％)，特异度达到了91.0％(即非贲门癌患者中应用这三个标志物进行诊断时确定为未患贲门癌者的比率为91.0％，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期贲门癌的检出率，而且，对贲门癌的检出率远高于现有临床内镜筛查贲门癌的检出率(2％-3％)，可用于贲门癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查，同时也为实现贲门癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，有利于无症状贲门癌高危人群早期发现，从而大大降低了贲门癌患者的死亡率，为贲门癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明用于了贲门癌筛查的标志物为血清检测标志物，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可在早期获得了贲门癌的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(4)本发明用于了贲门癌筛查的试剂盒的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine在正常对照组、贲门癌组的含量结果图，其中，A为3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid，B为1,5-Anhydro-D-Glucitol，C为3-Methylxanthine；

图2为采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图3为采用1,5-Anhydro-D-Glucitol诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图4为采用3-Methylxanthine诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图5为采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol组合诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图6为采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图7为采用1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；

图8为采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者组和正常对照组的ROC曲线图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：贲门癌血清差异代谢标志物的筛选

1、实验样本

按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的100例健康受试者(正常对照组)和100例贲门癌患者(贲门癌组)。

健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内。

贲门癌患者的入组标准为：经过内镜确定和组织病理学证实的贲门癌患者，均未接受放疗或化疗治疗；无其他全身性重大疾病；无长期用药的慢性病史。

2、实验方法

(1)血清样本的采集及储存：

采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm的速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。

(2)主要试剂：

甲醇及乙腈(UPLC纯)购于美国merk公司，色谱级甲酸及乙酸铵购于美国ROE公司；去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制备；标准品包括3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine购于美国Sigma-Aldrich公司。内标L-2氯苯丙氨酸购于上海麦克林生化科技有限公司，酮洛芬购自中国食品药品检定研究院。

(3)UPLC-Q/TOF-MS检测：

A)检测仪器：

Agilent 1290高效液相色谱仪、安捷伦6545四极杆-飞行时间质谱联用仪。

B)色谱条件：

色谱柱：Waters BEH C8(100mm×2.1mm I.D.，1.7μm)；正离子流动相乙腈(B)-水(A)溶液(均含0.1％甲酸)；负离子流动相甲醇(B)-水(A)溶液(均含10mmol/L醋酸铵)；流速：0.4mL/min；柱温：50℃，进样量为1μL。流动相比例：0-1min，5％B；1-4min，5％-30％B；4-9min，30％-90％B；9-10min，90％-100％B；10-12min，100％B。运行时间为12分钟，后运行时间为3分钟。

C)质谱条件：

碎片电压：100V；雾化气体：35psig；毛细管电压：3500V；干燥气体流量：10L/min；干燥气体温度：300℃，进样量为1μL。

D)样本处理：

取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇溶液100μL或含有内标液(酮洛芬)的甲醇溶液100μL进行复溶，L-2-氯苯丙氨酸、酮洛芬的终浓度分别为100ng/mL、1μg/mL，分别作为正负离子模式检测样本。复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。

(4)数据处理方法

A)、数据的前处理

基于UPLC-Q/TOF-MS得到的数据，在R软件平台下采用XCMS程序代码进行峰的提取，对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间Rt，质荷比m/z)、观测和峰强的三维可视化矩阵，将此数据矩阵导入SIMCA-P软件(版本13.0)进行多变量统计分析。

B)、多变量统计分析

为了考察贲门癌组与正常对照组相比代谢的变化，首先对所有变量采用无监督的主成分分析(PCA)，观察各组数据的聚类情况并去除离群值，最后采用正交偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型进行有监督的数据分析，放大组间差异，以获得最显著的组间分离。

C)、基UPLC-Q/TOF-MS检测贲门癌组和正常对照组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定：

采用贲门癌组和正常对照组PLS-DA模型下的VIP值与单因素统计分析的P值相结合，VIP>1.0且P<0.05的变量认为有显著差异性，有显著差异性的变量认为是差异代谢生物标志物。

筛选出的差异变量，需要归属其所代表的生物标志物。基于UPLC-Q/TOF-MS技术的代谢物鉴定主要是通过代谢物谱库进行匹配：在UPLC-Q/TOF-MS总离子流图上找到差异变量的质谱图，将差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如HMDB(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)和KEGG(http://www.kegg.jp)，初步鉴定上述差异代谢物的结构，最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，确定差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液，通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。

3、实验结果

按照上述实验方法，最终鉴定出3个区分贲门癌组和正常对照组的差异代谢物，具体如表1所示。基于UPLC-Q/TOF-MS获得的正常对照组和贲门组中的3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine三种差异代谢物的含量结果图如图1所示。由图1可知，与正常对照组相比，贲门癌组患者血清中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine的含量显著上调。

表1基于UPLC-Q/TOF-MS检测贲门癌组和正常对照组差异代谢物统计数据结果

编号	差异代谢物	VIP	P值	倍值
					1	3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid	1.73	0.000	8.21
2	1,5-Anhydro-D-Glucitol	1.69	0.002	7.58
					3	3-Methylxanthine	1.65	0.026	7.43

实施例2：差异代谢物诊断区分贲门癌患者和健康人的能力评估

(1)单个差异代谢物诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

基于实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(100例贲门癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine的含量数据进行分析，采用受试者工作曲线(ROC曲线)来评估每一种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的能力。3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine单独诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线如图2、图3、图4所示。根据ROC曲线统计各差异代谢物的ROC曲线的曲线下面积AUC、灵敏度和特异度，结果如表2所示。

表2三种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的AUC

ROC曲线的曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。由表2和图2、图3、图4可知，3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine三种标志物单独用于区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，表明3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol或3-Methylxanthine能够单独诊断区分贲门癌患者和正常人，且具有较好的准确性。

进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的代谢物相对含量为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，具体如表3所示。

表3三种差异代谢物单独诊断区分贲门癌患者和正常人的约登指数和截断值

(2)多个差异代谢物组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

1)、3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(100例贲门癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol的相对含量作为自变量(设X₁＝3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid相对含量，X₂＝1,5-Anhydro-D-Glucitol相对含量)，以组别(贲门癌组和正常对照组)作为应变量，对3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol在贲门癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝1.752X₁+2.010X₂-12.882；再将各血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图5所示。由ROC曲线可知，3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和1,5-Anhydro-D-Glucitol组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.906，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.682。

2)、3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(100例贲门癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine的相对含量作为自变量(设X₁＝3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid相对含量，X₂＝3-Methylxanthine相对含量)，以组别(贲门癌组和正常对照组)作为应变量，对3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine在贲门癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝1.649X₁+1.793X₂-12.138；再将各血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图6所示。由ROC曲线可知，3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.903，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.606。

3)、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(100例贲门癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine的相对含量作为自变量(设X₁＝1,5-Anhydro-D-Glucitol相对含量，X₂＝3-Methylxanthine相对含量)，以组别(贲门癌组和正常对照组)作为应变量，对1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine在贲门癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝2.010X₁+1.766X₂-13.477；再将各血清样本中1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图7所示。由ROC曲线可知，1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.913，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.592。

4)、3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的能力：

以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的贲门癌组(100例贲门癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine的相对含量作为自变量(设X₁＝3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid相对含量，X₂＝1,5-Anhydro-D-Glucitol相对含量，X₃＝3-Methylxanthine)，以组别(贲门癌组和正常对照组)作为应变量，对3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine在贲门癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝1.990X₁+2.245X₂+1.902X₃-21.440；再将各血清样本中3,4-DihydroxybenzeneaceticAcid、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图8所示。由ROC曲线可知，3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol和3-Methylxanthine组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.955，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.516。

将上述单个、多个差异代谢物组合诊断区分贲门癌患者和正常人的ROC曲线AUC值、灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值进行统计，具体如表4所示。

表4不同差异代谢物组合用于诊断区分贲门癌患者和正常人的AUC值、约登指数和最佳截断值

由表4可知，与单一差异代谢物相比，采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine中任意两种差异代谢物联合诊断区分贲门癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.9以上，AUC明显高于单一差异代谢物诊断；当采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine三种标志物联合诊断区分贲门癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到最大为0.955，且贲门癌诊断的灵敏度也达到了最高，为90.0％，特异度也达到了91.0％，由此说明三个差异代谢物联合时诊断效果最佳。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着差异代谢物组合数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，其中，3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine三种标志物组合时，其约登指数达到最大为0.81，表明3种标志物组合用于诊断贲门癌的方法具有较好的诊断价值。

实施例3：三种差异代谢物在贲门癌筛查中的应用

1、血清样本的采集

按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的500例健康受试者(正常对照组)和500例贲门癌患者(贲门癌组)。

2、实验方法

(1)血清样本的采集及储存：

3、实验及分析方法

按照实施例1所述的UPLC-Q/TOF-MS实验方法对500例健康受试者(正常对照组)和500例贲门癌患者(贲门癌组)血清进行三种代谢物(3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine)的定性与定量测定。

其中，单独采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol或3-Methylxanthine用于贲门癌诊断时，根据血清样本中3,4-DihydroxybenzeneaceticAcid、1,5-Anhydro-D-Glucitol或3-Methylxanthine的含量与实施例2计算得到的对应差异代谢物的最佳截断值大小判断样本的阴性与阳性，血清样本中差异代谢物的含量高于最佳截断值，则判断为贲门癌患者，反之，则判断为正常人。

采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol 3-Methylxanthine三种差异代谢物中任意两种或三种的组合用于贲门癌诊断时，将血清样本中对应差异代谢物的含量代入实施例2对应组合的Logistic回归方程中计算logit[p]值，然后根据计算得到的logit[p]值与实施例2计算得到的对应组合诊断区分贲门癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性；若logit[p]值高于最佳截断值，则判断为贲门癌，反之，则判断为正常人。

4、检测结果

检测结果如表5所示。由表5可知，单个差异代谢物或多个差异代谢物组合均可应用于贲门癌的筛查，其阳性预测值能够达到0.79以上，阴性预测值能够达到0.77以上；而且，三个差异代谢物联合应用于贲门癌诊断时，其阳性预测值和阴性预测值均能达到90％，预测的准确度最高。由此说明，采用3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol 3-Methylxanthine三种差异代谢物联合诊断贲门癌的效果最佳。

表5两种代谢标志物组合诊断贲门癌的结果

实施例4：基于本发明的代谢标志物的贲门癌筛查试剂盒的制备

基于本发明的筛选得到的3个与贲门癌相关的代谢标志物，设计了贲门癌筛查试剂盒，该试剂盒包括如下成分：

标志物的标准品：3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine中的至少一种，该试剂盒可以包含其中一种、或者任意多种、或者3种代谢标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当涉及一种以上代谢标志物的标准品时，可以将各个标志物的标准品单独封装，也可以将各个标志物的标准品混合制成混合物封装。

内标物：内标物为L-2-氯苯丙氨酸。

进一步地，该试剂盒还含有血清代谢物提取溶剂——甲醇，含有采用UPLC-Q/TOF-MS检测过程采用的流动相试剂(流动相试剂与实施例1色谱检测过程采用的流动相试剂相同)。

试剂盒的使用过程为：收集受试者血清于-80℃冰箱冻存，实验前将血清样本在4℃冰箱中解冻后，取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇溶液100μL进行复溶，复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。UPLC-Q/TOF-MS检测是按照实施例1的UPLC-Q/TOF-MS仪器设定方法对处理后的血清样本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。

使用此贲门癌检测试剂盒时，建议同时检测3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine三个标志物，以进一步提高检测效能。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1. 一种用于贲门癌诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为3,4-Dihydroxybenzeneacetic Acid、1,5-Anhydro-D-Glucitol、3-Methylxanthine中的至少一种。

2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备用于贲门癌诊断产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。

7.一种用于贲门癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述标志物的检测试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法或高效液相色谱-质谱联用法。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有权利要求1所述标志物的标准品。