CN112834652B - 急性主动脉夹层患者特异性生物标志组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疾病特异性的代谢物谱领域，尤其涉及急性主动脉夹层患者特异性生物标志组合物及其用途。本发明通过对急性主动脉夹层组和对照组代谢物谱的比较和分析，得到多种相关的生物标志物，结合高质量的急性主动脉夹层人群和对照人群生物标志物的代谢物谱数据作为训练集，能够准确地对急性主动脉夹层进行鉴别诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有微创、方便、快捷的特点，且灵敏度高，特异性好。

Description

急性主动脉夹层患者特异性生物标志组合物及其用途

技术领域

本发明涉及疾病特异性的代谢物谱领域，尤其涉及急性主动脉夹层患者特异性生物标志组合物及其用途。

背景技术

急性主动脉夹层(AAD，acuteaortic dissection)是一种凶险的大血管病变，病情急促、具有极高的早期病死率，早期诊断是临床实施早期治疗的前提、是降低AAD早死率的关键。影像学手段是目前确诊AAD的金标准，但存在诊断滞后性，时常导致AAD确诊延误。临床目前结合使用血浆生物标志物D-Dimer进行辅助诊断。D-Dimer具有较高的敏感性，但特异性较低。因此，单纯通过D-Dimer无法对AAD进行鉴别诊断。开发一种特异与准确的AAD诊断方法具有重要意义。

代谢组学(metabolomics)通过考察机体代谢物在生理、病理状态下的变化规律，可系统的筛选出反映疾病状态的一组代谢组合物，可解释单一生物标志物无法解释的生命现象。

代谢组学在寻找疾病诊断标志物研究中应用的成果越来越显著。已有研究者利用代谢组学方法发现了前列腺癌症、乳腺癌、胸主动脉瘤、高血压、动脉粥样硬化等疾病诊断密切相关的生物标志组合物。

因此，筛选与AAD相关的代谢标志物，特别是多个代谢标志物的联合使用，对于AAD的临床诊断与治疗决策具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种急性主动脉夹层患者特异性生物标志组合物及其用途，可解决现有急性主动脉夹层诊断方法的滞后性、特异性较低等缺点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种用于诊断急性主动脉夹层的生物标志组合物，至少含有选自以下生物标志物1～5中的一种或数种：

生物标志物1，其质荷比为164.07±0.4amu，保留时间为1.82±0.5min；

生物标志物2，其质荷比为524.34±0.4amu，保留时间为6.40±0.5min；

生物标志物3，其质荷比为568.36±0.4amu，保留时间为7.18±0.5min；

生物标志物4，其质荷比为552.37±0.4amu，保留时间为7.45±0.5min；

生物标志物5，其质荷比为596.39±0.4amu，保留时间为8.21±0.5min。

在本发明中，质荷比的单位amu，amu是指原子质量单位，也称为道尔顿(Dalton，Da)，是用来衡量原子或分子质量的单位，它被定义为碳12原子质量的1/12。

在本发明中，可以选用生物标志物中的一种或多种进行急性主动脉夹层的早期诊断或鉴别诊断等，优选地，至少选取其中的三种，即生物标志物1-3进行评估，或者同时选用这5种生物标志物(生物标志物1-5)进行评估，以获得理想的灵敏度和特异性。

不希望受任何理论的限制，发明人指出这些生物标志物是存在于人体中的内源性化合物。通过本发明所述的方法对受试者血浆的代谢物谱进行分析，代谢物谱中的质量数值以及保留时间指示相应生物标志物的存在及在代谢物谱中的对应位置。同时，急性主动脉夹层群体的所述生物标志物在其代谢物谱中表现出一定的含量范围。

作为本发明所述生物标志组合物的优选实施方式，所述生物标志物来源于人的血浆样本。

作为本发明所述生物标志组合物的优选实施方式，所述质荷比和保留时间由以飞行时间或四级杆为质量分析器的质谱仪测得；其中，各生物标志物通过液相色谱质谱联用的方法来测定。

作为本发明所述生物标志组合物的优选实施方式，所述液相色谱质谱联用的测定条件如下：

(1)色谱条件

色谱柱：C18柱；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-2min，2％-30％B；2-9min，30％-100％B；9-11min,100％B；11-14min，2％B；流速：0.4mL/min；进样体积：1μl；

(2)质谱条件

ESI离子源，负离子模式采集数据，扫描质量m/z 80-2000。离子源参数：毛细管电压为3.0kV，锥孔电压35V，源内温度100℃，干燥气流温度350℃，干燥器流速600L/h，碰撞能6eV。

作为本发明所述生物标志组合物的优选实施方式，所述诊断为早期诊断或鉴别诊断。

本发明同时提供一种用于诊断急性主动脉夹层的试剂盒，所述试剂盒含有用于检测任一所述的生物标志组合物的试剂。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂为可以与所述生物标志物结合的配体。所述配体可以为抗体；任选地，所述用于检测的试剂还可以带有可检测的标记。

本领域技术人员知晓，当进一步扩大样本量时，利用本领域公知的样本检测和计算方法，可以得出每种生物标志物在样本中的正常含量值区间(绝对数值)。这样当采用除质谱以外的其它方法对生物标志物的含量进行检测时(例如利用抗体和ELISA方法等)，可以将检测得到的生物标志物含量的绝对值与正常含量值进行比较，任选地，还可以结合统计学方法，以得出早期诊断或鉴别诊断等。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述诊断包括建立急性主动脉夹层受试者和对照受试者的所述生物标志组合物的含量的训练集的步骤。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述训练集是利用多元统计分类模型建立的训练集。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述诊断包括以下步骤：

1)利用液相色谱质谱联用的方法测定受试者血浆中所述生物标志组合物中各生物标志物的含量；

2)采用ROC曲线，将受试者血浆中所述生物标志组合物中各生物标志物的含量与急性主动脉夹层受试者和对照受试者的生物标志组合物的训练集数据进行比较；

3)若假定受试者为非急性主动脉夹层患者，进行ROC诊断得到的非急性主动脉夹层患者的概率小于0.5或者患急性主动脉夹层的概率大于0.5，则表明原假定的受试者患急性主动脉夹层的概率大、风险较高或者诊断为急性主动脉夹层患者。

在本发明中，单因素方差分析和ROC曲线的使用方法为本领域所公知，本领域技术人员可以根据具体情况进行参数设置和调整。

在本发明的一种实施方案中，所述生物标志组合物中各生物标志物的含量，以及所述训练集中各生物标志物含量数据的获得，是通过以下步骤：

(1)样本的收集与处理：收集临床病人或者模型动物的血浆样本；样本经过有机溶剂进行液液萃取，有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醇、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈等；或者经过蛋白沉淀，蛋白沉淀方法包括加入有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、异丙醇)、各类酸碱盐沉淀、加热沉淀、过滤/超滤、固相萃取，离心等方法单独或者综合的方式进行处理；样本进行干燥或者不进行干燥再利用各种有机溶剂(例如甲醇，乙腈，异丙醇，氯仿等，优选为甲醇)或者水(单独或者组合，不含盐或者含盐)溶解；样本不进行衍生化或者利用试剂(例如三甲基硅烷等)进行衍生化处理。

(2)超高效液相色谱质谱分析测定(UPLC-MS)：采用基于超高效液相色谱和质谱的方法得到血浆中的代谢物谱，代谢物谱经过处理得到各个峰的峰高或者峰面积(peakintensity)以及质荷比和保留时间(retention time)等数据，其中的峰面积即代表生物标志物的含量。

在本发明的一种实施方案中，用质谱的峰面积表示生物标志物的含量。

在本发明中，所述的质荷比和保留时间具有本领域公知的含义。

本领域技术人员公知，当采用不同的液相色谱质谱联用设备以及不同的检测方法时，本发明的生物标志组合物中各生物标志物的原子质量单位和保留时间会在一定范围内波动:其中，所述原子质量单位可以在±0.4amu，例如±0.2amu，例如±0.1amu的范围内波动，所述保留时间可以在±0.5min，例如±0.75min，例如±0.5min，例如±0.25min的范围内波动。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用超高效液相色谱质谱联用的分析方法，分析急性主动脉夹层群体和对照组群体的血浆样本的代谢物谱，并用模式识别进行分析比较急性主动脉夹层群体和对照组群体的血浆代谢物谱，确定特异性液相色谱质谱数据以及相关特异性生物标志物，为后续理论研究和临床诊断提供依据。

(2)机体内源性小分子是生命活动的基础，疾病的状态与机体功能的变化必然会引起内源性小分子在体内代谢的变化，本发明表明，急性主动脉夹层组和对照组的血浆代谢物谱存在明显的差异。本发明通过对急性主动脉夹层组和对照组代谢物谱的比较和分析，得到多种相关的生物标志物，结合高质量的急性主动脉夹层人群和对照人群生物标志物的代谢物谱数据作为训练集，能够准确地对急性主动脉夹层进行鉴别诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有微创、方便、快捷的特点，且灵敏度高，特异性好。

附图说明

图1为急性主动脉夹层组、急性冠状动脉综合征组和健康对照组的血浆质谱BPI图。

图2为OPLS-DA得分图。

图3为S-Plot图。

图4为变量568.36amu的ROC图；其中AUC＝0.923。

图5为变量164.074amu的ROC图；其中AUC＝0.923。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

本发明的急性主动脉夹层(AAD)、急性冠状动脉综合征(ACS)和健康对照(HC)受试者的血液样本来自于广东省人民医院。

实施例1

样本收集：收集志愿者的血浆，立即置于-80℃低温冰箱中储存。急性主动脉夹层组、急性冠状动脉综合征组和健康对照组各收集20例血浆样本。

样本的处理：冰冻的样本置于室温下解冻，取血浆样本70μl置于2.0mL离心管中，加入甲醇280μl稀释，12000rpm离心15min，备用。

利用超高效液相色谱联用分析，具体步骤如下：

(1)仪器设备

ACQUITY I class UPLC-Vion IMS Q-TOF mass spectrometer(Waters Corp.,Milford,USA)。

(2)色谱条件

色谱柱：C18柱(100mm x 2.1mm,i.d.1.7μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-2min，2％-30％B；2-9min,30％-100％B；9-11min,100％B；11-14min，2％B；流速：0.4mL/min；进样体积：1μl。

(3)质谱条件

ESI离子源，负离子模式采集数据，扫描质量m/z 80-2000。离子源参数：毛细管电压为3.0kV，锥孔电压35V，源内温度100℃，干燥气流温度350℃，干燥器流速600L/h；碰撞能6eV。

(4)数据处理

总离子图谱文件通过Masslynx软件自动执行基线校正，峰辨识，峰对齐及基线噪音扣除等过程，得到BPI图谱，再通过Progenesis QI v2.3(Nonlinear Dynamics，Newcastle,U.K.)进行峰判别和归一化步骤，最终得到一个由指定的峰序列号(与保留时间和质荷比相对应)、观测点(样品号)以及归一化后的峰强度组成的三维矩阵，这个矩阵将用于所有后续的数据分析。

使用EZinfor V3.0.3软件进行多变量统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来识别统计学上显著的变化，以变量重要度(VIP)大于1以及p<0.05为参数从散点图中提取潜在的标志物。

(5)比较和确定特征性代谢物谱

通过比较急性主动脉夹层组、急性冠状动脉综合征组和健康对照组的血浆代谢物谱图，建立急性主动脉夹层患者血浆代谢物谱(图1)，结果表明，急性主动脉夹层组、急性冠状动脉综合征组和健康对照组的血浆代谢物谱图是有明显差别的。

(6)潜在的生物标志物筛选

AAD vs ACS，ACS vs HC以及AAD vs HC的OPLS-DA的得分图如图2所示。根据各OPLS-DA模型中的VIP(Variable Importance in the Projection)值大小，并结合t检验(t-test)的p值和q值以及S-plot图(图3)结果进行筛选，选择VIP值大于1，且P值和Q值均小于0.05的代谢物为该组模型的最终显著性差异代谢物。筛选出的潜在生物标记物有5个，如表1所示。

表l 潜在的生物标记物

实施例2

样本收集：收集志愿者的血浆，立即置于-80℃低温冰箱中储存。急性主动脉夹层组、急性冠状动脉综合征组各收集80例血浆样本，健康对照组收集40例血浆样本。

样本的处理：冰冻的样本置于室温下解冻，取血浆样本70μl置于2.0mL离心管中，加入甲醇280μl稀释，12000rpm离心15min，备用。

利用超高效液相色谱联用分析，具体步骤如下：

(1)仪器设备

ACQUITY I class UPLC equipped with the Vion IMS Q-TOF massspectrometer(Waters Corp.,Milford,USA)。

(2)色谱条件

色谱柱：C18柱(100mm x 2.1mm,i.d.1.7μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-2min，2％-30％B；2-9min,30％-100％B；9-11min,100％B；11-14min，2％B；流速：0.4mL/min；进样体积：1μl。

(3)质谱条件

ESI离子源，负离子模式采集数据，扫描质量m/z 80-2000。离子源参数：毛细管电压为3.0kV，锥孔电压35V，源内温度100℃，干燥气流温度350℃，干燥器流速600L/h；碰撞能6eV。

(4)数据处理

总离子图谱文件通过Masslynx软件自动执行基线校正，峰辨识，峰对齐及基线噪音扣除等过程，得到BPI图谱，再通过Progenesis QI v2.3(Nonlinear Dynamics,Newcastle,U.K.)进行峰判别和归一化步骤，最终得到一个由指定的峰序列号(与保留时间和质荷比相对应)、观测点(样品号)以及归一化后的峰强度组成的三维矩阵，这个矩阵将用于所有后续的数据分析。

(5)单因素方差分析

采用SPSS19.0进行数据的统计分析，主要采用单因素方差分析，以判别三组样本间生物标志物所代表的变量是否存在统计差异。

我们提取了三组样本中以下五个变量进行单因素方差分析，结果如表2所示。由表中结果可知，五个生物标志物的含量均可作为AAD疾病的诊断靶标，特别是变量568.36amu，仅在HC组与AAD组之间存在显著性差异，ACS组与AAD组、ACS组与HC组之间无显著差异，这一变量可作为AAD疾病诊断的特异性靶标。变量596.39amu和164.07amu在ACS组与AAD组、HC组与AAD组之间均存在显著性差异，而在ACS组与HC组之间无显著差异，可作为AAD疾病诊断以及与ACS区分诊断的特异性靶标。

表2 三组样本中五个变量的单因素方差分析结果

注：※均值差的显著性水平为0.05。

(6)受试者诊断曲线(ROC)

通过选取40个正常组与80个急性主动脉夹层组的164.07amu和568.36amu两个生物标志物的峰面积数据采用ROC建模作为测试集，测试结果为AUC(曲线下面积)均大于0.9(图4和图5所示)。

综上所述，这五个生物标志物具有较高的准确度和特异性，具有良好的开发为诊断方法的前景，从而为急性主动脉夹层疾病的诊断提供依据。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种生物标志物在制备用于诊断急性主动脉夹层试剂中的应用，其特征在于，所述生物标志物的质荷比为164.07±0.4amu，保留时间为1.82±0.5min；所述质荷比和保留时间由以飞行时间或四级杆为质量分析器的质谱仪测得；

所述生物标志物通过液相色谱质谱联用的方法来测定；

所述液相色谱质谱联用的测定条件如下：

(1)色谱条件

色谱柱：C18柱，100mm×2.1mm，i.d.1.7μm；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0-2min，2％-30％B；2-9min，30％-100％B；9-11min,100％B；11-14min，2％B；流速：0.4mL/min；进样体积：1μl；

(2)质谱条件

ESI离子源，负离子模式采集数据，扫描质量m/z 80–2000；离子源参数：毛细管电压为3.0kV，锥孔电压35V，源内温度100℃，干燥气流温度350℃，干燥器流速600L/h，碰撞能6eV；

所述生物标志物来源于人的血浆样本。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断为早期诊断或鉴别诊断。

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