CN109946467B - 一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物，所述生物标记物为尿酸，所述生物标记物尿酸在胸椎黄韧带骨化患者血清中相比健康对照者血清中表达量降低。本发明还公开了一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物的筛选方法。本发明采用血清代谢组学技术以及数据统计分析技术得到用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法，可操作性强，准确性高，通过取血就能实现诊断，快速便捷，花费低，利用本发明的生物标记物尿酸诊断胸椎黄韧带骨化具有较高的特异性，有利于胸椎黄韧带骨化的早发现、早治疗，具有良好的临床使用和推广价值。

Description

一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物。

背景技术

黄韧带骨化症(Ossification of ligamentum flavum,OLF)，是一种发生在人脊柱黄韧带的异位骨化症，该病变可以造成脊髓后方的压迫，引起四肢瘫痪、大小便功能障碍，从大量临床病例观察中发现颈椎、胸椎及腰椎均有黄韧带骨化现象。胸椎黄韧带骨化(thoracic ossification of ligamentum flavum,TOLF)是胸椎椎管内的黄韧带发生骨化导致椎管狭窄，进而脊髓受到压迫后产生的一系列临床症状，如下肢的麻木及感觉异常、下肢无力、甚至有踩棉花感及束带感。TOLF的发病机制目前尚不清楚，大多数学者认为其可能与慢性损伤、退变、炎症及代谢等因素有关，因本病易在长期从事重体力劳动的人群中发生，且本病主要发生于中下胸椎，此与中下胸椎的活动量大有关，以致黄韧带在这些部位所受的应力较大而易引起骨化现象。

代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是近年来系统生物学研究领域中最活跃的分支学科之一，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后又一系统生物学的重要组成部分。生物体是一个完整的系统，机体组织及其调控水平相互关联和相互依赖并受环境等外界因素的影响，生命活动的任何变化均可以引起生物体代谢物的变化。代谢组学通过分析生物体液和组织的代谢产物研究生化类型体系和生物整体的调控特点。其优点如下：基因以及蛋白的微小变化会在代谢物水平得到放大；代谢物种类远少于基因和蛋白质数目；检测方法采取人体液组织，是无创伤的。通过代谢组学研究可以发现生物体在各种内外环境变化后的应答情况，也可以区分同种不同个体之间的差异。代谢组学采用高灵敏度、高通量的现代仪器分析手段，定性、定量地研究生物体发生发展过程中代谢物的变化，筛选和鉴别生物标记物，对临床诊断及预后监控具有重要价值，展现出广阔的临床应用前景。

发明内容

为了实现胸椎黄韧带骨化的早期发现、早期干预，本发明的目的在于提供一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物。

本发明的第二目的是提供所述生物标记物在制备诊断胸椎黄韧带骨化的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的是提供一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物的筛选方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物，所述生物标记物为尿酸。优选的，所述生物标记物为血清标记物。

对比已发表文献，代谢物尿酸为首次在胸椎黄韧带骨化中发现，这对于胸椎黄韧带骨化的诊断和治疗有十分重要的意义。尿酸(Uric acid)，化学式为C₅H₄N₄O₃，是一种杂环嘌呤衍生物，是嘌呤代谢的最终氧化产物。黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶氧化作用下转换为尿酸。通过文献调研，我们发现尿酸对成骨有一定作用(Isabel R.Orriss,ed.Allopurinol andoxypurinol promote osteoblast differentiation and increase boneformation.Experimental Cell Research 342(2016)166–174)，因此尿酸与骨代谢有着密切的关系。

本发明经进一步发现，所述生物标记物尿酸在胸椎黄韧带骨化患者血清中相比健康对照者血清中表达量降低。

进一步地，本发明提供了所述的生物标记物在制备诊断胸椎黄韧带骨化的试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒包括检测尿酸浓度的试剂。

进一步地，本发明提供了一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)样本收集：收集胸椎黄韧带骨化患者和健康对照者血清样本；

(2)液相色谱质谱采集：通过液相色谱对样本进行预分离，质谱采集一级离子与二级子离子信息；

(3)模式识别分析代谢物谱：使用Progenesis QI软件处理原始数据，校正质量分数和保留时间，对样本进行分组，导入EZinfo软件进行主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析，正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型用交叉验证法进行检验；

(4)筛选：根据上述正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型的变量重要性评分和P值进行差异代谢物筛选，筛选标准为：VIP>2，P值<0.05；

(5)鉴定：通过人类代谢组数据库和美国国家标准与技术局化学数据库搜库鉴定差异代谢物。

优选的，所述方法还包括采用层次聚类分析方法、代谢通路分析方法、ROC曲线分析方法中的一种或多种方法对筛选到的差异生物标记物进一步筛选。

优选的，所述血清样本在基于液相色谱和质谱的方法采集数据时，每10个样本之间插入一个质量控制样品，用于实时监测分析样本分析过程中的质量控制情况。

优选的，所述样本进样前进行以下处理：100uL血清加入300uL在-20℃预冷的乙腈，涡旋振荡1min后，于-20℃静置过夜；然后于离心机中在4℃下以1,2000rpm,离心20min，取上清，1×水稀释。

优选的，液相色谱所用色谱柱为Waters HSS T3 column色谱柱，柱温为45℃，样品温度为4℃，液相流速0.45ml/min，色谱流动相包含两种溶剂A和B：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，色谱梯度洗脱条件为：0-1min为1％B，1-1.5min为1％B-20％B逐渐递增，1.5-11min为20％B-99％B逐渐递增，11-11.5min为99％B减为98％B，11.5-14为1％B平衡色谱柱；

质谱检测使用四极杆串联飞行时间质谱仪Q-TOF，并采用电喷雾离子源的负离子模式ESI-，毛细管电压为2.5kV，锥孔电压为25V，离子源温度为100℃，去溶剂气流速600L/h，锥孔气流速10L/h，图谱数据采集的质荷比范围为50～2000m/z，采集的扫描频率为0.2s/循环。

进一步地，本发明还提供了所述的筛选方法在诊断胸椎胸椎黄韧带骨化中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明采用血清代谢组学技术以及数据统计分析技术得到用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法，可操作性强，准确性高，通过取血就能实现诊断，快速便捷，同时无创、花费低，利用本发明的生物标记物尿酸诊断胸椎黄韧带骨化具有较高的特异性，有利于胸椎黄韧带骨化的早发现、早治疗，具有良好的临床使用和推广价值。

附图说明

图1.主成分分析得分图；C、qc、T分别代表健康对照组样本、质量控制样本和TOLF病例组样本；

图2.OPLS-DA得分图；C(方块)表示健康对照组样本，T(三角)表示TOLF病例组样本；

图3.尿酸在TOLF病例组(图中T表示)和健康对照者组(图中C表示)中的变化情况；

图4.尿酸ROC曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件提取血清。

以下实施例中提到的主要试剂和仪器的信息见表1和表2：

表1主要试剂

试剂	CAS	纯度	品牌
				水	7732-18-5	LC-MS	Thermo
乙腈	75-05-8	LC-MS	Thermo
				甲酸	A117-50	LC-MS	Thermo

表2主要仪器

仪器	型号	品牌
			超高效液相	Waters ACQUITY UPLC I-Class	Waters
高分辨率质谱	Waters XevoG2-XS Qtof	Waters
			色谱柱	Waters HSS T3 column	Waters
离心机	Legend Micro 17R	Thermo

本发明所用术语TOLF为胸椎黄韧带骨化(thoracic ossification ofligamentum flavum)的英文缩写。

本发明的发明人利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)平台，对胸椎黄韧带骨化(TOLF)患者和健康对照者的血清样本进行代谢物的检测分析，采用统计学分析，筛选出尿酸为差异代谢物，尿酸与胸椎黄韧带骨化有关，提示上述生物标记物可能具有很好的辅助诊断价值，可成为胸椎黄韧带骨化的诊断标记物。

实施例1基于UPLC-Q-TOF-MS平台筛选差异生物标记物

1、样本收集

选择诊断明确的TOLF患者作为TOLF病例组，健康人群作为健康对照组，在获得知情同意后对两组进行血样本的收集，收集到的样本立即置于-80℃低温冰箱中储存。TOLF病例组共收集25份血样本，健康对照组共收集24例血样本。获取血样本前3-5天，为测定人群提供标准饮食。

TOLF病例组纳入标准：

(1)根据病史、临床表现、辅助检查明确诊断为TOLF；

(2)具备完整的临床资料和影像学资料及环境因素评估；

(3)签署知情同意；

(4)中国汉族人群。

TOLF病例组排除标准：

(1)其他病因导致胸椎管狭窄者，包括脊柱侧凸、脊柱后凸、脊柱骨折等；

(2)有全身性代谢性疾病，如氟骨症、低磷抗D骨软化症等；

(3)母亲孕期有明确用药史、毒物接触史、高温暴露史者；

(4)流行病学资料、临床资料和影像资料不完整者；

(5)临床表型符合已知的临床先天性综合征者；

(6)未获得知情同意者。

健康对照组纳入标准：

性别、年龄同TOLF病例组匹配，并获得知情同意的健康人群。

健康对照组排除标准：

(1)有脊柱畸形病史；

(2)其他脊柱疾病患者，如脊柱外伤、感染、肿瘤等；

(3)有全身代谢性疾病，如氟骨症、低磷抗D骨软化症等；

(4)有母亲孕期有明确用药史、毒物接触史、高温暴露史者；

(5)临床表型符合已知的临床先天性综合征者；

(6)未获得知情同意。

2、样品的处理：

(1)冰冻的样本置于室温下解冻，取100uL血清加入300uL乙腈(ACN)(-20℃预冷)，涡旋振荡1min后，于-20℃静置过夜；

(2)然后于离心机中在4℃下以1,2000rpm,离心20min，取上清，1×水稀释，取其中100ul到进样瓶；

(3)各取50ul混合，制作QC样本(质量控制样本)。

3、液相色谱质谱联用分析

(1)色谱条件：柱温45℃，样品温度4℃，液相流速0.45ml/min，流动相A:水+0.1％甲酸，流动相B:乙腈+0.1％甲酸，梯度洗脱程序如表3所示。

表3梯度洗脱程序

时间(min)	A％	B％	Curve
				起始	99	1	起始
1	99	1	6
				1.5	80	20	6
11	1	99	6
				11.5	2	98	6
14	99	1	1

(2)质谱条件：

ESI离子源，负离子采集模式下Masslynx软件基于MS^E功能对样品进行一级、二级质谱数据采集。

毛细管电压：2.5kV，锥孔电压25V，离子源温度100℃，去溶剂气流速600L/h，锥孔气流速10L/h，14min内对m/z为50-2000Da的离子进行扫描，0.2sec/循环。

(3)实验质量控制

过程控制：在血样本进行代谢组学检测时，在正式样品上机前用QC样本做稳定性测试，将同一个QC样本重复进样10针左右，此样本为condition QC，待仪器稳定后进样。进样时，每10针样本中间插入一个QC样本，将插在样品中间的QC样品做峰对齐，确定保留时间和峰强度基本保持不变，仪器稳定。

数据控制：为考察研究数据采集的重复性，对QC样本的代谢物峰强度进行相关性分析，相关系数均大于0.90，显示了极好的一致性。另外，对所有样本进行PCA分析，反应实验组间的差异性及组内的重复性。QC样本相对比较集中，仪器比较稳定。

4、数据处理和诊断生物标记物筛选

获得原始代谢指纹图谱后，将原始数据导入Progenesis QI(Waters)软件进行统计分析，首先通过脑啡肽对数据进行质量分数校正，提取峰面积校正保留时间，然后对样本进行分组，导入EZinfo软件进行差异代谢物的筛选。采用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对健康对照组代谢物谱和胸椎黄韧带骨化组代谢物谱进行模式识别分析，结合VIP和P值筛选差异代谢物，并对差异生物标记物做进一步的ROC曲线筛选和通路分析确定潜在的生物标记物。

5、代谢谱分析和潜在的生物标记物

(1)主成分分析(PCA)

PCA分析是EZinfo软件分析的第一步，主要是对数据进行降维分析，可以检测实验组间的差异性及组内的重复性，更可以直观的描述样本间的差异。图1为PCA模型，C、qc、T分别代表TOLF病例组样本、质量控制样本和健康对照组样本三种样本分组，重复性较好的实验，同一组内的不同样本应该聚集在一个相对集中的范围内，并可以与其他组的数据聚集区域区分开，图1中的PCA模型质量控制样本(qc)聚集在一个相对集中的范围内，表明该实验的重复性较好。

(2)正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

采用OPLS-DA方法来区分健康对照组和TOLF病例组，选取OPLS-DA分析过滤与分类不相关的信号，获得OPLS-DA模型，对模型的质量用交叉验证法进行检验，图2为OPLS-DA得分图，C(方块)表示健康对照组样本，T(三角)表示TOLF病例组样本，从样本分组可以看出，TOLF病例组和健康对照组在t[1]方向上得到明显的区分。

通过模型分析可以对代谢物进行VIP(OPLS-DA建模的变量重要性评分)打分筛选，VIP分数越高的代谢物，对分组的贡献越大，选取VIP>2、Pvalue<0.05的代谢物为差异代谢物进行搜库，通过人类代谢组数据库(HMDB，http://www.hmdb.ca/)和美国国家标准与技术局化学数据库(NIST，http://webbook.nist.gov/chemistry/)搜索匹配鉴定血清代谢谱中的代谢物，共得到12个差异生物标记物。

6、差异标记物诊断效能评价—ROC曲线分析

对所筛选到12个的差异代谢物进行ROC作图，对疾病组和参照组测定结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线(受试者工作曲线)。ROC曲线下的面积值(AUC)在0.5-1之间，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。

7、结果

经过以上分析，我们发现代谢物尿酸在TOLF病例组和健康对照组中具有明显差异，尿酸(Uric acid)，化学式为C₅H₄N₄O₃，质荷比(m/z)为167.0204，保留时间(min)为0.6751，VIP>2，P＝0.003292，在人类代谢组数据库中HMDB ID为HMDB00289。

图3为尿酸在TOLF病例组和健康对照组中的变化情况，尿酸在TOLF病例组的表达量要显著低于健康对照组。

图4为尿酸的ROC曲线，尿酸的AUC值为0.738。

由此可以看出，作为单一组分的诊断标记物来说，本发明筛选得到的尿酸这个血清生物标记物的诊断效果是较为显著的，以血清生物标记物尿酸进行诊断具有一定的临床研究价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物在制备诊断胸椎黄韧带骨化的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标记物为尿酸。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标记物尿酸在胸椎黄韧带骨化患者血清中相比健康对照者血清中表达量降低。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于,所述试剂盒包括检测尿酸浓度的试剂。

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