CN112201356A - 口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用 - Google Patents

口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，其由LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸组成。本发明还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：步骤一、获取训练病例集；步骤二、采集所述受试者的血清样本，对血清样本进行超高效液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到多个差异代谢物；步骤三、从多个差异代谢物确定LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。本发明提供一种辅助诊断模型，其在诊断口腔鳞状细胞癌上具有微创、准确度高的优点。

Description

口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用。
背景技术
全世界每年约有35万口腔癌新发病例，其中口腔鳞状细胞癌(oral squamouscell carcinoma,OSCC)约占口腔恶性肿瘤的90％。OSCC发病隐匿，容易转移，侵袭性高，多数患者就诊时已处于中晚期阶段，且术后常伴随面容畸形、进食或语言功能丧失，严重影响患者的生活质量。目前，病理组织活检技术是诊断OSCC的主要手段，虽然特异性高，但不利于早期筛查。近年来，生物标志物的出现意味着一种新型的诊断模式。生物标志物是指与疾病诊断或预后过程相关的实验室指标。将生物标志物的检测结果与临床症状相结合，可以尽早做出诊断，改善患者预后。因此，通过分析OSCC患者血清中相关指标的变化发现并鉴定出有诊断价值的生物标志物具有非常重要的临床意义和社会价值。
代谢组学技术是探索组成生物体的各种类型分子相互作用的高通量技术。通过代谢谱探寻机体代谢物的改变，筛选出灵敏度、特异性较高的生物标志物以提高诊断准确性。近年来，组学技术广泛应用于心血管疾病、消化系统疾病、泌尿系统疾病等诊断生物标志物的发现与鉴定，但国内关于OSCC的诊断生物标志物研究相对较少。
因此，如何提供一种微创的、更准确的方法来诊断口腔鳞状细胞癌，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，该所述辅助诊断标志物由LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸组成。
本发明另一方面提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异代谢物；步骤三、利用变量权重重要性排序和受试者工作特征曲线，从多个所述差异代谢物确定LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：所述辅助诊断模型的曲线下面积、敏感度和特异性分别为0.998、96.1％和99.9％；所述辅助诊断模型的截断值为0.693。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：所述辅助诊断模型中所述LysoPC(16:0)的曲线下面积为0.970，所述LysoPC(18:1)的曲线下面积为0.950，所述牛磺酸的曲线下面积为0.905，所述谷氨酸的曲线下面积为0.912。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：还包括血清处理步骤，具体为：收集所述受试者空腹状态下的血液样本；静置半小时后在4℃、3000rpm转速的条件下离心10min，得到血清样本，将所述血清样本放置在超低温冰箱中保存备用；所述血清样本在冰上解冻，吸取100μL所述血清样本置于1.5mL离心管中，然后加入0.3mL含内标的甲醇溶液，所述内标为：0.05μg/mL L-2-氯代苯丙氨酸和0.5μg/mL酮洛芬；涡旋处理1min后，在4℃条件下，13000rpm离心10min；吸取上清液至进样小瓶中，待质谱进行分析。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析的条件为：采用C18色谱柱，柱温为40℃，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0～1.0min，5％A；1.0～9.0min，5％～100％A；9.0～12.0min，100％A；12.0～12.1min，100％～5％A；12.1～15.0min，5％A；洗脱程序的流速为0.2mL/min。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：将所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱系统串联至可加热的电喷雾离子源系统中；辅助气体的温度为300℃，离子源的温度为350℃，毛细管温度为320℃，辅助气体的流量是10μL/min；扫描范围为：80.00m/z～1200.00m/z；在Full Mass/ddms2扫描模式下，以17500的二级质谱分辨率在正离子模式和负离子模式下进行检测；梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV；在正离子模式下，喷雾电压为3.50kV，鞘气流速为40μL/min，在负离子模式下，喷雾电压为2.80kV和鞘气流速为38μL/min。
本发明另一方面提供一种上述标志物在辅助诊断口腔鳞状细胞癌上的应用。
本发明另一方面提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断试剂盒，其包括上述诊断标志物。
有益效果：
1.本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，该辅助诊断标志物在进行口腔鳞状细胞癌诊断是，能够达到微创、诊断更准确的目的。
2.本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，该诊断模型可成功发现不同样本间代谢物的差异，基于ROC中最高的预测敏感度和特异性，选择0.693作为区分口腔鳞状细胞癌和健康对照组的最佳截断值。该截断值被用来区分测试集中的不同组，其诊断准确性可达到99.9％。
附图说明
图1是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法的流程图。
图2是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中训练集中正离子模式下(A)QC和样本的主成分分析。
图3是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中训练集中负离子模式下(B)QC和样本的主成分分析。
图4是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下(A)OPLS-DA模型得分图。
图5是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中负离子模式下(B)OPLS-DA模型得分图。
图6是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下200次置换实验结果。
图7是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中负离子模式下200次置换实验结果。
图8是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下火山图。
图9是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中负离子模式下火山图。
图10是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中诊断模型在测试集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间、敏感度和特异性。
图11是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中LysoPC(16:0)(A)在测试集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间、敏感度和特异性。
图12是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中LysoPC(18:1)(B)在测试集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间、敏感度和特异性。
图13是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中牛磺酸(C)在测试集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间、敏感度和特异性。
图14是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中谷氨酸(D)在测试集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间、敏感度和特异性。
图15是本发明所述的诊断模型在测试集中对OLP组和健康对照组的预测准确性。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。除非另有说明，否则％指质量体积百分比。
本发明提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，其中，所述辅助诊断标志物由LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸组成。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者。
步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异代谢物。
如表1所示，多个所述差异代谢物为21内源性种化合物，包括脂类，如溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LysoPC)等；氨基酸类，如苯丙氨酸、谷氨酸等；有机酸类，如胆汁酸、甘氨胆酸等以及其他一些小分子化合物，其名称、分子式、相对分子质量、RT、VIP、FC、P值及AUC。
1多个差异代谢物的筛选鉴定表
Figure BDA0002714856810000061
Figure BDA0002714856810000071
代谢通路分析：为进一步探究口腔鳞状细胞癌的发病机制，将所有的差异代谢物上传至MetaboAnalyst进行代谢通路分析，以发现对OSCC有影响的重要代谢途径。结果显示：氨基酸代谢，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷氨酰胺和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢；脂质代谢，包括甘油磷脂代谢；牛磺酸、低牛磺酸代谢；花生四烯酸代谢和初级胆汁酸合成等代谢途径在OSCC患者中存在异常。
步骤三、利用变量权重重要性排序和受试者工作特征曲线，从多个所述差异代谢物确定LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。
基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析平台对51例OSCC患者和45例健康对照者进行了的非靶向代谢组学检测，建立了OSCC患者和健康受试者血清样本代谢物的检测方法，最终发现了OSCC患者和健康对照者之间的代谢表型存在显著的差异。本研究共鉴定出21个差异代谢物，个差异代谢物分别进行ROC分析，选取AUC>0.9的差异代谢物作为OSCC的潜在诊断生物标志物并建立最终的诊断模型。结果显示AUC>0.9的差异代谢物有LysoPC(18:1)、LysoPC(16:0)、牛磺酸和谷氨酸，建立了一个由LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸组成的理想的诊断OSCC的生物标志物模型。该诊断模型可成功用于发现不同样本间代谢物的差异，基于ROC中最高的预测敏感度和特异性，选择0.693作为区分OSCC和健康对照组的最佳截断值。该截断值被用来来区分测试集中的不同组，其诊断准确性可达到99.9％。
诊断模型的建立：将得到的每个差异代谢物分别进行ROC分析，结果见表1，选取AUC>0.9的差异代谢物作为OSCC的潜在诊断生物标志物并建立最终的诊断模型。结果显示AUC>0.9的差异代谢物有LysoPC(18:1)、LysoPC(16:0)、牛磺酸和谷氨酸，其ROC曲线分别如图6所示。将四种生物标志物联合组成OSCC的诊断模型，使用二元Logistic回归和ROC分析评估该诊断模型的诊断效果，该诊断模型的AUC为0.998，敏感度为96.1％，特异性为99.9％，诊断效能良好。
此外，为了保证实验结果的可靠性，QC样本分析穿插在所有样本代谢组学数据采集的过程中，在样本分析前首先检测6个QC样本，监测每次样本注入前后的压力变化和总离子流图主峰保留时间的变化，待仪器稳定后开始样本分析。之后每检测10个样本穿插一个QC样本。仅含有溶剂的空白样品(Blank sample)插在每个QC样品后以避免造成交叉污染。如图2和图3所示，在正、负离子模式下分别检测到3238、2663个离子峰。将数据输入SIMCA软件进行PCA分析，发现正、负离子模式下观察组(OSCC)与健康对照组(HC)有明显的分离趋势。同时，QC样本聚集于一处，证明数据的稳定与可靠。
上述方案中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，包括：所述辅助诊断模型中所述LysoPC(16:0)的曲线下面积为0.970，所述LysoPC(18:1)的曲线下面积为0.950，所述牛磺酸的曲线下面积为0.905，所述谷氨酸的曲线下面积为0.912。
上述方案中，还包括血清处理步骤，具体为：收集所述受试者空腹状态下的血液样本；静置半小时后在4℃、3000rpm转速的条件下离心10min，得到血清样本，将所述血清样本放置在超低温冰箱中保存备用；所述血清样本在冰上解冻，吸取100μL所述血清样本置于1.5mL离心管中，然后加入0.3mL含内标的甲醇溶液，所述内标为：0.05μg/mL L-2-氯代苯丙氨酸和0.5μg/mL酮洛芬；涡旋处理1min后，在4℃条件下，13000rpm离心10min；吸取上清液至进样小瓶中，待质谱进行分析。
上述方案中还包括：所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析的条件为：采用C18色谱柱，柱温为40℃，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0～1.0min，5％A；1.0～9.0min，5％～100％A；9.0～12.0min，100％A；12.0～12.1min，100％～5％A；12.1～15.0min，5％A；洗脱程序的流速为0.2mL/min。
上述方案中还包括：将所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱系统串联至可加热的电喷雾离子源系统中；辅助气体的温度为300℃，离子源的温度为350℃，毛细管温度为320℃，辅助气体的流量是10μL/min；扫描范围为：80.00m/z～1200.00m/z；在Full Mass/ddms2扫描模式下，以17500的二级质谱分辨率在正离子模式和负离子模式下进行检测；梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV；在正离子模式下，喷雾电压为3.50kV，鞘气流速为40μL/min，在负离子模式下，喷雾电压为2.80kV和鞘气流速为38μL/min。
上述方案中，还包括数据处理和统计分析，所有数据均由Thermo XcaliburTM软件(版本3.0，Thermo Scientific，美国)采集和处理，然后使用Compound Discovery软件(版本3.0，Thermo Scientific，美国)进行峰校正、峰匹配和峰对准的信息提取。具体参数如下，保留时间(Retention Time，RT)宽度设置为0.1min，质量宽度为5ppm，对离子峰进行滤波的强度阈值在正离子模式和负离子模式下均为1,000,000。将数据集导入多变量统计分析软件SIMCA(版本14.0，Umetrics，瑞典)进行接下来的主成分分析(Principal componentanalysis，PCA)，正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squarediscrimination Analysis，OPLS-DA)，以及200次置换试验，来评估模型过拟合的风险，通过建立OPLS-DA模型，如图4和图5所示，观察组(OSCC)与健康对照组(HC)之间存在显著差异。并进一步得到变量权重重要性排序(VIP值)，对VIP>1的代谢物进行独立样本t检验筛选出具有统计学意义(P<0.05)的差异代谢物，并通过质谱采集的一级精准m/z、二级碎片离子图、保留时间(retention time,RT)等信息与数据库进行比对鉴定，数据库包括具有一级质谱信息的ChemSpider、MassList；具有一级和二级质谱信息的mzCloud、实验室自建数据库mzVault、人类代谢组数据库(Human Metabolome database,HMBD,http://hmdb.ca/)和PubChem化合物数据库。对于部分可得到标准品的内源性代谢物，将其一级、二级质谱信息与标准品的信息进行比对，最终确定其结构。将得到的差异代谢物导入MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)进行代谢通路分析。使用SPSS26.0分别绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)并计算曲线下面积(thearea under the receiver operating characteristic curves,AUC)，结合VIP值建立诊断模型并评价其诊断效果。
本发明另一方面还提供一种上述标志物在辅助诊断口腔鳞状细胞癌上的应用。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断试剂盒，其包括上述诊断标志物。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (9)

1.一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，其特征在于，所述辅助诊断标志物由LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸组成。
2.一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：
步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；
步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异代谢物；
步骤三、利用变量权重重要性排序和受试者工作特征曲线，从多个所述差异代谢物确定LysoPC(16:0)、LysoPC(18:1)、牛磺酸和谷氨酸作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。
3.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，所述辅助诊断模型的曲线下面积、敏感度和特异性分别为0.998、96.1％和99.9％；所述辅助诊断模型的截断值为0.693。
4.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：
所述辅助诊断模型中所述LysoPC(16:0)的曲线下面积为0.970，所述LysoPC(18:1)的曲线下面积为0.950，所述牛磺酸的曲线下面积为0.905，所述谷氨酸的曲线下面积为0.912。
5.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：还包括血清处理步骤，具体为：
收集所述受试者空腹状态下的血液样本；
静置半小时后在4℃、3000rpm转速的条件下离心10min，得到血清样本，将所述血清样本放置在超低温冰箱中保存备用；
所述血清样本在冰上解冻，吸取100μL所述血清样本置于1.5mL离心管中，然后加入0.3mL含内标的甲醇溶液，所述内标为：0.05μg/mL L-2-氯代苯丙氨酸和0.5μg/mL酮洛芬；
涡旋处理1min后，在4℃条件下，13000rpm离心10min；吸取上清液至进样小瓶中，待质谱进行分析。
6.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析的条件为：
采用C18色谱柱，柱温为40℃，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0～1.0min，5％A；1.0～9.0min，5％～100％A；9.0～12.0min，100％A；12.0～12.1min，100％～5％A；12.1～15.0min，5％A；洗脱程序的流速为0.2mL/min。
7.根据所述权利要求6所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：将所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱系统串联至可加热的电喷雾离子源系统中；
辅助气体的温度为300℃，离子源的温度为350℃，毛细管温度为320℃，辅助气体的流量是10μL/min；扫描范围为：80.00m/z～1200.00m/z；在Full Mass/ddms2扫描模式下，以17500的二级质谱分辨率在正离子模式和负离子模式下进行检测；梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV；在正离子模式下，喷雾电压为3.50kV，鞘气流速为40μL/min，在负离子模式下，喷雾电压为2.80kV和鞘气流速为38μL/min。
8.一种根据权利要求1所述的标志物在辅助诊断口腔鳞状细胞癌上的应用。
9.一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的诊断标志物。
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