KR102627818B1 - 아실카르니틴 대사체를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents
아실카르니틴 대사체를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대사체 프로파일링을 이용한 구강암 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 발생 시 그 양이 변화하는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하는 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 구강암 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 조직생검이 불가능하여 진단이 용이하지 않았던 구강암의 조기진단을 가능하게 하며, 혈액을 수집하여 분석하는 액체생검 방법을 이용하기 때문에 환자의 고통과 위험부담을 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 대사체 프로파일링을 이용한 구강암 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 발생 시 그 양이 변화하는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하는 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 구강암 진단방법에 관한 것이다.
구강암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나다. 세계보건기구 GLOBOCAN 자료에 의하면, 전 세계적으로 2020년에 37.8만명의 구강암 환자가 발생하였고, 2040년에는 55.3만명으로 예측되며, 구강암 사망자는 2020년에 17.8만명이었고, 2040년에는 26.3만명으로 증가할 것으로 예측된다. 가장 흔한 구강암 유형은 90% 이상이 구강 편평세포암(oral sqamous cell carcinoma, OSCC)이다. 전체 5년 생존율은 구강암의 경우 약 56%로 낮은 생존율의 암종에 속한다. 치료 및 재건 방법에 연구자마다 다양한 결과를 발표하고 있으며, 지금까지 진단과 치료의 방법에 많은 발전이 있었음에도 불구하고 수십 년간 구강 및 구인두암의 생존율이 여전히 향상되지 못하고 있다.
구강암 초기 단계에서는 종종 무증상이고 특이적인 진단방법이 거의 없기 때문에 초기에 구강암을 발견하는 것은 상당히 어렵다. 대부분의 구강암이 많이 진행된 단계에서 진단됨으로 인해 생존율이 낮아지고 예후가 좋지 않게 된다. 따라서 구강암을 가능한 초기단계에서 진단할 수 있는 비침습적이고 매우 민감한 바이오마커를 찾아 진단에 활용하는 것은 매우 중요하다.
최근 유전체학, 전사체학, 단백질체학에 이은 최신 기술분야인 대사체학은 세포내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석 연구하는 생물학의 분야 가운데 하나로 생체내 대사과정을 연구하고, 대사적 특징과 관련된 중요한 생체 표지자를 동정하며, 대사적 메커니즘을 밝히는 중요한 연구 분야이다. 대사체학은 유전자형과 표현형을 연결하는 데 중요한 역할을 하는 생물학적 과정의 최종 산물인 대사산물의 식별, 프로파일링 및 정량화를 포함한다. 특히 암연구 분야에서는 발암 과정에서 변화되는 암 대사체를 찾아내고 대사체의 변화가 특정 유전자나 기전에 어떻게 기여하는지를 규명하고 나아가 대사항암제를 이용한 암치료의 전략에도 중요하게 사용될 것으로 기대된다.
생체 시스템에서 대사산물을 포괄적으로 분석하고 정량화하는데 사용되는 가장 일반적인 대사체 분석 플랫폼은 크로마토 그래피와 결합된 핵자기 공명 (NMR) 분광법 또는 질량 분석법 (MS)이다. 이러한 플랫폼을 기반으로 한 대사체학 분석기법은 유방암, 결장 직장암, 폐암, 전립선암, 간세포암종과 같은 다양한 암의 진단 및 병인 검사를 위한 바이오마커 식별에 효과적이고 광범위하게 활용되고 있다.
구강암과 관련하여 여러 연구보고가 있기는 하지만 잘 검증된 연구는 드물다. 이러한 이유로 대사산물이 구강암의 스크리닝 또는 검출을 위한 임상 마커로 아직 많이 사용되지 않았다. 실제 임상과 검진에 적용할 수 있는 비침습적 또는 액체생검을 이용한 바이오마커를 찾는 연구가 필요한 실정이다.
본 발명자들은 구강암 환자군과 대조군으로부터 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 표적-비표적 대사체 프로파일링을 수행하여 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체가 구강암을 식별해내는 대사 신호로 간주될 수 있음을 확인하였다.
[1] Martin-Blαzquez A, et al. Untargeted LC-HRMS-based metabolomics to identify novel biomarkers of metastatic colorectal cancer. Scientific reports 9, 20198 (2019)
[2] Xie GX, et al. Urine metabolite profiling offers potential early diagnosis of oral cancer. Metabolomics 8, 220-231 (2012)
[3] Chen X, Yu D. 구강암의 대사 체학 연구. Metabolomics 15 , 22 (2019)
본 발명의 목적은 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물, 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물, 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트 및 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체는 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 및 헥사노일 카르니틴(hexanoylcarnitine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 구강암 진단용 바이오마커 조성물은 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계; (b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및 (c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 (a)의 단계에서 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체의 수준(level)을 더 측정할 수 있다.
상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 액체생검 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 종래 조직생검이 어려워 진단이 용이하지 않았던 구강암의 조기진단을 가능하게 하며, 혈액을 수집하여 분석하는 액체생검 방법을 이용하기 때문에 환자의 고통과 위험부담을 감소시킬 수 있다.
도 1은 구강암 환자군과 대조군에 대한 RNAseq 데이터를 이용하여 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 pathway분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표적 대사체 프로파일링 접근을 위한 10 개의 대사 산물에 대한 Wald 거리 분석이 포함된 히트 맵 및 계층적 클러스터를 나타낸 것이다.
도 3은 표적 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest의 결과를 나타낸 것이다. a는 훈련 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, b는 랜덤 forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과, 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드 (mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수 : 4 개, 성장할 트리 수 (ntree) : 360 개, c는 테스트 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, d는테스트 세트에서 랜덤 forest를 사용하는 상위 4 개의 대사 산물을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 검증 데이터 세트에서 확인한 각 4개의 대사 산물(A)-(D)과 2개의 대사산물(E)-(J), 3개의 대사산물(K)-(N) 및 4개의 대사산물(O)의 대사산물 패널에 대한 민감도와 특이성 및 AUC 값을 나타낸 것이다.
도 5는 양성 (a) 및 음성 모드 (b)에서 혈장 지질의 UHPLC ESI Q TOF MS / MS 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot을 나타낸 것이다.
도 6은 지질 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표적 대사체 프로파일링 접근을 위한 10 개의 대사 산물에 대한 Wald 거리 분석이 포함된 히트 맵 및 계층적 클러스터를 나타낸 것이다.
도 3은 표적 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest의 결과를 나타낸 것이다. a는 훈련 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, b는 랜덤 forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과, 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드 (mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수 : 4 개, 성장할 트리 수 (ntree) : 360 개, c는 테스트 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, d는테스트 세트에서 랜덤 forest를 사용하는 상위 4 개의 대사 산물을 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 검증 데이터 세트에서 확인한 각 4개의 대사 산물(A)-(D)과 2개의 대사산물(E)-(J), 3개의 대사산물(K)-(N) 및 4개의 대사산물(O)의 대사산물 패널에 대한 민감도와 특이성 및 AUC 값을 나타낸 것이다.
도 5는 양성 (a) 및 음성 모드 (b)에서 혈장 지질의 UHPLC ESI Q TOF MS / MS 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot을 나타낸 것이다.
도 6은 지질 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 구강암 환자군과 대조군으로부터 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 표적-비표적 대사체 프로파일링을 수행하여 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체가 구강암을 식별해내는 대사 신호로 간주될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서의 용어 "대사체"는 생물학적 시료로부터 수득한 대사물질을 의미하며, 상기 대사체를 수득할 수 있는 생물학적 시료는 타액, 전혈, 혈장, 혈청, 혈소판일 수 있고, 바람직하게는 혈장일 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다
본 발명에서의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics), 예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것을 포함한다.
본 발명은 일 관점에서, 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 일 실시예에서 (a) 구강암 환자군의 시료와 대조군의 시료를 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 데이터 추출 단계; (b) UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및 (c) 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 시료의 차별성을 검증하는 단계를 통해 구강암을 진단하였다.
상기 단계 (b)에서 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위 시간동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 대표값으로 정하고, 상기 단계(c)에서 대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위해 기계학습(machine learning) 분석을 수행하여 5-fold 교차 검증을 통해 두 시료간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체를 바이오마커로 선정하고 분석, 검증하였다.
본 발명에서의 용어 "교차 검증"은 통계학에서 모델을 평가하는 한 가지 방법으로, 전체 데이터가 최소 한 번은 테스트 세트로 이용되도록 데이터를 분할하고 각각의 매개변수에 대해 최고의 매개변수를 찾아 정확도와 신뢰성을 높인 성능값을 찾아준다.
본 발명에서의 성능값은 AUC(Area Under the Curve)이며, 상기 AUC값이 높을수록 구강암의 양성 및 음성여부를 구분할 수 있는 능력이 높음을 의미한다.
상기 5-fold 교차 검증을 통하여 AUC값이 0.8이상인 대사체를 구강암 진단용 바이오마커로 분류하였으며 구체적으로 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하며, 바람직하게는 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 및 헥사노일 카르니틴(hexanoylcarnitine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 대사체를 포함한다.
상기 아실카르니틴(acyl carnitine)은 지방산 베타산화에서 지방산을 미토콘드리아 내부로 운반하는 역할을 하며, 지질 대사 프로파일링에서 분석된 2개의 지방산 즉, 폴리불포화지방산(PUFA)인 아라키돈산(arachidonic acid)과 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)이 구강암 환자군에서 감소된 양을 나타낸 결과로 신뢰할 수 있는 바이오마커로 검증되었다. 이는 Mika, A., et al. 연구의 대장암 환자군 혈청에서 PUFA 수준이 건강한 대조군에 비해 낮게 나타난 결과와 일치하며 도 1에서 나타난 바와 같이, 유전체 프로젝트인 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 구강암 환자군과 대조군에 대한 RNAseq 데이터를 이용하여 pathway분석을 수행한 결과 본 발명의 연구 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 바이오마커 조성물은 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어 "수준(level)"은 생물학적 시료에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 만들어진 측정값을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용되며, 생물학적 시료에서 바이오마커에 대응하는 것에 대한 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가(titer), 수치, 발현 수치, 측정된 수치의 비율 등을 나타내는 것으로, 수준(level)의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는데 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 성분에 의존하는 것이다.
본 발명에서의 용어 "제제"는 생물학적 시료로부터 대사체를 정량적으로 검출하기 위한 제제를 의미하며, 상기 제제는 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 제제는 대사체와 상호 작용하여 신호를 발생시키는 상보적 결합이 가능한 프라이머, 프로브, 압타머, 소분자 화합물, 단백질, 리간드 또는 항체일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물 및 정량장치를 더 포함할 수 있다.
상기 정량장치는 각 대사체의 수준(level)을 측정하기 위한 것으로 핵자기공명분광분석기(NMR), 크로마토그래피 및 질량분석기(mass spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계; (b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및 (c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장 등의 액체생검 군에서 선택할 수 있으며, 상기 (a) 단계에서 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체 수준(level)을 더 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실험재료 및 방법>
1. 표본 수집
본 발명의 연구는 국립암센터 윤리위원회(IRB No. NCC2016-0147)의 승인을 받고, 연구 참여자 전원 서면 동의를 받아 수행되었다.
본 발명은 발견데이터 세트(Discovery set)와 검증데이터 세트(Validation set)로 구성된다. 발견데이터 세트는 2018년부터 국립암센터 검진센터와 외래진료소를 방문한 182명의 구강암 환자와 성-연령을 매칭하여 등록 당시 암이 없다는 진단을 받은 건강한 사람 364명으로 구성하였다. 구강암 환자군은 혀, 턱밑 샘, 윗 잇몸, 아랫 잇몸, 상악 부비동, 볼 점막, 후 구치 삼각근, 경구개, 연구개, 입바닥 및 아랫입술 중 하나에서 조직학적으로 구강암을 진단받은 사람이며, 건강한 대조군은 19세 미만은 모두 제외하였다. 검증데이터 세트는 서울대병원을 방문한 경험이 있는 구강암 환자 52명과 성을 매칭하여 상기 발견데이터 세트를 구성한 국립암센터의 같은 기간의 건강한 대조군에서 52명을 포함하였다.
시료인 혈액샘플은 채취 직후 냉동보관했고 혈장은 4℃에서 3000rpm 원심분리를 이용해 20분간 분리하고, 추가 분석을 위해 -80℃로 보존하였다.
본 발명의 연구 참가자들의 일반적인 특성은 표 1에 나타나 있다.
| Discovery data set | Validation data set | |||||
| Variable | Crntrol (N=364) | Case (N=182) | P-value a | Crntrol (N=52) | Case (N=52) | P-value a |
| Zender | 1 | 1 | ||||
| Male | 242(66.5) | 121(66.5) | 34(65.4) | 34(65.4) | ||
| female | 122(33.5) | 61(33.5) | 18(34.6) | 18(34.6) | ||
| Age (years) | 61(48,69) | 60(47,68) | 0.77 | 60.92(7.17) | 66.88(11.89) | 0.003 |
| Age gruop | ||||||
| (Age＜ 40) | 34(9.3) | 21(11.5) | 0.92 | 5(9.6) | 5(9.6) | <.0001 |
| (Age＜ 50) | 72(19.8) | 33(18.1) | 12(23.1) | 10(19.23) | ||
| (Age＜ 60) | 68(18.7) | 34(18.7) | 32(61.5) | 12(23.08) | ||
| (Age＜ 70) | 108(29.7) | 51(28.0) | 3(5.8) | 25(48.08) | ||
(Age  |
82(22.5) | 43(23.6) | 5(9.6) | 5(9.6) | ||
| Smoking group | ||||||
| Yes | 197(54.1) | 107(58.8) | 0.09 | 25(48.1) | 31(59.6) | <.001 |
| No | 97(26.6) | 75(41.2) | 25(48.1) | 5(9.6) | ||
| Unknown | 70(19.2) | 0(0.0) | 2(3.8) | 16(30.8) | ||
| Alcohol group | ||||||
| Yes | 197(54.1) | 103(56.6) | 0.03 | 16(30.8) | 19(36.5) | 0.202 |
| No | 97(26.6) | 79(43.4) | 31(59.6) | 21(40.4) | ||
| Unknown | 70(19.2) | 0(0.0) | 5(9.6) | 12(23.1) | ||
발견 데이터 집합에서 364명의 대조군이 182명의 암환자와 연령별, 성별별로 일치했기 때문에 이러한 변수에 대한 그룹 간에는 차이가 없었다. 결과는 중앙값(25%, 75%), 숫자(%)로 표시하고 P-값은 연속 변수에서 Kruskal-Wallis 검정, 범주형 데이터에서 카이-제곱 검정으로 계산되었다. 환자군과 대조군 간 음주 상태(P = 0.03)에서 유의한 차이가 있었지만, 흡연 상태에서는 유의적인 차이가 존재하지 않았다(P = 0.09). 검증 데이터 집합에서는 연령과 흡연 상태에 유의한 차이가 관찰되었지만 성별과 음주 상태에는 차이가 없었다.
발견데이터 세트와 검증데이터 세트를 대상으로 대사 산물을 분리하기 위하여 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS; Agilent 1290 Infinity LC와 6490 Triple Fourthpole MS 시스템(Agilent Technologies; Palto, CA, 미국)을 사용하였다. 대사 산물 분석에는 MassHunter Workstation (Ver B.06.00, Agilent Technologies) 소프트웨어를 사용하였다.
2. LC-MS 분석 방법
2-1. 시료 준비
(1) 반표적 프로파일링에 사용할 혈장표본(50 uL)은 500 μL 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 용액과 100 μL 물로 추출하여 진공 상태에서 건조시킨 후, 20분동안 3000rpm으로 원심분리하여 1μL씩 주입하여 사용하였다.
(2) 표적 프로파일링에 사용할 혈장표본(20μL)은 물 30 μL, 아세토니트릴 150 μL로 추출한 후, 1시간 동안 단백질을 침전시키고 4℃에서 10분 동안 4500g에서 원심분리하였다. 수용성 상등액을 1.5ml 새 튜브로 옮겨 각 희석 계수를 75% ACN으로 희석하여 각 대사산물 내부 표준을 추가하였다.
(3) 지질 프로파일링에 사용할 혈장표본(20μL)은 물 30 μL, 250 μL의 AVANTISSLASH® LIPIDOMIX® 및 이소프로필 알코올(1:49, v/v) 용액을 사용하여 추출하여 10분 동안 혼합하고, 완전한 단백질 침전을 위해 2시간 동안 두었다가 4℃에서 10분 동안 4500g에서 원심분리하였다.
2-2. UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 분석
(1) 반표적 및 표적 프로파일링: 전기분사(ESI)를 장착한 Xevo TQ XS 시스템(Waters, Milford, MA, MA)이 결합된 ACQUITY UPC을 사용하여 수행하였다. 슈헤르조 SM-C18 칼럼(2 mm x 100 mm, 3 μm; Imtakt, Kyoto, 일본)으로 0.2 mL/min에서 20분간 극성 대사 산물을 분리하였다. 이동상 A는 수중 0.1% 포름산, 이동상 B는 메탄올 내 0.1% 포름산으로 구성되었다.
(2) 지질 프로파일링: 크로마토그래피 분리는 ACQUITY UPLC CSH C18 (2.1mm x 100mm, 1.7μm, Waters)에서 20분동안 수행되었고, 컬럼 온도 및 유속은 55℃및 0.4 ml/min으로 유지하였다. Q-TOF Micro mass detector (Waters, Milford, MA,미국)를 사용해 포지티브 모드의 이동상 A는 물 : 아세토니트릴 (40:60 v/v) 중 0.1 % 포름산, 이동상 B는 이소프로필 알코올 : 아세토니트릴 (90:10 v/v) 중 0.1 % 포름산 로 구성되고, 네거티브 모드의 이동상 A는 물 : 아세토니트릴 (60:40 v/v) 중 0.1 % 포름산, 이동상 B는 이소프로필 알코올 : 아세토니트릴 (90:10 v/v) 중 0.1 % 포름산으로 구성됐다. 정확한 질량 획득을 위해 5μL/min의 lock-spray 조건에서 Lucine-enkphalin([M + H] +:m/z 556.2771 및 [M-H] -:m/z 554.2615)을 사용하였다.
2-3.
다성분 동시분석 모니터링(dMRM)
고품질의 데이터를 획득하기 위하여 다성분 동시분석 모니터링(dMRM)으로 화합물의 머무름 시간, 내부 표준 농도 등을 정량화하였고, QC 검체는 검체 획득 전 5개 검체마다 분석되어 분석 시스템의 안정성과 재현성을 모니터링하였다.
표 2는 반표적 프로파일링에서 선별한 대사산물에 대한 머무름 시간 및 다중반응 모니터링 전이를 나타낸 것이다. 이온 전이값과 머무름 시간 재현성을 고려할 때 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴 및 옥타노일 카르니틴의 선택된 반응을 확인할 수 있다.
3. 통계 분석
다변량 통계 분석은 SIMCA-P+ 버전 12.0(Umetrics, Ume, 스웨덴)을 사용하여 수행되었다. 지질 프로파일링에 있어서 PCA가 적용되고, UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 데이터 세트는 PCA를 수행하기 전에 단위 분산으로 확장되었다.
모델 유효성은 모델의 해석성과 예측성에 대한 정보를 각각 제공하는 모델 매개 변수에서 평가되었다. 그룹 간의 차이는 연속형 변수에 대한 Kruskal-Wallis 검정과 범주형 변수에 대한 카이-제곱 검정을 사용하여 비교되었다.
글로벌 프로파일링에서 얻은 대사산물은 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 및 랜덤 포레스트(RF) 방법을 포함하는 기계 학습 분석으로 도출하였다. LASSO와 RF의 과적합 편향을 피하기 위해, 발견데이터 세트를 훈련세트(구강암146건 및 대조군292건)와 테스트세트(구강암36건 및 대조군72건)로 나누었다. 훈련세트는 대사산물 선택에 대한 낙관적 모델을 구축하기 위해 사용되었고, 모델 검증에는 테스트세트가 사용되었다. 두 알고리즘에서 생성된 결과를 결합하여 추가 분석을 위해 대사산물을 선택하였다.
이후, 추가 대사산물은 fold변화 및 다변량 조정 조건부 로지스틱 회귀 분석 및 AUC 값을 기반으로 선택하였다. 본페로니 방법을 사용한 사후 다중 비교는 대사산물의 그룹 간 유의한 차이를 식별하기 위해 적용되었다.
발견데이터 세트에서의 음주 및 흡연 상태에 대해 OR(odds ratio) 및 해당 CI(95% 신뢰구간)를 추정하기 위해 조정된 조건부 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다.
수신기 작동 특성(ROC) 곡선의 곡선 아래 영역(AUC)은 선택된 대사물의 예측 능력을 테스트하기 위해 계산되었다. 모든 통계 시험은 양측검사로 유의성이 p > 0.05로 설정되었다. 다른 모든 통계 분석과 시각화는 R 플랫폼의 ggplot2 패키지를 사용하여 수행되었다.
<실험결과>
실시예 1: 극성 대사체 프로파일링 분석 결과
UHPLC-ESIQ-TOF-MS/MS를 사용한 혈장 검체에서 총 82개의 대사산물이 검출되었으며, 이름을 식별하기 위해 모든 대사산물은 전자의 정확한 질량값과 파편 이온 및 보존 시간의 측면에서 온라인 데이터베이스의 실제 표준참조와 비교하였다. 그 결과, 추가 선택 과정을 위해 48개의 대사산물을 선발하였으며 구강암 환자군과 대조군을 구분 짓는 최고의 변수 선택을 위해 훈련세트와 테스트세트를 구성하여 5-fold 교차 검증으로 LASSO를 사용한 로지스틱 회귀 결과 16개의 대사산물 및 랜덤 forest(RF) 결과 5개의 대사산물을 도출하였다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 98.81%, 94.30% 및94.44%, 93.52%로 나타났다.
구강암 환자군에서 상기 LASSO와 RF의 결과를 결합한 18개의 대사산물 중 6개의 대사산물(프롤린, 타우린, 피리독사민, 프로-카르니틴, 시트룰린 및 하이포크산틴)은 증가하였고, 12개의 대사산물(아세틸콜린, 크레아티닌, 트립토판, 아스파테이트, 옥타노일 카르니틴, 아세틸 카르니틴, 이소 카르니틴, 글리세롤포스포콜린, 페닐알라닌, 글루타메이트, 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴)은 감소한 양을 보였다
18개의 대사산물에 대하여 리시버 작동 특성(ROC) 곡선에서 곡선 아래 영역 (AUC)을 계산하여 구강암에 대한 예측성능을 테스트한 결과를 나타내는 것이며, 이를 통해 AUC값이 0.7이상인 10개의 대사산물을 선정하였다(표 3).
또한, 도 2를 참조하면, 10 개의 대사산물에 대한 Wald 거리 분석이 포함된 히트맵 및 계층적 클러스터에서 구강암에 대한 옥타노일 카르니틴, 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴, 글리세롤포스포콜린, 하이포크산틴 및 이소-카르니틴의 유의미한 변화를 확인할 수 있다.
상기 10개의 대사산물에 대한 바이오마커 값을 확인하기 위해 표적 프로파일링을 수행한 결과, LASSO 로지스틱 회귀 결과로 6개의 대사산물 및 랜덤 forest 결과로 상위 4개의 대사산물을 도출하였다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 93.25%, 93.64% 및 93.14%, 89.81%로 나타났다.
| Metabolites |
Fold Change
(case/control) |
P-value |
Conditional logistic regresion
(OR) |
P-value | Train AUC | Test AUC |
| Deca-carnitine | 0.515185 | 3.46E-65 | 0.073 | 2.87E-14 | 0.947129 | 0.940808 |
| Oct-carnitine | 0.489523 | 2.95E-63 | 0.0876 | 2.17E-15 | 0.940524 | 0.939192 |
| sn_glycerol_3_glycerophosphocholine | 0.838444 | 3.15E-44 | 0.197 | 3.85E-17 | 0.85592 | 0.913131 |
| Hex-carnitine | 0.570878 | 7.77E-54 | 0.1109 | 2.24E-16 | 0.910444 | 0.884646 |
| Hypoxanthine | 1.094322 | 7.46E-13 | 2.7042 | 8.68E-12 | 0.695483 | 0.689697 |
| Iso-carnitine | 0.82226 | 5.97E-13 | 0.465 | 1.16E-09 | 0.682114 | 0.686061 |
| Acetyl-carnitine | 0.904537 | 5.48E-12 | 0.3138 | 3.18E-12 | 0.680409 | 0.650303 |
| Proline | 1.005017 | 0.391368 | 1.085 | 0.5103048 | 0.488911 | 0.531394 |
LASSO와 RF의 결과를 결합한 8개의 대사산물에 대하여 리시버 작동 특성(ROC) 곡선에서 곡선 아래 영역 (AUC)을 계산하여 구강암에 대한 예측성능을 테스트한 결과로 AUC값이 0.8이상인 4개의 대사산물 즉, 데카노일 카르니틴, 옥트타노일 카르니틴, 글리세롤포스포콜린 및 헥사노일 카르니틴을 선정하였으며, 특히 옥타노일 카르니틴과 데카노일 카르니틴의 AUC값은 0.9이상을 나타내었다(표 4).
도 3을 참조하면, 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest의 결과로, 도3A는 훈련 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬이고, 도 3B는 랜덤 forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과이다. 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드 (mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수는 4 개, 성장할 트리 수 (ntree)는 360 개이며, 도 3C는 테스트세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, 도 3D에서 테스트세트에서 랜덤 forest를 사용한 상위 4 개의 대사산물을 확인할 수 있다.
또한, 도 4a를 참조하면 (A) 내지 (D)에서 보듯이, 검증데이터 세트에서 상기 상위 4개 대사산물의 AUC값이 0.8보다 크고, 도 4b의 (O)에서 보듯이 4개 대사산물 패널은 0.9744의 민감도와 0.8478의 특이성을 보이며 AUC 0.9666으로 높은 구강암 식별 지수를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 2: 지질 대사체 프로파일링 분석 결과
UHPLC-ESIQ-TOF-MS/MS를 사용한 혈장 검체에서 검출된 135개의 지질 대사산물 중 구강암 환자군과 대조군간의 유의미한 차이를 보인 86개의 지질 대사산물을 분류하여 기계학습으로 최적의 변수값을 도출하였다.
도 5에서 구강암 환자군과 대조군간의 패턴이 명확히 구별되는 PCA(principal component analysis)플롯을 확인할 수 있다.
LASSO 로지스틱 회귀 결과로 26개의 대사산물 및 랜덤 forest 결과로 상위 3개의 대사산물이 선정되었다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 87.33%, 79.86% 및 93.49%, 88.19%로 나타났다.
도 6을 참조하면, 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest결과로, 도3A는 훈련 세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬이고, 도 3B는 랜덤 forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과이다. 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드 (mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수는14 개, 성장할 트리 수 (ntree)는 240 개이며, 도 3C는 테스트세트에 대한 랜덤 forest의 혼동 행렬, 도 3D에서는 테스트세트에서 랜덤 forest를 사용하는 상위 3 개의 지질대사 산물을 확인할 수 있다.
결과적으로, 구강암 환자에서 선택된 26 가지 지질의 변화를 대조군과 비교하였을 때, 회귀, 배수 변화에서 17 개의 지질이 구강암에서 유의미한 차이가 있었으며, 표 5에서 나타나는 바와 같이 그룹 (P 값 <0.05)의 17 가지 지질의 fold변화 및 조건부 로지스틱 회귀 모델 분석에서 AUC 값이 0.7 이상인 3개의 지질 (FFA 20 : 4, FFA 20 : 5, TG 60:13) 즉, 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)가 선정되었다.
Claims (8)
- 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 대사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물. - 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 또는 이의 혼합물의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 구강암 진단용 조성물.
- 제 4항의 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트.
- (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계;
(b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및
(c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 6항에 있어서,
상기 (a) 단계에서, 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 대사체의 수준(level)을 더 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공 방법. - 제 6항에 있어서,
상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 액체생검 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공 방법.
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