KR102091483B1

KR102091483B1 - 구강암 발생 예측 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102091483B1
Application number: KR1020190084632A
Authority: KR
Inventors: 민병무
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2020-03-20

Abstract

본 발명은 구강암의 발생을 예측하고 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 제공한다. 본 발명의 구강암 바이오마커는 정상 구강세포에 대비하여 구강암세포에서 그의 발현 수준이 확연히 증가 또는 감소되어 있다. 본 발명의 구강암 바이오마커는 분비형 단백질로서, 생물학적 샘플 예를 들어 타액과 같은 체액에서 이의 발현 수준을 측정하면, 구강암의 발생을 예측하거나 구강암의 조기 진단이 가능하다.

Description

구강암 발생 예측 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for Predicting Oral Cancer and Use Thereof}

본 발명은 구강암 발생 예측 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 구강암 바이오마커에 결합하는 물질을 포함하는 구강암의 발생 예측 또는 진단용 조성물 및 구강암의 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 구강암 바이오마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

구강암은 남성과 여성에게 전 세계적으로 8번째와 13번째로 흔한 암이다(1). 구강 편평상피세포암종(oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 구강 내에서 가장 흔한 악성 종양이며 구강내 악성 종양의 90% 이상을 차지한다. 역학 자료에 의하면 흡연과 알코올 섭취가 이러한 악성 종양의 발달과 상당히 관련이 있다(2). 또한 OSCC의 일부가 발암성 인유두종 바이러스(HPV)에 의한 감염과 관련이 있다는 증거가 있다; 한 연구에서, 사례의 40％이내에서 HPV가 확인되었다(3). 영양 결핍과 식습관도 구강암의 병인에 관련되어 있다(4,5). 체온과 자유 라디칼과 같은 내인성 요인 또한 세포내 DNA 손상의 원인이 된다(6).

구강암에 대한 병인학적 요인은 잘 확립되어 있지만, 구강암이 발병하는 기전은 아직 많이 알려져 있지 않다. 사실, 인간 세포의 구강 발암에 대한 대부분의 연구는 HPV-16 DNA에 의해 불멸화된 인간 구강각화세포로 수행된다(7,8); 그러나, OSCC의 60％ 이상은 HPV 감염과 관련이 없다(3). 특정 암을 대표하는 세포주는 암의 개시 및 진행에 관여하는 유전자 및 단백질을 연구하는데 유용한 실험실 모델로 만들어진다. 따라서, 인간 구강 발암의 근원인 다단계 분자 현상을 연구하기 위해서는 HPV 감염 및 HPV 감염되지 않은 구강 각화세포주를 사용하여 시험관내 다단계 발암 모델 시스템을 확립하는 것이 중요하다.

정상적인 인간 세포는 대사 활성을 유지하지만 분열을 멈춘 상태인, 노화를 겪기 전에 시험관내에서 제한된 수의 세대 동안만 성장할 것이다(9). 시험관내에서 제한된 증식능을 가진 일차배양한 사람 정상 구강각화세포 (NHOKs)의 연속적인 계대배양은 세포사멸과 함께 최종 분화 및 노화를 유도한다(10-12). 설치류 표피세포와 달리, 인간 각화세포는 시험관내에서 형질전환(transformation)에 상당히 저항성이 있다(13, 14). 다른 종에서 발암성 형질전환의 발생이 자발적인 염색체 이상의 빈도와 관련이 있기 때문에, 배양에서 인간 세포의 발암성 형질전환의 낮은 발생은 주로 인간 게놈의 높은 안정성에 기인한다. 지금까지, 사람 정상 구강각화세포의 형질전환은 클론된(cloned) HPV-16 및 HPV-18 DNAs(7, 15)및 시미안 바이러스(simian virus) 40 DNA(16)로 전이(transfection)에 의해서만 재현가능하게 달성되어 잠재적으로 불멸화되었지만 비발암성 세포주를 만들 수 있다. 또한 인간 텔로머라제(telomerase)의 촉매 서브 유닛을 코딩하는 외인성 hTERT cDNA의 전달은 텔로미어 단축을 방지하고, 텔로미어 조절 노화를 극복하며, 유방 상피세포, 각화세포, 골모세포 및 섬유모세포를 포함한 일차배양한 인간 세포를 불멸화시킨다. 시험관내에서 인간 각화세포의 자발적 불멸화는 흔하지 않았지만, 시험관내에서 인간 피부각화세포(18-20) 및 인간 구강각화세포(21)의 자발적 불멸화가 보고되었다. 자발적으로 불멸화된 인간 구강각화세포주 Spi-HOK1은 고위험 유형의 HPV DNA를 포함하지 않았으며 염색체 변화, p53 돌연변이 및 손상된 세포사멸과 관련이 있다(21). 따라서, 자발적으로 형질전환된 세포주는 시험관내 다단계 구강 발암 및 구강생물학 연구를 위해 다양한 실험 모델에서 유용할 수 있다.

질병의 조기진단은 성공적인 치료를 위해 매우 중요하다(29). 특정 질병과 연관된 여러 가지 생체 정보가 혈액이나 타액과 같은 체액에 존재하는 것으로 밝혀지면서 채취가 간편한 타액을 이용한 체외진단 기술이 급속도로 발전하고 있다. 타액은 오래전부터 구강질환을 모니터링하기 위한 연구의 검체로 사용되어 왔으며, 최근에는 암과 같은 전신질환의 진단 및 추적을 위한 연구로 확대되고 있다(27,30). 특히, 타액은 전 연령층의 모든 인간이 거부감 없이 쉽게 검체 채취가 가능하여 타액을 이용한 질병의 진단은 그 유용성이 매우 크다고 할 수 있다.

구강암 치료는 전반적인 건강과 개인 취향뿐만 아니라, 암의 위치와 진행단계에 따라 달라진다. 치료 선택에는 수술, 방사선 및 화학요법이 포함된다. 구강암은 보통 수술로 치료한다. 수술 후에는 방사선요법 또는 방사선요법과 화학요법이 뒤따를 수 있다. 구강암의 수술은 광범위한 안면 손상과 기능 장애를 일으킬 수 있어 심리적인 문제뿐만 아니라 심미적인 문제를 초래한다. 따라서, 구강암의 조기 발견과 예방이 매우 중요하다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

국제공개특허 제WO 2012/081007호 대한민국 등록특허 제10-0983475호

본 발명자들은 구강암의 발생 예측 및 조기진단이 가능한 바이오마커들을 발굴하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인유두종바이러스(HPV) 타입-16 지놈(genome)의 전이(transfection)에 의해 불멸화시킨 인간 구강각화세포주(HOK-16B) 및 자발적으로 불멸화된 인간 구강각화세포주(Spi-HOK1)의 불멸화과정에서 중요한 역할을 하는 바이오마커들을 발굴하였으며, 이 바이오마커들이 정상 구강각화세포와 대비하여 불멸화된 구강각화세포주에서 발현 수준이 증가 또는 감소한다는 사실을 실험적으로 확인하였으며, 인간 구강암세포주에서도 이들의 발현 수준이 증가되어 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구강암의 발생 예측용 또는 구강암의 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 구강암의 발생 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 샘플에서 구강암 바이오마커를 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 구강암 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 구강암의 발생 예측 또는 진단용 조성물로서, 상기 구강암 바이오마커는 LIGHT/TNFSF14, FGF-18, GASP-2/WFIKKN, TNF-beta, NOV/CCN3, Thrombospondin-4, LIF, Activin RIA/ALK-2, Lipocalin-1, Angiopoietin-like Factor, Pref-1, IFN-alpha/beta R2, lL-4, IL-2, BMP-15, G-CSF R/CD114, Insulin R, TGF-beta 5, EDA-A2, IGFBP-1, IL-1 sRI, ETL, Fractalkine, FGF-9, MSPbeta-chain, CCR5, MIP-3 beta, GDF5, GDF9, IL-22, Axl, Angiopoietin-2, TLR4, IL-23 R, CD14, TGF-beta RⅡ 및 IFN-gamma로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커인 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 구강암의 발생을 예측하고 구강암의 신속하고 정확한 진단이 가능한 바이오마커를 발굴하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 불멸화된 인간 구강각화세포와 인간 구강암세포주에서 발현 수준에 현저한 차이가 있는 바이오마커 단백질을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 명세서에서 용어 구강암 발생의 "예측" 은 구강암 발생이 의심되는 환자에 대하여 구강암이 발병할 가능성이 있는지, 또는 구강암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지 여부를 판별하는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어 구강암의 "진단" 은 구강암에 대해 객체(subject)의, 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 구강암 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지의 여부를 판정하는 것, 또는 구강암에 대한 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 치료 상태를 모니터링 하는 것을 포함하는 의미이며, 가장 좁은 의미로는 구강암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “구강암 바이오마커”는 구강암의 발생 예측 또는 구강암의 발병 진단에 사용될 수 있는 단백질을 의미하며, 정상의 구강세포에 비해 구강암이 발생한 구강암세포에서 그의 발현 수준이 증가 또는 감소되어 있는 단백질을 의미한다.

상기 구강암 바이오마커인, LIGHT/TNFSF14, FGF-18, GASP-2/WFIKKN, TNF-beta, NOV/CCN3, Thrombospondin-4, LIF, Activin RIA/ALK-2, Lipocalin-1, Angiopoietin-like Factor, Pref-1, IFN-alpha/beta R2, lL-4, IL-2, BMP-15, G-CSF R/CD114, Insulin R, TGF-beta 5, EDA-A2, IGFBP-1, IL-1 sRI, ETL, Fractalkine, FGF-9, MSPbeta-chain, CCR5, MIP-3 beta, GDF5, GDF9, IL-22, Axl, Angiopoietin-2, TLR4, IL-23 R, CD14, TGF-beta RⅡ, 및 IFN-gamma은 정상 구강각화세포와 비교하여 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B 및 Spi-HOK1 모두에서 동시에 발현 수준이 2배 이상 증가되어 있는 단백질들이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 구강암 바이오마커는 NRG3, Activin A, MIP-1a, TRAIL R4/TNFRSF10D, TACI/TNFRSF13B, GRO-a, Neuritin, MMP-3, MMP-2, NRG2, NGF R, NRG1 Isoform GGF2, FGF-16, MIP 2, TGF-beta 2, CV-2/Crossveinless-2, MIP-1d, Angiopoietin-like 1, HGFR, FGF-7/KGF, CTLA-4 (CD152), TMEFF2, Smad 4, TSG-6, BTC, Granzyme A, MIG, Latent TGF-beta bp1, Decorin, SIGIRR, GCSF, CCR1, RAGE, Cryptic, IL-15, Cerberus 1, Frizzled-3, MFG-E8, TGF-beta 1, Growth Hormone (GH), TGF-beta 3, IL-20 R alpha, IL-18 BPa, Neurturin, EGF R/ErbB1, CNTF R alpha, E-selectin, Neuropilin-2, GM-CSF, Osteoprotegerin/TNFRSF11B, CRTH-2, TFPI, LAP (TGF-beta 1), CXCR2/IL-8 RB, EG-VEGF/PK1, IL-6, OSM 및 IL-22 R 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 구강암 바이오마커는 AR(Amphiregulin), BD, CXCR1/IL-8 RA, Follistatin, Frizzled-6, IGFBP-rp1/IGFBP-7, PIGF, TGF-alpha, uPA, 및 VEGF-C로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

상기 구강암 바이오마커 AR(Amphiregulin), BD-1, CXCR1/IL-8 RA, Follistatin, Frizzled-6, IGFBP-rp1/IGFBP-7, PIGF, TGF-alpha, uPA, 및 VEGF-C은 정상 구강각화세포와 비교하여 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B 및 Spi-HOK1 모두에서 동시에 발현 수준이 1/2 미만으로 감소되어 있는 단백질들이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 구강암 바이오마커는 angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 구강암 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 이들 항체의 단편(scFv), 또는 앱타머 (aptamer)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 항체는 본 발명의 구강암 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서 “항체”는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다.

폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 구강암 예측 또는 진단용 조성물은 면역분석(immunoassay)용 키트(kit) 또는 칩(chip) 형태일 수 있다.

본 발명의 예측용 또는 진단용 조성물은 구강암 바이오마커 단백질을 검출하는 면역분석 방식으로 사용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S)로 레이블링된 항체가 본 발명의 바이오마커 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 생물학적 샘플을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 1차 항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 2차 항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 2차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 구강암 바이오마커 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 구강암 바이오마커 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우 에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 구강암 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer)를 이용할 수 있다. 상기 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 구강암을 진단 또는 이의 발생을 예측할 수 있다. 즉, 샘플 시료에서 본 발명의 바이오마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오거나 또는 약하게 나오는 경우에는 구강암의 발생이 예측되거나 구강암으로 진단된다.

본 발명의 조성물은 상기한 성분 이외에도, 면역분석 등에 필요한 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 별도의 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 구강암의 발생 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 샘플에서 구강암 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 상기 구강암 바이오마커는 LIGHT/TNFSF14, FGF-18, GASP-2/WFIKKN, TNF-beta, NOV/CCN3, Thrombospondin-4, LIF, Activin RIA/ALK-2, Lipocalin-1, Angiopoietin-like Factor, Pref-1, IFN-alpha/beta R2, lL-4, IL-2, BMP-15, G-CSF R/CD114, Insulin R, TGF-beta 5, EDA-A2, IGFBP-1, IL-1 sRI, ETL, Fractalkine, FGF-9, MSPbeta-chain, CCR5, MIP-3 beta, GDF5, GDF9, IL-22, Axl, Angiopoietin-2, TLR4, IL-23 R, CD14, TGF-beta RⅡ, 및 IFN-gamma 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커인 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 샘플은 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액, 소변, 미세침 흡인검체, 세포 파쇄물 또는 세포배양액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 생물학적 샘플은 체액, 보다 바람직하게는 타액일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커는 분비형 단백질일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커의 검출은 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 수행할 수 있다.

상기 구강암 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 상술한 본 발명의 다른 양태인 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물에서 설명되어 있으므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 기재하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 검출 방법은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 구강암 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법에서, 상기 구강암 바이오마커는 NRG3, Activin A, MIP-1a, TRAIL R4/TNFRSF10D, TACI/TNFRSF13B, GRO-a, Neuritin, MMP-3, MMP-2, NRG2, NGF R, NRG1 Isoform GGF2, FGF-16, MIP 2, TGF-beta 2, CV-2/Crossveinless-2, MIP-1d, Angiopoietin-like 1, HGFR, FGF-7/KGF, CTLA-4 (CD152), TMEFF2, Smad 4, TSG-6, BTC, Granzyme A, MIG, Latent TGF-beta bp1, Decorin, SIGIRR, GCSF, CCR1, RAGE, Cryptic, IL-15, Cerberus 1, Frizzled-3, MFG-E8, TGF-beta 1, Growth Hormone (GH), TGF-beta 3, IL-20 R alpha, IL-18 BPa, Neurturin, EGF R/ErbB1, CNTF R alpha, E-selectin, Neuropilin-2, GM-CSF, Osteoprotegerin/TNFRSF11B, CRTH-2, TFPI, LAP (TGF-beta 1), CXCR2/IL-8 RB, EG-VEGF/PK1, IL-6, OSM 및 IL-22 R 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법에서, 상기 구강암 바이오마커는 angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출 방법에서, 상기 구강암 바이오마커는 AR(Amphiregulin), BD-1, CXCR1/IL-8 RA, Follistatin, Frizzled-6, IGFBP-rp1/IGFBP-7, PIGF, TGF-alpha, uPA, 및 VEGF-C으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 구강암의 발생을 예측하고 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 구강암 바이오마커는 정상 구강세포에 대비하여 구강암세포에서 그의 발현 수준이 확연히 증가 또는 감소되어 있다.

(ⅲ) 본 발명의 구강암 바이오마커는 분비형 단백질로서, 생물학적 샘플 예를 들어 타액과 같은 체액에서 이의 발현 수준을 측정하면, 구강암의 발생을 예측하거나 구강암의 조기 진단이 가능하다.

도 1은 항체 어레이(antibody array) 분석을 위한 세포배양액의 전처리 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 인간 정상 구강각화세포(NHOKs) 및 불멸화된 구강각화세포주 HOK-16B와 Spi-HOK1의 세포배양액으로부터 RayBio^ⓡ Biotin Label-based Human Antibody Array I를 사용하여 단백질 발현을 측정한 항체 어레이 칩(antibody array chip)의 결과를 보여주는 이미지이다.
도 3은 3종의 인간 구강암 세포주 (CTHOK-16B-BaP, CTHOK-16B-Dexa, SCC-9)와 1종의 인간 자궁경부암 세포주 (HeLa)의 세포 배양액으로부터 RayBio^ⓡ Biotin Label-based Human Antibody Array I를 사용하여 단백질 발현을 측정한 항체 어레이 칩(antibody array chip)의 결과를 보여주는 이미지이다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 세포 및 세포 배양

일차배양한 구강각화세포(NHOKs)는 이전에 기술된 대로 분리 및 유지하였다(22). 간략히 설명하면, 구강외과에서 수술을 받는 환자의 인간 치은조직 시료에서 NHOKs를 분리하였다. 구강각화세포를 트립신 처리에 의해 분리된 상피조직으로부터 분리하고, 0.15 mM 칼슘 및 보조 성장인자 불렛(bullet) 키트 (KGM; Clonetics, San Diego, CA)를 포함하는 각화세포 성장 배지에서 초기 배양물을 확립하였다. 세포밀도가 약 70％인 1차 인간 구강각화세포를 60 mm 페트리 디쉬(petri dish) 당 1 x 10⁵세포를 접종하고, 세포밀도가 70％에 이를 때까지 배양하였다. 상기 세포들은 세포 밀도가 약 70％에 이를 때 마다 계대배양을 행하였다. 분석은 2계대 유래 세포로 수행되었다. Spi-HOK1 세포(자발적으로 불멸화된 인간 구강각화세포주(21)와 HOK-16B 세포(cloned HPV-16 지놈의 트랜스펙션(transfection)에 의해 불멸화된 인간 구강각화세포주(23)는 KGM에서 배양하였다. HOK-16B 세포를 벤조(a) 피란(benzo(a)pyrene)과 덱사메타손(dexamethasone)에 각각 만성적으로 노출시킴으로써 종양으로 형질전환된 인간 구강암세포주(24, 25), CTHOK-16B-BaP 세포주와 CTHOK-16B-Dexa 세포주를 10％ 우태아 혈청 (FBS), 1％ 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 4 μg/ml 하이드로코르티손이 첨가된 Dulbeco Modified Eagle 배지(DMEM)에서 배양하였다. 구강암 세포주 SCC-9를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10％ FBS와 4 μg/ml 하이드로코르티손이 첨가된 DMEM/Ham' s F12 (Gibco BRL)에서 배양하였다. 인간 자궁경부암(human cervix adenocarcinoma) 세포주 HeLa를 ATCC에서 구입하여 10％ FBS 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640에서 배양하였다.

2. 세포배양액 (culture conditioned media)의 제조

세포배양액은 제조사의 설명서 (RayBiotech, Norcross, GA, USA)에 따라 준비하였다. 간략히 설명하면, 세포배양액을 제조하기 위해, 완전 배양 배지에서 100 ㎜ 배양접시에서 48 시간 동안 세포(1x10⁶ 세포)를 배양하였다. 세포를 KGM으로 3회 세척하고, 48 시간 동안 KGM으로 배양하였다. 세포를 배양한 후, 세포배양액을 수집하고, 1,000 x g에서 10 분간 원심분리하고, 분주하여, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 한편, 상기 세포를 수집하고 전체 단백질농도를 측정하였다. BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 상기 세포배양액 및 세포 용해물에서의 단백질 농도를 측정하였다.

세포배양액은 비오틴-표지(biotin-labeling) 단계 전에 투석하였다. 간략히 설명하면, 세포배양액 3.0 ml을 투석 튜브에 넣어 투석하고, 투석된 샘플을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 미립물질 또는 침전물을 제거하기 위해, 투석된 샘플을 10,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 상층액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮긴 다음 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 사용하여 투석 후 세포배양액에 대한 총 단백질농도를 측정하였다. 투석된 세포배양액을 제조사의 설명서에 따라 비오틴-표지하였다(도 1).

3. 항체 어레이 칩(antibody array chip)

NHOKs, HOK-16B, Spi-HOK1, CTHOK-16B-BaP, CTHOK-16B-Dexa, SCC-9 및 HeLa 세포주로부터 유래된 무혈청 세포배양액(48 시간 배양)을 RayBio® L-Series Human Antibody Array L-507 키트, AAH-BLM-1A-4 (RayBiotech)의 멤브레인을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 단백질을 분석하였다. 간략히 설명하면, 항체 어레이(antibody array) 멤브레인을 블로킹(blocking) 완충액으로 30분 동안 블로킹한 후 밤새 4℃에서 각각의 비오틴-표지된 세포배양액 2 ml과 함께 배양하였다. 샘플을 용기에서 따라낸 후, 멤브레인을 세정 완충액 Ⅰ로 3 회 세정하고, 완만하게 진탕하면서 실온에서 세정 완충액 Ⅱ로 2 회 세정하였다. 그런 다음 멤브레인을 희석된 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 배양하고 상기에서 기술한대로 세정하였다. 멤브레인을 실온에서 30분 동안 호오스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 스트렙트아비딘(horseradish peroxidase-conjugated streptavidin)으로 배양하였다. 세정 후, 멤브레인을 퍼옥시다아제 기질과 함께 실온에서 5분 동안 배양하였다. 마지막으로, 현상(development) 전에 멤브레인을 5 내지 60 분 동안 X-선 필름 (Hyperfilm ECL, Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK)에 노출시켰다.

4. 데이터 분석

X-선 필름의 이미지는 광학 스캐너로 캡처하여 8-비트 회색조 그림으로 저장하였다. 신호 강도는 다른 샘플의 동일한 단백질의 강도를 비교하기 위해 이미지 소프트웨어(Scion Image software, Scion, Frederick, MD, USA)로 정량화하였다. 결과를 정규화(normalization)시키기 위해, 양성대조군을 포함하여 동일한 멤브레인상의 각 단백질(이중 스폿)의 측정치를 각 스팟의 강도로부터 얻은 음성대조군 수치의 평균을 감하여 교정하였다. 이러한 교정된 수치를 이용하여, 불멸화된 인간 구강각화세포주, HOK-16B 및 Spi-HOK1에서의 단백질 발현 증가 또는 감소 정도를 NHOKs와 비교하여 분석하였다. 또한, 인간 구강암 세포주, CTHOK-16B-BaP, CTHOK-16B-Dexa 및 SCC-9와 인간 자궁경부암 세포주, HeLa에서의 단백질 발현 증가 또는 감소 정도를 HOK-16B와 비교하여 분석하였다.

실험결과

1. 세포 배양액 전처리 및 항체 어레이 칩(antibody array chip) 준비

인간 정상 구강각화세포, 불멸화된 인간 구강각화세포주, 인간 구강암 세포주 및 인간 자궁경부암 세포주에서 얻은 세포배양액들은 항체 어레이(antibody array)로 분석하기 전에 제조사의 설명서에 따라 전처리를 시행하였다 (도 1). 즉, 일정량의 세포배양액을 투석시킨 다음 단백질농도를 측정한 후 비오틴화(biotinylation)시켰다. 항체 어레이 칩(antibody array chip)을 준비하기 위하여 사용 전에 1시간 동안 공기 중에서 건조시킨 다음 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 첨가한 후 실온에서 30분간 배양시켰다. 이 때 웰(well)에 거품이 생기지 않도록 주의하여 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 제거하였다. 비오틴-표지된(biotin-labeled) 샘플을 항체 어레이 칩(antibody array chip)에 첨가한 후 4℃에서 12시간 동안 배양시켰다. 나머지 과정은 제조사의 설명서대로 실험을 수행하였으며, 항체 어레이 칩(antibody array chip)에서 생성된 형광신호는 레이저 스캐너(laser scanner)로 스캔닝한 후 결과를 분석하였다. 본 발명에 사용한 RayBio^ⓡ Biotin Label-based Human Antibody Array I (RayBiotech사, AAH-BLG-1-4)에 함유된 507종 인간 단백질 목록은 하기 표 1과 같다.

2. 불멸화된 인간 구강 각화세포주에서 과발현되는 분비형 단백질 분석

인간 정상 구강각화세포의 불멸화 과정에서 유의한 발현 변화를 보이는 분비형 단백질을 규명하기 위하여, 인간 정상 구강각화세포 및 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B와 Spi-HOK1의 세포배양액을 RayBio^ⓡ Biotin Label-based Human Antibody Array I를 사용하여 단백질 발현 변화를 측정하였다 (도 2).

인간 정상 구강각화세포와 불멸화된 인간 구강각화세포주에서 분비형 단백질의 발현을 측정한 다음, 인간 정상 구강각화세포를 대조군으로 사용하여 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B와 Spi-HOK1에서 동시에 2배 이상 발현이 증가하는 단백질의 종류와 증가 배율을 규명하였고, 그 결과를 아래의 표 2에 나타내었다. 또한, 상기 2개의 세포주 HOK-16B와 Spi-HOK1에서 동시에 발현이 1/2 미만으로 감소한 단백질의 종류와 감소 배율을 규명하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 2에 나타낸 결과에서 알 수 있는 바와 같이, HOK-16B와 Spi-HOK1에서 동시에 2배 이상 발현이 증가되는 단백질은 총 95종이었으며, HOK-16B와 Spi-HOK1에서 동시에 3배 이상 발현이 증가되는 단백질은 총 35종, 동시에 4배 이상 발현이 증가되는 단백질은 총 10종이었다. 또한, 표 3에 나타낸 결과에서 알 수 있는 바와 같이, HOK-16B와 Spi-HOK1에서 동시에 발현이 1/2 미만으로 감소된 단백질은 총 10종이었다.

3. 구강암 발생 예측 바이오 마커의 정확도 검증

구강암 발생 예측 바이오 마커의 정확도를 검증하기 위하여 서로 다른 특성을 갖고 있는 3종의 인간 구강암 세포주 CTHOK-16B-BaP, CTHOK-16B-Dexa 및 SCC-9와 인유두종바이러스 type 18 (HPV-18)이 함유된 인간 자궁경부암 세포주 HeLa의 세포배양액에서 RayBio^ⓡ Biotin Label-based Human Antibody Array I를 사용하여 507종 단백질 발현을 측정하였고, 측정 결과는 도 3에 나타내었다.

4. 구강암 발생 예측 바이오 마커의 선별

제한된 수명을 갖는 인간 정상 구강각화세포의 불멸화는 초기 구강암 발암과정에서 중요한 단계이므로 cloned HPV-16 genome의 트랜스펙션(transfection)에 의해 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B와 자발적으로 불멸화된 인간 구강각화세포주 Spi-HOK1에서 동시에 2배 이상 발현이 증가되는 분비형 단백질 95종 및 HOK-16B 및 Spi-HOK1에서 동시에 발현이 1/2 미만으로 감소하는 분비형 단백질 10종은 구강암 발생 예측 및 구강암의 진단 바이오마커 후보가 될 수 있다.

상기 2종의 불멸화된 인간 구강각화세포주에서 발현이 증가되는 분비형 단백질 95종과 발현이 1/2 미만으로 감소하는 분비형 단백질 10종 중에서, 발현 변화가 크며, 동시에 인간 정상 구강각화세포의 불멸화과정 또는 구강암 발암과정에서 그 기능이 중요하다고 보고된 단백질로서, 9종의 단백질 angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4을 바이오 마커로 선별하여, 인간 구강암세포주에서 마커로서의 정확도를 검증하였다.

상기 선별한 9종의 단백질 Angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4의 발현은 인간 정상 구강각화세포와 비교할 때 2종의 불멸화된 인간 구강각화세포주에서 모두 3배 이상 유의하게 증가된 단백질들이었다(표 4 참조).

5. 구강암발생 예측 바이오 마커의 정확도 검증

3종의 인간 구강암 세포주 CTHOK-16B-BaP, CTHOK-16B-Dexa 및 SCC-9와 HPV-18이 함유된 인간 자궁경부암 세포주 HeLa에서 상기 우선 선별한 9종의 단백질 (angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4) 발현을, 불멸화된 인간 구강각화세포주 HOK-16B를 대조군으로 사용하여 증가 배율을 분석하였다. 그 결과, angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4 발현은 실험에 사용한 3종의 인간 구강암 세포주와 1종의 인간 자궁경부암 세포주 모두에서 유의하게 증가하였다(표 5 참조).

5. 구강암발생 예측 바이오 마커의 정확도 검증

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

구강암 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 구강암의 발생 예측 또는 진단용 조성물로서,
상기 구강암 바이오마커는 LIGHT/TNFSF14 단백질 바이오 마커인 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는
(i) FGF-18, GASP-2/WFIKKN, TNF-beta, NOV/CCN3, Thrombospondin-4, LIF, Activin RIA/ALK-2, Lipocalin-1, Pref-1, IFN-alpha/beta R2, lL-4, IL-2, BMP-15, G-CSF R/CD114, Insulin R, TGF-beta 5, EDA-A2, IGFBP-1, IL-1 sRI, ETL, Fractalkine, FGF-9, MSPbeta-chain, CCR5, MIP-3 beta, GDF5, GDF9, IL-22, Axl, Angiopoietin-2, TLR4, IL-23 R, CD14, TGF-beta RⅡ 및 IFN-gamma로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오 마커; 또는
(ii) NRG3, Activin A, MIP-1a, TRAIL R4/TNFRSF10D, TACI/TNFRSF13B, GRO-a, Neuritin, MMP-3, MMP-2, NRG2, NGF R, NRG1 Isoform GGF2, FGF-16, MIP 2, TGF-beta 2, CV-2/Crossveinless-2, MIP-1d, Angiopoietin-like 1, HGFR, FGF-7/KGF, CTLA-4 (CD152), TMEFF2, Smad 4, TSG-6, BTC, Granzyme A, MIG, Latent TGF-beta bp1, Decorin, SIGIRR, GCSF, CCR1, RAGE, Cryptic, IL-15, Cerberus 1, Frizzled-3, MFG-E8, TGF-beta 1, Growth Hormone (GH), TGF-beta 3, IL-20 R alpha, IL-18 BPa, Neurturin, EGF R/ErbB1, CNTF R alpha, E-selectin, Neuropilin-2, GM-CSF, Osteoprotegerin/TNFRSF11B, CRTH-2, TFPI, LAP (TGF-beta 1), CXCR2/IL-8 RB, EG-VEGF/PK1, IL-6, OSM 및 IL-22 R 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는 angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는 AR(Amphiregulin), BD-1, CXCR1/IL-8 RA, Follistatin, Frizzled-6, IGFBP-rp1/IGFBP-7, PIGF, TGF-alpha, uPA, 및 VEGF-C으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커에 특이적으로 결합하는 물질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 또는 앱타머 (aptamer)인 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 면역분석용 키트(kit) 또는 칩(chip) 형태인 것을 특징으로 하는, 구강암의 발생 예측용 또는 진단용 조성물.
구강암의 발생 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 샘플에서 구강암 바이오마커를 검출하는 방법으로서,
상기 구강암 바이오마커는 LIGHT/TNFSF14 단백질 바이오마커인 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는
(i) FGF-18, GASP-2/WFIKKN, TNF-beta, NOV/CCN3, Thrombospondin-4, LIF, Activin RIA/ALK-2, Lipocalin-1, Pref-1, IFN-alpha/beta R2, lL-4, IL-2, BMP-15, G-CSF R/CD114, Insulin R, TGF-beta 5, EDA-A2, IGFBP-1, IL-1 sRI, ETL, Fractalkine, FGF-9, MSPbeta-chain, CCR5, MIP-3 beta, GDF5, GDF9, IL-22, Axl, Angiopoietin-2, TLR4, IL-23 R, CD14, TGF-beta RⅡ, 및 IFN-gamma 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커; 또는
(ii) NRG3, Activin A, MIP-1a, TRAIL R4/TNFRSF10D, TACI/TNFRSF13B, GRO-a, Neuritin, MMP-3, MMP-2, NRG2, NGF R, NRG1 Isoform GGF2, FGF-16, MIP 2, TGF-beta 2, CV-2/Crossveinless-2, MIP-1d, Angiopoietin-like 1, HGFR, FGF-7/KGF, CTLA-4 (CD152), TMEFF2, Smad 4, TSG-6, BTC, Granzyme A, MIG, Latent TGF-beta bp1, Decorin, SIGIRR, GCSF, CCR1, RAGE, Cryptic, IL-15, Cerberus 1, Frizzled-3, MFG-E8, TGF-beta 1, Growth Hormone (GH), TGF-beta 3, IL-20 R alpha, IL-18 BPa, Neurturin, EGF R/ErbB1, CNTF R alpha, E-selectin, Neuropilin-2, GM-CSF, Osteoprotegerin/TNFRSF11B, CRTH-2, TFPI, LAP (TGF-beta 1), CXCR2/IL-8 RB, EG-VEGF/PK1, IL-6, OSM 및 IL-22 R 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는 angiopoietin-like 1, FGF-16, granzyme A, GRO-α, HGFR, MIP 2, NRG2, SIGIRR 및 Smad 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커는 AR(Amphiregulin), BD-1, CXCR1/IL-8 RA, Follistatin, Frizzled-6, IGFBP-rp1/IGFBP-7, PIGF, TGF-alpha, uPA, 및 VEGF-C으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 체액, 타액, 소변, 미세침 흡인검체, 세포 파쇄물 또는 세포 배양액인 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 구강암 바이오마커의 검출은 상기 구강암 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는, 구강암 바이오마커를 검출하는 방법.