CN110412293A - 一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，包括以下步骤：S1，制备尿液exosome悬液；S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度；S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome；S4，对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。本发明采用超速离心方法获得高纯度的尿液exosome，再采用免疫磁珠吸附exosome，克服了exosome体积小的问题，增加了流式细胞仪方法检测exosome的可行性；采用CD63和CD13免疫标记方法分选尿液中近端小管来源的exosome，并用于后续对尿液中近端肾小管来源exosome含量进行准确检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，具体涉及一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法。
背景技术
随着人民生活水平的提高和医疗卫生事业的发展，各种慢性病的患病率逐年增高，特别是高血压、糖尿病和慢性肾脏病，在我国的患病人口均已达到数以亿计之多。传统的肾脏病评估方法主要包括血清学、尿液生化和影像学检查，如血清尿素氮和肌酐，尿液蛋白、隐血等常规检查，泌尿系统超声，其灵敏度和特异度较差，例如血清尿素氮和肌酐在肾功能丧失50％以上才会出现异常，尿蛋白和隐血在感染或发热等状态下也会升高。肾组织活检术尽管能够直接观察肾小球和小管上皮细胞等肾脏病理结构改变，但由于其有创性、取材局限性以及较多的临床禁忌等因素制约其广泛开展。而近年来新型的生物标志物，如肾损伤分子-1，其应用往往局限在肾小管上皮细胞短时间内大量损伤时，并且其准确性等也受到质疑。由此可见，现有的方法已经不能满足人们及时、准确、特异的确定肾脏损伤，因而丧失治疗肾脏疾病的时机。
由于肾脏的解剖结构是由肾小球和肾小管构成，而高血压、糖尿病等病变均累及肾小管，因此大多数慢性病患者最终将发生肾脏病，并进展至终末期肾衰竭，需要依赖昂贵的肾脏替代治疗。早期诊断以便针对性的早期治疗是防治肾脏病的关键。无论原发性肾脏病或是高血压、糖尿病等继发肾损害，肾小管间质纤维化是其共同的病理特征，也是决定疾病进展和预后的主要因素，其中肾小管上皮细胞的病理生理学改变在肾小管间质纤维化的发生和进展中至关重要。因此，对慢性肾脏病的早期诊断事实上是对肾小管上皮细胞功能状态的判断。
尿液直接由肾脏产生，其中不仅包含肾脏滤过的水、电解质和小分子代谢产物，还包含与尿液接触的各段上皮细胞的信息，如脱落细胞，细胞碎片，细胞分泌的化学因子，外泌体(exosome)等，其中外泌体是一种直径在30-100nm的小囊泡，由活细胞产生，包含来源细胞的信息，并且带有来源细胞特异性的标志蛋白。Exosome的数量和内容物都可能随着细胞状态的变化发生改变，因此，通过检测尿液exosome能够特异性的、动态的反映肾脏上皮细胞的变化。如前所述，肾小管上皮细胞的病理生理学改变参与慢性肾脏病的进展，检测尿液中近端肾小管上皮细胞来源的exosome很可能发现早期诊断慢性肾脏病的生物标志物。
然而目前，传统的肾脏疾病诊断和分类方法仍然以肾小球病变为主，往往忽略了肾小管病变对于疾病进展和预后的重要性。此外，虽然exosome的发现较早，但相关研究在近年来才逐渐受到重视，理论依据和研究方法仍在不断改进之中，因此人们对于exosome实时反映来源细胞动态变化的特点，以及尿液中不同细胞来源的exosome在疾病诊断中的应用价值等的认识仍然严重不足。不仅如此，目前的研究较多局限于分离血清、尿液等体液中总的exosome，由于对exosome标志物的认识局限，以及不同的分离方法对后续检测标志物的影响，如采用试剂盒提取exosome很可能造成后续蛋白标志物的检测困难，导致往往缺乏对特定细胞来源的exosome进行分离和分析。
发明内容
为了准确检测尿液中近端肾小管来源的exosome，实时反映来源细胞动态变化的特点，以提高尿液中不同细胞来源的exosome在疾病诊断中的应用价值，本发明供了一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法。
本发明提供了一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，包括以下步骤：
S1，制备尿液exosome悬液
S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度
往S1的尿液exosome悬液中加入等体积的RIPA裂解液，混匀后得到exosome裂解液；测定exosome裂解液中蛋白浓度；
S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome
往CD63包被的磁珠中加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到预处理磁珠；
根据S2测得的尿液exosome悬液中蛋白浓度，取含有已知蛋白含量的尿液exosome悬液，加入预处理磁珠，并加入分选缓冲液，在2-8℃下混匀，然后再加入分选缓冲液，置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀A，往沉淀A中加入分选缓冲液重悬，得到重悬液；
往重悬液中加入PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体，孵育45-60min，再加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀B，沉淀B用分选缓冲液清洗后弃上清，得到沉淀C；
往沉淀C中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，即得到尿液中近端肾小管来源的exosome；
S4，检测尿液中近端肾小管来源exosome的含量
采用流式细胞仪对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。
优选的，S1中制备尿液exosome悬液的方法如下：
(1)将新鲜尿液在3000g下离心10min，收集上清A；往上清A中加入蛋白酶抑制剂混合物，混合均匀后于4℃、17000g离心10min，收集上清B；
其中，新鲜尿液与蛋白酶抑制剂混合物的体积比为100:8.44；
(2)上清B在20℃、200000g下离心1.5h，收集沉淀D，用蔗糖分离溶液重悬沉淀D，得到重悬液；
(3)往重悬液中加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇的浓度达到200mg/ml，然后95℃加热2min，再于25℃、200000g离心1.5h，收集沉淀E；
(4)用蔗糖分离溶液重悬沉淀E，得到尿液exosome悬液；将尿液exosome悬液于-80℃保存备用。
优选的，所述蛋白酶抑制剂混合物由叠氮钠、苯甲基磺酰氟、亮肽素按照100：10：1的摩尔比混合而成。
优选的，所述蔗糖分离溶液由三乙醇胺和蔗糖按照1：25的摩尔比混合而成。
优选的，所述RIPA裂解液中包括如下浓度各组分：50mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液、质量浓度为1％的乙基苯基聚乙二醇40、质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠、100g/ml的苯甲基磺酰氟、质量浓度为0.5％的脱氧胆酸钠、1mM的钒酸钠、2g/ml的抑酞酶、2g/ml的抗蛋白酶以及2g/ml的亮肽素。
优选的，S2中采用采用BCA试剂盒测定exosome裂解液中蛋白浓度。
优选的，S2中测定尿液exosome悬液中蛋白浓度的方法如下：
(1)制备标准曲线
BCA试剂盒的加样孔中分别加入不同浓度的蛋白标准品，然后在每个不同浓度蛋白标准品中加入A+B显色液，于56℃下孵育30min，再于570nm波长下读取OD值，然后以OD值为横坐标，蛋白浓度值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线拟合出线性回归方程；
(2)尿液exosome悬液中蛋白浓度的检测
BCA试剂盒的加样孔中分别加入exosome裂解液和空白对照，然后在exosome裂解液和空白对照中分别加入A+B显色液，56℃孵育30min，在570nm波长下读取OD值，将OD值带入线性回归方程中计算exosome裂解液中蛋白浓度，即为尿液exosome悬液中蛋白浓度；
其中，A+B显色液中A与B的体积比为50：1，且A中包括如下浓度各组分：质量浓度为1％的BCA二钠盐，质量浓度为2％的无水碳酸钠，质量浓度为0.16％的酒石酸钠，质量浓度为0.4％的氢氧化钠，质量浓度为的0.95％碳酸氢钠，A的pH为11.25；
B为质量浓度4％的硫酸铜。
优选的，所述分选缓冲液为含质量浓度0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，且磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
优选的，所述磁场环境由磁力架或磁铁提供。
优选的，PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体的体积比为1：1。
CD63是exosome的标志蛋白，CD13分布在小肠上皮和近端肾小管上皮细胞的刷状缘，因此尿液中近端小管上皮细胞来源的exosome同时带有CD63和CD13两个标志分子，采用免疫抗体标记和流式细胞仪方法检测上述标志分子，可用于发现尿液中近端肾小管来源的exosome。然而，由于exosome的直径只有30-100nm，低于一般流式细胞仪的检测粒径的最小阈值，因此本发明借助磁珠吸附的方法对目标exosome进行富集并检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用超速离心方法获得高纯度的尿液exosome，再采用免疫磁珠吸附exosome，克服了exosome体积小的问题，增加了流式细胞仪方法检测exosome的可行性；最后采用CD63和CD13免疫标记方法分选出尿液中近端小管来源的exosome，实现了尿液中近端肾小管来源exosome含量的准确检测。
附图说明
图1为实施例1中制备的尿液exosome悬液中exosome的扫描电镜图；
图2为实施例1中exosome裂解液中蛋白浓度标准曲线图；
图3为实施例中对照组小鼠IgG1K同型抗体的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例图；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例图；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例图；
图4是实施例1尿液中近端肾小管来源的exosome的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例图；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例图；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例图；
图5是实施例2尿液中近端肾小管来源的exosome的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例图；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例图；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，包括以下步骤：
S1，制备尿液exosome悬液
(1)收集健康者的新鲜晨尿100ml，在3000g下离心10min，收集上清A；
(2)往上清A中加入8.44ml蛋白酶抑制剂混合物，混合均匀后于4℃，17000g离心10min，收集上清B；
其中，蛋白酶抑制剂混合物由叠氮钠、苯甲基磺酰氟、亮肽素按照100：10：1的摩尔比混合而成；
(3)上清B在20℃、200000g离心1.5h，收集沉淀D，用100μl蔗糖分离溶液重悬沉淀D，得到重悬液；
其中，蔗糖分离溶液由三乙醇胺和蔗糖按照1：25的摩尔比混合而成；
(4)往重悬液中加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇的浓度达到200mg/ml，然后95℃加热2min，再25℃、200000g离心1.5h，收集沉淀E；
(5)用50μl蔗糖分离溶液重悬沉淀E，得到尿液exosome悬液；将尿液exosome悬液于-80℃保存备用；
图1为S1制备的尿液exosome悬液中exosome的扫描电镜图，如图1所示，可见直径约30-100nm的类圆形囊泡，符合exosome的形态学特征。
S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度
往S1的尿液exosome悬液中加入等体积的、冰上预冷的RIPA裂解液，充分震荡混匀，冰上放置30min，得到exosome裂解液；
其中，RIPA裂解液包括如下各浓度的组分：50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液、质量浓度为1％的乙基苯基聚乙二醇40、质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠、100g/ml的苯甲基磺酰氟、质量浓度为0.5％的脱氧胆酸钠、1mM的钒酸钠、2g/ml的抑酞酶、2g/ml的抗蛋白酶以及2g/ml的亮肽素；
取exosome裂解液5μl，以双蒸水稀释五倍后，用BCA试剂盒测exosome裂解液中蛋白浓度，具体过程如下：
(1)制作标准曲线：BCA试剂盒的加样孔中分别加入蛋白标准品10μl，浓度分别为1mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml；
按照体积比50:1准备A+B显色液，其中A包括以下浓度各组分：质量浓度1％的BCA二钠盐，质量浓度2％的无水碳酸钠，质量浓度0.16％的酒石酸钠，质量浓度0.4％的氢氧化钠，质量浓度的0.95％碳酸氢钠，A的pH为11.25；B为质量浓度4％的硫酸铜；
每个蛋白标准品中再加入A+B显色液200μl，然后在56℃温箱孵育30min，在570nm波长下读取OD值，然后以OD值为横坐标，蛋白浓度值为纵坐标作标准曲线，具体见图2，拟合得到线性回归方程，所述线性回归方程如下：
y＝1.2538x-0.0468，
线性相关系数R2＝0.9932，其中x为OD值，y为对应OD值下的蛋白标准品蛋白浓度值；
(2)exosome裂解液中蛋白浓度的检测
BCA试剂盒的加样孔中分别加入exosome裂解液和双蒸水(空白对照)10μl，exosome裂解液和双蒸水中再分别加入A+B显色液200μl，56℃温箱孵育30min，在570nm波长下读取OD值，读取到的OD值为0.233，将OD值带入上述线性回归方程中，计算exosome裂解液中蛋白浓度，exosome裂解液中蛋白浓度为(1.2538×0.233-0.0468)×5(稀释倍数)＝1.227mg/ml，即为尿液exosome悬液中蛋白浓度；
S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome
将CD63包被的磁珠震荡3s，取20μl磁珠，往其中加入200μl的分选缓冲液，充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清，得到预处理磁珠；其中，分选缓冲液为含质量浓度0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
根据S2测得的尿液exosome悬液中蛋白浓度，取含有50μg蛋白的尿液exosome悬液，加入上述预处理磁珠，并用分选缓冲液将总体积补足到100μl，在2℃环境中缓慢颠倒混匀22h，然后加入300μl分选缓冲液，轻轻吹打，忌震荡，置于磁力架上1min，弃上清，得到沉淀A，往沉淀A中加入60μl分选缓冲液重悬，得到重悬液；
往重悬液中加入20μl PE标记的CD63抗体和20μl APC标记的CD13抗体，轻轻吹打；避光，室温，水平摇床孵育45min，再加入300μl分选缓冲液，吹匀，置于磁力架上1min，弃上清得到沉淀B，沉淀B用分选缓冲液清洗后弃上清，得到沉淀C；
往沉淀C中加入100μl pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，即得到尿液中近端肾小管来源的exosome；
S4，检测尿液中近端肾小管来源exosome的含量
采用流式细胞仪对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。
实施例2
一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，包括以下步骤：
S1，制备尿液exosome悬液
具体步骤同实施例1，不同之处在于：制备尿液exosome悬液时使用的是近端肾小管病变者的新鲜晨尿100ml；
S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度
具体步骤同实施例1，不同之处在于：exosome裂解液中蛋白浓度的检测时读取到的OD值为0.362，将OD值带入上述线性回归方程中，计算exosome裂解液中蛋白浓度，exosome裂解液中蛋白浓度为(1.2538×0.362-0.0468)×5(稀释倍数)＝2.035mg/ml，即为尿液exosome悬液中蛋白浓度；
S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome
具体步骤同实施例1，不同之处在于：
取含有50μg蛋白的尿液exosome悬液，加入上述预处理磁珠，并用分选缓冲液将总体积补足到100μl，在8℃环境中缓慢颠倒混匀22h；
往重悬液中加入20μl PE标记的CD63抗体和20μl APC标记的CD13抗体，轻轻吹打；避光，室温，水平摇床孵育60min，再加入300μl分选缓冲液，吹匀，置于磁铁上1min，弃上清得到沉淀B，沉淀B用分选缓冲液清洗后弃上清，得到沉淀C；
S4，采用流式细胞仪对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。
采用流式细胞仪对实施例1和实施例2分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测，同时以小鼠IgG1K同型抗体作为对照组加入，具体检测结果见图3-5。
图3为对照组小鼠IgG1K同型抗体的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例图；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例图；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例图；通过对照组同型抗体设置流式细胞仪检测范围，高于此范围为阳性。由于未标记荧光抗体，因此99.8％的exosome在阴性范围内。
图4是实施例1尿液中近端肾小管来源的exosome的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例8.7％；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例90.8％；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例8.7％；从图4可以看出，健康者CD63阳性exosome所占比例为90.8％，CD13阳性exosome所占比例为8.7％，双阳性的exosome所占比例为8.7％。
图5是实施例2尿液中近端肾小管来源的exosome的流式细胞仪检测结果图，其中，左上图为聚合的单个exosomes；右上图为CD63和CD13双阳性的exosome所占比例39.8％；左下图为CD63阳性的exosomes所占比例90.1％；右下图为CD13阳性的exosomes所占比例42.2％。从图5可以看出，近端肾小管病变者CD63阳性exosome所占比例为90.1％，CD13阳性exosome所占比例为42.2％，双阳性的exosome所占比例为39.8％。
从上述结果可知，本发明的方法能够准确的检测出尿液中近端肾小管来源exosome含量，且通过检测尿液中近端肾小管来源exosome含量的比例变化，发现其增高能够反映近端肾小管损伤，因而可以作为一种无创性检测方法用于临床实践。
本发明描述了优选实施例及其效果。但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备尿液exosome悬液
S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度
往S1的尿液exosome悬液中加入等体积的RIPA裂解液，混匀后得到exosome裂解液；测定exosome裂解液中蛋白浓度；
S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome
往CD63包被的磁珠中加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到预处理磁珠；
根据S2测得的尿液exosome悬液中蛋白浓度，取含有已知蛋白含量的尿液exosome悬液，加入预处理磁珠，并加入分选缓冲液，在2-8℃下混匀，然后再加入分选缓冲液，置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀A，往沉淀A中加入分选缓冲液重悬，得到重悬液；
往重悬液中加入PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体，孵育45-60min，再加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀B，沉淀B用分选缓冲液清洗后弃上清，得到沉淀C；
往沉淀C中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，即得到尿液中近端肾小管来源的exosome；
S4，检测尿液中近端肾小管来源exosome的含量
采用流式细胞仪对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。
2.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S1中制备尿液exosome悬液的方法如下：
(1)将新鲜尿液在3000g下离心10min，收集上清A；往上清A中加入蛋白酶抑制剂混合物，混合均匀后于4℃、17000g离心10min，收集上清B；
其中，新鲜尿液与蛋白酶抑制剂混合物的体积比为100:8.44；
(2)上清B在20℃、200000g下离心1.5h，收集沉淀D，用蔗糖分离溶液重悬沉淀D，得到重悬液；
(3)往重悬液中加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇的浓度达到200mg/ml，然后95℃加热2min，再于25℃、200000g离心1.5h，收集沉淀E；
(4)用蔗糖分离溶液重悬沉淀E，得到尿液exosome悬液；将尿液exosome悬液于-80℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物由叠氮钠、苯甲基磺酰氟、亮肽素按照100：10：1的摩尔比混合而成。
4.根据权利要求2所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述蔗糖分离溶液由三乙醇胺和蔗糖按照1：25的摩尔比混合而成。
5.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述RIPA裂解液中包括如下浓度各组分：50mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液、质量浓度为1％的乙基苯基聚乙二醇40、质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠、100g/ml的苯甲基磺酰氟、质量浓度为0.5％的脱氧胆酸钠、1mM的钒酸钠、2g/ml的抑酞酶、2g/ml的抗蛋白酶以及2g/ml的亮肽素。
6.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S2中采用采用BCA试剂盒测定exosome裂解液中蛋白浓度。
7.根据权利要求6所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S2中测定尿液exosome悬液中蛋白浓度的方法如下：
(1)制备标准曲线
BCA试剂盒的加样孔中分别加入不同浓度的蛋白标准品，然后在每个不同浓度蛋白标准品中加入A+B显色液，于56℃下孵育30min，再于570nm波长下读取OD值，然后以OD值为横坐标，蛋白浓度值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线拟合出线性回归方程；
(2)尿液exosome悬液中蛋白浓度的检测
BCA试剂盒的加样孔中分别加入exosome裂解液和空白对照，然后在exosome裂解液和空白对照中分别加入A+B显色液，56℃孵育30min，在570nm波长下读取OD值，将OD值带入线性回归方程中计算exosome裂解液中蛋白浓度，即为尿液exosome悬液中蛋白浓度；
其中，A+B显色液中A与B的体积比为50：1，且A中包括如下浓度各组分：质量浓度为1％的BCA二钠盐，质量浓度为2％的无水碳酸钠，质量浓度为0.16％的酒石酸钠，质量浓度为0.4％的氢氧化钠，质量浓度为的0.95％碳酸氢钠，A的pH为11.25；
B为质量浓度4％的硫酸铜。
8.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述分选缓冲液为含质量浓度0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，且磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
9.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述磁场环境由磁力架或磁铁提供。
10.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体的体积比为1：1。
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|---|---|---|---|---|
| CN111117949A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-08 | 承启医学（深圳）科技有限公司 | 一种基于改良聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法 |
| CN111575228A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN108614119A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-10-02 | 南京医科大学第二附属医院 | 一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法 |
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-
2019
- 2019-08-06 CN CN201910722404.4A patent/CN110412293A/zh active Pending
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