CN108728400A - 一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物及其检测试剂盒，所述标志物为尿液中足细胞微粒。本发明的足细胞微粒具有特定双层膜结构的细胞外囊泡，利用流式细胞仪的方法鉴定慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒，并通过进一步的试验发现尿液中足细胞微粒在慢性肾小球疾病患者甚至在不同程度的肾小球硬化中差异表达，检测待测样本中尿液中足细胞微粒数量，能够判断或者辅助判断慢性肾小球疾病肾小球硬化的发生和/或发展，确定尿液中足细胞微粒能够作为慢性肾小球疾病肾小球硬化筛查或者辅助筛查诊断的标志物。同时本发明的检测试剂盒配合流式细胞仪可以有效检测尿液中足细胞微粒的释放水平。

Description

一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物及其检测试剂盒。
背景技术
肾脏病的诊断金标准是“肾穿刺活检术”取得肾脏组织行病理检查，但该检查属于有创操作并在临床工作上难以重复。尿液中含有丰富的生物学信息，包括蛋白，mRNA等，整个尿路系统的病理生理改变均会导致尿液中成分改变，因此尿液是获取泌尿系统中各种细胞生物学状态的重要窗口，也可辅助监测疾病的进展和治疗效果。微粒是一种直径在100-1000nm的由细胞激活或凋亡产生的细胞外囊泡，主要是由于细胞膜出泡形式而产生，因此携带有母本细胞的细胞膜蛋白和mRNA等遗传学信息。微粒还能表征母本细胞的损伤情况。
足细胞是肾脏细胞的一种，也是肾脏中滤过屏障的重要组成部分，但其几乎无再生能力，许多免疫因素和糖尿病等代谢性因素均容易导致足细胞损伤，因此筛查和监测足细胞损伤和肾小球硬化的程度，特别是早期筛查和辅助诊断，有利于慢性肾小球疾病患者肾小球硬化的尽早发现以及跟踪判断，能够早期进行药物干预延缓肾脏病的进展，意义重大。
CKD早期起病隐匿、不易发现，目前临床上主要以尿微量白蛋白排泄率(urinaryalbumin excretion rate，UAER)作为判断CKD进展的检测指标，然而该指标存在一定的局限性，譬如，CKD初期尽管病变在进展，但UAER尚在正常范围内，无法进行监测，并且检测结果与临床实际情况有时也存在一定的偏差。而通过检测肌酐估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)存在一定的滞后性，血清肌酐清除率下降的时间迟于肾脏本身的病变发生和进展的时间。肾活检是诊断CKD肾脏病理变化的“金标准”，但该检查具有一定的创伤性，临床难以反复进行。因此，寻找早期、无创、精准反映CKD进展的生物标志物已成为当前肾脏病研究领域亟待解决的重要科学问题。以往有研究者发现在糖尿病大鼠尿液中足细胞微粒的释放早于微量白蛋白尿的产生。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，所称的标志物为尿液中足细胞微粒，该足细胞微粒具有特定双层膜结构的细胞外囊泡，利用流式细胞仪的方法，鉴定慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒，尿液中足细胞微粒在慢性肾小球疾病患者甚至在不同程度的肾小球硬化中差异表达，检测待测样本中尿液中足细胞微粒数量，能够判断或者辅助判断慢性肾小球疾病肾小球硬化的发生和/或发展，确定尿液中足细胞微粒能够作为慢性肾小球疾病肾小球硬化筛查或者辅助筛查诊断的标志物。
本发明还提供一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的检测试剂盒。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，其特征在于，所述标志物为尿液中足细胞微粒。
所述足细胞微粒为足细胞在激活或发生凋亡时细胞膜出芽释放的直径在100-1000nm大小的双层膜囊泡状结构，而非外泌体，该足细胞微粒具有特定双层膜结构的细胞外囊泡。
所述标志物能够携带足细胞特异性膜蛋白podocalyxin。
本发明所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够与所述标志物中的podocalyxin蛋白发生特异性结合的流式荧光抗体和与磷脂酰丝氨酸特异性结合的流式荧光抗体，以及能够用于检测所述足细胞微粒的试剂。
进一步地，所述慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的试剂盒包括蛋白酶抑制剂，annexin V缓冲液，0.8μm标准微球，3μm标准微球，APC标记的能与磷脂酰丝氨酸特异性结合的annexin-V流式荧光抗体，PE标记的能podocalyxin蛋白发生特异性结合podocalyxin流式荧光抗体。
其中，蛋白酶抑制剂(每50ml尿液中各加入100mmol/L叠氮钠1.67ml，10mmol/L苯甲基磺酰氟2.5ml和1mmol/L亮抑酶肽0.05ml)，annexin V缓冲液(BDPharmingen)，0.8μm标准微球(货号GBW(E)120022，北京仪化通标有限公司)，3μm标准微球(货号GBW(E)120022，北京仪化通标有限公司)，APC标记的annexin-V流式抗体(BD Pharmingen)，PE标记的podocalyxin流式抗体(eBioscience)，所述annexin-V是用于检测和标记总的细胞微粒，而podocalyxin流式抗体标记足细胞微粒，APC标记的annexin-V流式荧光抗体能与磷脂酰丝氨酸特异性结合，PE标记的podocalyxin流式荧光抗体能podocalyxin蛋白发生特异性结合。
本发明所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物在制备分离和检测尿液中足细胞微粒的试剂盒中的应用。
所述的应用，包括如下步骤：
(1)收集尿液，低速离心，保留上清液，加入试剂盒中的蛋白酶抑制剂；
(2)低速离心留取上清液，再高速离心获得微粒沉淀，利用试剂盒中的annexinV缓冲液重悬微粒沉淀。
(3)利用0.8μm标准微球和3μm标准微球作为流式细胞仪检测过程中的定量和定位参照，并用本试剂盒中的APC标记的annexin-V流式抗体，PE标记的podocalyxin流式抗体标记足细胞微粒。
(4)流式细胞仪检测尿液中足细胞微粒绝对数量。
本发明慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物辅助诊断慢性肾小球疾病中肾小球硬化包括：
测定待测样本中的标志物的量，获得第一量；比较所述第一量与第二量，所述第二量为利用相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量，以及依据比较结果，判定待测样本的来源个体患有慢性肾小球疾病中肾小球硬化的风险和/或者肾小球硬化发展时期。
任选的，所述对照样本来自健康个体；
任选的，所述对照样本来自慢性肾小球疾病患者；
任选的，所述对照样本为尿液样本；
任选的，至少利用一种测定方法进行所述测定；
任选的，所述测定方法选自流式细胞仪。
本发明所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的装置，包括第一量获取模块，该模块用于测定待测样本中的权利要求1-3任一标志物的量，获得第一量；分析模块，该模块用于比较来自第一量获取模块的第一量与第二量，以及依据比较结果，判定待测样本的来源个体患有慢性肾小球疾病中肾小球硬化的风险和/或者肾小球硬化发展时期，所述第二量为利用第一量获取模块相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量。
具体的，所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的装置，所述装置流式细胞仪。
机理：本发明提供一种基于尿液中足细胞微粒的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，足细胞微粒是一种具有特定双层膜结构的细胞外囊泡，足细胞微粒的释放被认为是足细胞应激的产物，一定程度上可反映足细胞损伤和肾小球硬化情况，利用流式细胞仪的方法鉴定慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒，并通过进一步的试验发现尿液中足细胞微粒在慢性肾小球疾病患者甚至在不同程度的肾小球硬化中差异表达，检测待测样本中尿液中足细胞微粒数量，能够判断或者辅助判断慢性肾小球疾病肾小球硬化的发生和/或发展，确定尿液中足细胞微粒能够作为慢性肾小球疾病肾小球硬化筛查或者辅助筛查诊断的标志物。因此，早期监测足细胞的细胞状态对慢性肾脏病早期防治具有重要意义。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明通过足细胞微粒在慢性肾小球疾病患者甚至在不同程度的肾小球硬化中差异表达，检测待测样本中尿液中足细胞微粒数量，能够判断或者辅助判断慢性肾小球疾病肾小球硬化的发生和/或发展。本发明的足细胞微粒具有特定双层膜结构的细胞外囊泡，利用流式细胞仪的方法鉴定慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒，并通过进一步的试验发现尿液中足细胞微粒在慢性肾小球疾病患者甚至在不同程度的肾小球硬化中差异表达，检测待测样本中尿液中足细胞微粒数量，能够判断或者辅助判断慢性肾小球疾病肾小球硬化的发生和/或发展，确定尿液中足细胞微粒能够作为慢性肾小球疾病肾小球硬化筛查或者辅助筛查诊断的标志物。同时本发明的检测试剂盒配合流式细胞仪可以有效检测尿液中足细胞微粒的释放水平。
2、本发明构造了一种检测尿液中足细胞微粒的试剂盒，检测方式简便易行，检测所需样本取用方便易得，检测重复性好，检测过程快速且检测费用低廉。
3、本发明中分离微粒直接采用的离心方式较为简便，其次，使用蛋白酶抑制剂降低在标本冻存过程中出现蛋白降解，利用标准微球与微粒的同步检测，可计算获得尿液样本中的微粒绝对数量，计算方式较为简便实用，提取并富集尿液中总细胞微粒，利用流式细胞仪检测尿液中的足细胞微粒数量变化，可辅助监测慢性肾小球疾病中肾小球硬化程度，价格低廉，便于操作和推广。
附图说明
图1为尿液中总微粒的提取和分离流程；
图2为流式细胞仪检测尿液中足细胞微粒绝对计数的实例图；
图3为尿液中微粒的形态和直径分布鉴定示意图；其中A为尿液中细胞微粒为直径约在150nm的双层膜囊泡状结构；B为NTA结果显示尿液中细胞微粒直径分布主要集中在110nm左右；
图4为不同病理类型、不同病理损伤程度的慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒水平的比较示意图；
图5为慢性肾脏病患者尿液中足细胞微粒水平与临床指标的相关性分析示意图；
图6为慢性肾脏病患者尿液中足细胞微粒水平对CKD和肾小球球性硬化比例的诊断效能示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的试剂盒，包括蛋白酶抑制剂，annexin V缓冲液，0.8μm标准微球，3μm标准微球，APC标记的能与磷脂酰丝氨酸特异性结合的annexin-V流式荧光抗体，PE标记的能podocalyxin蛋白发生特异性结合podocalyxin流式荧光抗体。
实施例2
如图1所示，利用本发明中的试剂盒快速分离尿液中总微粒包括如下步骤：
1、留取受试者清晨尿150ml至尿液收集瓶中，在收集后2h内室温下转移尿液至50ml离心管中；
2、在室温下将尿液以1500g离心10分钟，以除去大细胞、大分子蛋白复合物和其他杂物；
3、将上清液转移至另一离心管中，向每50ml尿液中加入蛋白酶抑制剂，于－80℃保存。(蛋白酶抑制剂：每50ml尿液中各加入100mmol/L叠氮钠1.67ml，10mmol/L苯甲基磺酰氟2.5ml和1mmol/L亮抑蛋白酶肽0.05ml)
4、将上清液解冻后3000g离心10分钟后取上清液，再次18000g离心20分钟(20℃)，沉淀对应的小囊泡以获得微粒沉淀，用annexin V结合缓冲液重悬至3ml，得到微粒悬浮液。
实施例3
利用实施例1试剂盒中的0.8μm标准微球和3μm标准微球作为流式细胞仪检测过程中的定量和定位参照，并用试剂盒中的APC标记的annexin-V流式抗体，PE标记的podocalyxin流式抗体标记足细胞微粒。流式细胞仪检测尿液中足细胞微粒绝对计数具体步骤如下：
1、微粒免疫荧光标记：取实施例2微粒悬浮液置于37℃水浴中迅速融化，取4支EP管，分别加入微粒悬浮液100μL，测定管中加入PE-podocalyxin抗体5μL和APC-annexin-V抗体5μL，另一管不加抗体作为空白对照，其余两个单一标记分别加入PE标记的podocalyxin抗体5μL，APC标记的annexin-V抗体5μL。在4℃避光冰上孵育30分钟后，然后再次18000g离心20min取沉淀，用annexin-V结合缓冲液重悬至200μL。涡旋混匀后，加入含1×107个3μm的标准微球100μL，涡旋后上机检测。
2、流式细胞仪参数调节：微粒采用流式细胞仪检测，将前向角散射信号(forwardscatter，FSC)及侧向角散射信号(side scatter，SSC)均置于Log通道。取含有0.8μm(107个)及3μm(107个)标准微球的混合微球悬液100μl，涡旋后上样，建立FSC-SSC对数散点图，建立定位对照。
3、上样分析：取荧光标记后的样本上机分析，将定义的微粒门内收集到的粒子进一步在FL2通道进行PE荧光强度的分析。足细胞微粒定义为粒径小于1μm且podocalyxin阳性粒子。收集3μm标准微球1×105，通过各荧光直方图计算位于0.8μm的标准微球区域内足细胞微粒的表达绝对量。计算公式：根据以下公式计算每m1尿液中含有的足细胞微粒的绝对量，以N表示。
试验例1
样本来源及信息：尿液标本收集于东南大学附属中大医院肾内科，根据2012年KDIGO肾小球疾病临床实践指南诊断病理类型。将慢性肾小球疾病标本在此分组为：健康对照(HC)组和CKD组。并依据不同病理类型分为：特发性膜性肾病(IMN)组，IgA肾病(IgAN)组，糖尿病肾病(DN)组和狼疮性肾炎(LN)组。
为检测尿液中足细胞微粒的数量变化，通过实施例2方法对各个组的样本分离尿液中总微粒，再通过实施例3的方法采用试剂盒和流式细胞仪检测IMN患者27例，IgAN患者19例，DN患者17例和LN患者17例。对于每一组流式细胞仪检测实验，选取健康对照(HC)作为标准，利用flowjo软件对足细胞微粒进行定量，以标准微球数量为标准定量计算每毫升尿液中足细胞微粒水平。
本试验例流式细胞仪检测尿液中足细胞微粒绝对计数如图2所示。利用电镜和纳米粒子示踪分析对尿液中微粒的形态和直径分布鉴定，以佐证尿液中微粒的存在，如图3A所示，电镜下观察尿液中细胞微粒为直径约在150nm的双层膜囊泡状结构；如图3B所示，NTA结果显示尿液中细胞微粒直径分布主要集中在110nm左右。
结果分析：
1、不同类型的早期慢性肾小球疾病患者尿液中足细胞微粒基线水平观察：如图4所示，原发性肾小球疾病(特发性膜性肾病和IgA肾病)和继发性肾小球疾病(狼疮性肾炎和糖尿病肾病)患者尿液中足细胞微粒数量较正常对照者显著升高(P<0.05)(图4A)。CKD患者中，与无肾小球球性硬化者相比，合并肾小球球性硬化的患者尿液中足细胞微粒数量显著降低(P<0.05)(图4B)。而根据有无肾间质慢性损伤分为两组，尿液中足细胞微粒数量无显著差异(P>0.05)(图4C)。与糖尿病且ACR在正常范围内的患者相比，糖尿病肾病患者尿液中足细胞微粒数量显著升高(P<0.05)(图4D)。SLE患者(24小时蛋白尿<0.5g)相比，狼疮性肾炎患者尿液中足细胞微粒数量显著升高(P<0.05)(图4E)。且随着SLEDAI评分的升高，足细胞微粒数量有上升趋势，但仅有评分≤4和评分≥15两组差异有统计学意义(P<0.05)(图4F)。
2、CKD患者尿液中足细胞微粒与临床指标的相关性分析：
如图5中Spearman相关分析结果显示，CKD患者尿液中足细胞微粒数量与血浆HDL-胆固醇，LDL-胆固醇和24小时尿蛋白定量呈显著正相关关联，而与血清白蛋白呈显著负相关.尿液中足细胞微粒数量与年龄，收缩压，舒张压，总胆固醇，甘油三酯，血清肌酐和eGFR水平无相关关系。
3、ROC曲线分析CKD患者尿液中足细胞微粒对肾小球硬化的诊断价值：
如图6中ROC曲线分析结果显示：尿液中足细胞微粒诊断肾小球硬化的曲线下面积为0.66(95％CI:0.52–0.79)，敏感性51.3％，特异性为85.7％，约登指数为0.40(图6A)。尿液中足细胞微粒诊断CKD的曲线下面积为0.82(95％CI:0.74–0.91)，敏感性85.7％，特异性为67.9％，约登指数为0.54(图6B)。
4、CKD患者尿液中足细胞微粒与肾小球球性硬化程度的相关性分析：
如表1所示，CKD患者尿液中足细胞微粒与肾小球球性硬化程度呈显著负相关关联，提示在CKD晚期，肾小球硬化程度加重，肾脏原位足细胞数量降低，尿液中足细胞微粒的释放水平也随之降低。因此，尿液中足细胞微粒的检测可辅助判断CKD患者肾小球硬化损伤程度。
表1

Claims (7)

1.一种慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，其特征在于，所述标志物为尿液中足细胞微粒。
2.根据权利要求1所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，其特征在于，所述足细胞微粒为足细胞在激活或发生凋亡时细胞膜出芽释放的直径在100-1000nm大小的双层膜囊泡状结构，而非外泌体。
3.根据权利要求1所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物，其特征在于，所述标志物优选能够携带足细胞特异性膜蛋白podocalyxin。
4.一种用于检测权利要求1所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够与所述标志物中的podocalyxin蛋白发生特异性结合的流式荧光抗体和与磷脂酰丝氨酸特异性结合的流式荧光抗体，以及能够用于检测所述足细胞微粒的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括蛋白酶抑制剂，annexinV缓冲液，0.8μm标准微球，3μm标准微球，APC标记的能与磷脂酰丝氨酸特异性结合的annexin-V流式荧光抗体，PE标记的能podocalyxin蛋白发生特异性结合podocalyxin流式荧光抗体。
6.一种权利要求1所述的慢性肾小球疾病肾小球硬化标志物在制备分离和检测尿液中足细胞微粒的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集尿液，低速离心，保留上清液，加入蛋白酶抑制剂；
(2)低速离心留取上清液，再高速离心获得微粒沉淀，利用annexin V缓冲液重悬微粒沉淀；
(3)利用0.8μm标准微球和3μm标准微球作为流式细胞仪检测过程中的定量和定位参照，并采用APC标记的annexin-V流式抗体，PE标记的podocalyxin流式抗体标记足细胞微粒；
(4)通过流式细胞仪检测尿液中足细胞微粒绝对数量。
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