CN111477268B - 一种糖蛋白n-糖组图谱模型的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖蛋白N‑糖组图谱模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测样品中N‑糖苷键相连的糖链以获得特定糖型及丰度信息的N‑糖指纹图谱；(2)针对N糖指纹图谱中特异性N糖结构与丰度的Peak1、Peak2及Peak8建立模型：FIB‑G＝0.100×P1+0.612×P2‑0.445×P8+0.015。本发明提供的糖蛋白N‑糖组图谱模型的建立方法及其构建的图谱模型操作简单，灵敏度高，重复性高，稳定性好，临床适宜性强。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种新型肝硬化和/或肝纤维化糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法及其应用。
背景技术
肝硬化(cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化临床诊断过程中需综合考虑包括临床表现、实验室检查、组织学、影像学及组织病理学诸多依据。肝硬化由肝纤维发展而来，晚期肝硬化作为终末期肝病，具有不可逆特性，严重影响肝功能并可导致肝功能衰竭而影响患者生存，因此早期发现才能实现早期干预，病理组织学检查仍是目前诊断肝纤维化和早期肝硬化的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查可能带来的损伤不宜动态检测重复进行、存在取材差异、不同病理医师判读差异等，寻求非损伤性肝纤维化、肝硬化早期诊断标志物成为这一领域科学家研究的目标。因此，近年来国内外虽然已经发展了多项非创诊断技术用于评估肝纤维化，包括测定肝脏硬度的影像学技术、血清学标志和各类评分系统等，这些标志物主要包括纤维化密切相关的细胞外基质成分例如：透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原肽和IV型胶原等，以及间接反映肝纤维化对机体相关机能损伤的指标例如血小板计数(PLT)、r-球蛋白、凝血酶原时间(PT)、谷丙转氨酶、胆红素和载脂蛋白A1等，但目前现有的非创血液诊断方法在临床应用中敏感性和特异性仍然不能满足临床需求。
肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的共同终末途径，可进展为肝硬化，甚至进展为肝衰竭和肝癌，对于肝纤维化和代偿期肝硬化进行早期诊断非常重要。肝穿刺活检是诊断肝纤维化的金标准，但穿刺有创伤性且可能引起严重并发症，需要有经验的病理科医生对结果分析，且穿刺取标本时存在误差等缺点限制了其广泛的临床应用。目前肝纤维化诊断的金标准仍然为病理学诊断，但鉴于病理学检测固有的缺陷，目前无创检查已逐渐成为临床发展的方向。
发明内容
鉴于此，本申请提供一种糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法及图谱模型，该方法具有灵敏度高、操作简单、重复性高、稳定性好等优点，临床适宜性强，适用于临床检验科，可用于临床推广使用。
本发明提供了一种糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，包括如下步骤：
(1)检测待测样品中N-糖苷键相连的糖链以获得特定糖型及丰度信息的N-糖指纹图谱；
(2)基于N-糖指纹图谱，选择Peak1、Peak2及Peak8，采用logistic回归模型构建了基于N-糖谱的多参数模型：FIB-G＝0.100×P1+0.612×P2-0.445×P8+0.015；
其中，P1是N-糖指纹图谱中Peak1的丰度，P2是N-糖指纹图谱中Peak2的丰度，P8是N-糖指纹图谱中Peak8的丰度。
在本申请的一个具体实施方式中，所述步骤(1)中使用DNA测序仪(ABI3500)进行N-糖链检测，采用GeneMapper 4.1软件分析特定糖型及其丰度信息，并通过SPSS(13.0)软件对数据进行统计学分析。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样品为离体血清样品。优选地，所述待测样品为人血清样品。
在本发明的一个具体实施方式中，所述N-糖指纹图谱可通过荧光毛细管电泳、液相色谱或液质联用等检测方法所获得的。
在本发明的一个具体实施方式中，所述NGFP方法是基于DNA测序仪(ABI3500)的毛细管糖电泳技术(DSA-FACE)，将血清样本中的糖蛋白经过酶解释放出N-糖链，并将N-糖链进行荧光标记后，用毛细管电泳进行分离，同时测量荧光信号得到N-糖链的结构和丰度信息即N-糖组图谱。该检测技术对样品需求量较少，其仅需2微升血清。
在本申请的一个具体实施方式中，所述糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法包括待测样品的处理，例如血清的处理。所述血清的处理包括以下步骤：释放所述待测样品中的糖链，荧光标记所述待测样品中的N-糖链，以及去除所述待测样品中的唾液酸。
在本申请的一个具体实施方式中，所述糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法具体包括如下步骤：
①糖链释放：采用PNGaseF试剂对血清蛋白进行酶切分离，获得血清总N-糖链；
②荧光标记：采用APTS试剂对所述步骤①中的N-糖链进行荧光标记；
③去除唾液酸：采用唾液酸酶将所述步骤②中的N-糖链末端的唾液酸切除，以避免带有负电荷的末端唾液酸对电泳的影响；
④DNA测序仪检测：使用DNA测序仪(ABI3500)检测所述步骤③中的N-糖链，以获得血清N-糖图谱，采用GeneMapper 4.1软件或SPSS(13.0)软件进行N-糖图谱各峰值读取和数据分析，即可得到血清N-糖指纹图谱(NGFP)。
在本申请的一个具体实施方式中，当FIB-G大于-0.445时，则为重度肝纤维化；当FIB-G大于-0.22时，则为肝硬化；当FIB-G小于-0.22时，则为非肝硬化。
本申请另一方面提供组合物在制备肝硬化和/或肝纤维化试剂中的应用，所述组合物包括NGA2F、NGA2FB和NA3。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组合物通过模型FIB-G＝0.100×P1+0.612×P2-0.445×P8+0.015的计算结果来诊断肝硬化和/或肝纤维化分期，其中，P1是NGA2F在N-糖指纹图谱中的丰度，P2是NGA2FB在N-糖指纹图谱中的丰度，P8是NA3在N-糖指纹图谱中的丰度。
在本申请的一个具体实施方式中，所述模型的FIB-G大于-0.445时，则为重度肝纤维化；所述模型的FIB-G大于-0.22时，则为肝硬化；所述模型的FIB-G小于-0.22时，则为非肝硬化。
在本申请的一个具体实施方式中，所述模型在应用于肝纤维化时，以约登指数最大为原则，其最佳截断值(cut-off值)为-0.445，其敏感度为65.15％，特异度为82.28％。
本申请又一方面还提供一种模型在制备肝硬化和/或肝纤维化试剂中的应用，所述模型为FIB-G＝0.100×P1+0.612×P2-0.445×P8+0.015，其中，P1是NGA2F在N-糖指纹图谱中的丰度，P2是NGA2FB在N-糖指纹图谱中的丰度，P8是NA3在N-糖指纹图谱中的丰度。
本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法及其构建的图谱模型操作简单，灵敏度高，重复性高，稳定性好，临床适宜性强。
附图说明
图1为肝硬化与非肝硬化血清中相同N糖结构丰度比值图。
图2-A至图2-M为肝硬化LC、慢性肝病CH及健康对照HC三组对象的不同糖型丰度的比较。
图3为不同诊断指标在肝硬化诊断中的ROC曲线图。
图4-A至图4-M为肝纤维化组织学不同分期的糖型丰度比较。
具体实施方式
下面对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1构建模型
收集2010年5月-2019年12月期间上海东方肝胆外科医院、上海长征医院、昆明医科大学附属第一医院、福建孟超肝胆医院共374例肝硬化(liver cirrhosis,LC)、非肝硬化慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)182例，健康阴性对照(healthy negativecontrol,NC)200例样本。
所有入组患者均符合以下标准：
肝硬化的诊断标准：(1)肝脏活组织检查病理学符合肝硬化表现者；(2)血生物化学检查显示血清白蛋白水平降低(<35g/L)或PT延长(较对照延长>3s)；(3)影像学检查显示肝硬化和/或门静脉高压征象；内镜检查显示食管静脉曲张和/或肝脏硬度值测定符合肝硬化。
CHB患者诊断标准：HBsAg阳性超过6个月的患者，血清ALT水平反复或持续升高(超过参考上限2倍以上，且排除其他导致ALT升高的原因)或者肝脏病理学有慢性病毒性肝炎的特点，可检出HBV DNA(>104IU/mL)时，方可判定为CHB。
健康阴性对照人群入选标准：肝功能生化指标均为正常，无肝脏慢性疾病及其他恶性肿瘤史。排除标准：排除肝癌、其他器官肿瘤或重大疾病；样本信息不完整；合并乙肝等其他肝炎病毒感染。
所有入选参与者均签署知情同意书，均收集相关样本进行血清N-糖指纹图谱(N-glycan fingerprint,NGFP)检测。
入选的LC、CHB以及NC人群的基本信息见表1。入选人群的年龄、性别、总胆红素、总蛋白等指标在训练组及验证组之间无显著性差异(P>0.05)，基本可认为两组之间所入选人群的基线信息在统计学上无显著性差异。
表1：肝硬化(LC)和慢乙肝(CHB)及阴性对照(NC)人群的基本信息
*：分类变量给出了相关数值(或百分比值)，所有数据以平均值±标准差或中位数(四分位数间距)表示，使用卡方检验或费舍尔精确检验比较分类变量的关联性分析，使用独立t检验或Mann-Whitney U检验进行连续组间变量比较。
血清处理
①糖链释放：采用PNGaseF试剂对2微升含有寡糖链的血清蛋白进行酶切分离，获得血清总N-糖链；
②荧光标记：采用APTS试剂对N-糖链进行荧光标记；
③去除唾液酸：采用唾液酸酶将N-糖链末端唾液酸切除，以避免带有负电荷的末端唾液酸对电泳的影响；
④DNA测序仪检测：使用DNA测序仪(ABI3500)进行N-糖链检测，以获得血清N-糖图谱，采用GeneMapper 4.1软件或SPSS软件(13.0)进行N-糖谱各峰值读取和数据分析。肝硬化(LC)与非肝硬化(CHB+HC)患者血清中相同结构的糖的丰度比值如图1所示。
如图1所示，通过上述检测所得的结果为分布不同的13个峰(即：P1-P12，其中P9有两个峰，第二个为P9p)，其每个峰都代表了不同糖链的结构及丰度。
肝硬化LC、慢性肝病CH及健康对照HC三组对象的不同糖型丰度比较如图2-A至2-K所示。
申请人通过分析图1和图2-A至2-K，选择Peak1(NGA2F)、Peak2(NGA2FB)和Peak8(NA3)，采用logistic回归模型构建了基于N-糖谱的多参数模型建立模型：FIB-G＝0.100×Peak1+0.612×Peak2-0.445×Peak8+0.015作为鉴别肝硬化分期诊断的血清学标志物组合及算法，并建立以下判断规则：FIB-G大于-0.445时，则判读为中、重度肝纤维化；FIB-G大于-0.22时，则判读为肝硬化(LC)；FIB-G小于-0.22时，则表明患者为非肝硬化。
实施例2不同诊断模型诊断肝硬化的比较
利用ROC曲线比较不同诊断模型鉴别肝硬化LC的效率，其实验结果如图3和表2所示。
表2不同指标对鉴别肝硬化与正常对照的诊断效率评价
如表2和图3所示，本发明方法计算得到的FIB-G用于鉴别肝硬化与正常对照的ROC曲线下面积为0.821,高于目前用于肝硬化诊断的标志物HA(AUC＝0.703)与IVC(AUC＝0.758)，以-0.22为最佳截断值，其诊断敏感性比单独使用HA与IVC提高10.13％，特异性相比HA与IVC分别提高43.48％与22.21％。因此，FIB-G模型可显著提高肝硬化诊断效率，优于单独使用HA与IVC。与log(P2/P8)模型相比较，二者的特异度相同，但FIB-G模型的敏感度较log(P2/P8)模型提高了3.81％。
实施例3不同诊断模型对肝纤维化分期的诊断效率评价
本申请构建的诊断模型不仅可以诊断肝纤维化，还能够对肝纤维化患者进行分期。
肝纤维化分期标准(国内S2000)：
实施例1中的患者，肝脏穿刺标本均经三位病理专家进行病理学确认后，进行肝纤维化GS分期。
表3不同诊断标志物对鉴别肝纤维化S0-2与S3-4的诊断效率评价
肝纤维化组织学不同分期的糖型丰度统计学分析如图4所示(其中图4-A至4-K中，S0为16例，S1为53例，S2为60例，S3为39例，S4为53例)。结果表明，Peak 1、Peak 2、Peak 3、Peak 5、Peak7、Peak 8、Peak 9与Peak 11对应的糖型丰度在纤维化不同分期之间均具有显著性差异。进一步，评价了FIB-G模型与APRI、FIB-4模型对鉴别肝纤维化S0-2与S3-4的诊断效率(结果见表3)。FIB-G用于鉴别肝纤维化分期S3-4与S0-2的ROC曲线下面积为0.78，要优于目前常用的肝纤维化诊断模型APRI(AUC＝0.759)与FIB-4(AUC＝0.774)。以-0.445为最佳截断值，其敏感度为65.15％，而特异性相比APRI与FIB-4，分别提高了21.46％和4.84％(说明：其中APRI：AST/血小板×100；FIB-4：年龄*AST/(PLT*ALT平方根)，APRI与FIB-4均为非N-糖组诊断模型，APRI，FIB-4已经多次列入中国慢乙肝防治指南)
由上可知，本申请基于NGFP技术，根据N-糖指纹图谱中的特定结构糖型构建模型，不仅能够对早期LC(肝硬化)患者进行诊断，还能够辅助临床对肝纤维化进行分期，其判断肝纤维化S3-4和S0-2的cut-off值为-0.445，具有灵敏度高、操作简单、重复性高、稳定性好等优点，临床适宜性强，适用于临床检验科，可用于临床推广使用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)检测待测样品中N-糖苷键相连的糖链以获得特定糖型及丰度信息的N-糖指纹图谱；
(2)基于N-糖指纹图谱，选择Peak1、Peak2及Peak8建立模型FIB-G＝0.100×P1+0.612×P2-0.445×P8+0.015；
其中，P1是N-糖指纹图谱中Peak1的丰度，P2是N-糖指纹图谱中Peak2的丰度，P8是N-糖指纹图谱中Peak8的丰度；
所述方法还包括：释放所述待测样品中的糖链，即采用PNGaseF试剂对2微升含有寡糖链的血清蛋白进行酶切分离，获得血清总N-糖链；采用APTS试剂荧光标记所述待测样品中的N-糖链；采用唾液酸酶去除所述待测样品中的唾液酸。
2.如权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用DNA测序仪进行N-糖链检测，采用GeneMapper软件分析特定糖型及其丰度信息，并通过SPSS软件对数据进行统计学分析。
3.如权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述待测样品为离体血清。
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