CN109100410B - 肝硬化的血清糖蛋白n-糖组图谱模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝硬化的血清糖蛋白N‑糖组图谱模型的建立方法。所述方法采用G‑Test检测方法检测血清糖蛋白N‑糖组图谱，建立肝硬化患者和正常对照人员具有显著差异的N‑糖组图谱模型，筛选出肝硬化组和正常对照组间存在显著表达差异的NA3。基于本发明方法构建的N‑糖组图谱模型，对肝硬化的检测灵敏度和特异性分别达到84.3％和85.0％。在后续应用中，通过比对待检测人员血清的N‑糖组图谱中与本方法建立的图谱模型中单峰NA3的峰值，能够对待检测人员的肝硬化程度进行检测。基于本发明方法，能够让众多肝硬化患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测肝硬化的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。

Description

肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法。
背景技术
肝硬化(cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。目前认为引起肝硬化前三位最主要的原因有酒精、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒感染(hepatitis C virus,HCV)。全球范围内，57％的肝硬化是由乙型肝炎病毒(30％)和丙型肝炎病毒感染(27％)引起的，在发展中国家，主要由乙型肝炎病毒引起肝硬化。
肝硬化临床诊断过程中需综合考虑包括临床表现、实验室检查、组织学、影像学及组织病理学诸多依据。肝组织活检可提供肝纤维化分期的重要信息，肝组织学中弥漫性肝纤维化伴假小叶形成。由于肝组织活检存在一定风险，且单个肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体纤维化程度，因此，近年来发展了多项非创诊断技术用于评估肝纤维化，包括测定肝脏硬度的影像学技术、血清学标志和各类评分系统等。血清生化直接指标主要包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原肽和IV型胶原等，间接指标主要包括血小板计数(PLT)、r-球蛋白、凝血酶原时间(PT)、谷丙转氨酶、胆红素和载脂蛋白A1等，但是上述指标诊断肝硬化均缺乏特异性。各种常用的影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像(MRI)等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓不规则、肝实质的回声不均匀增强或CT值增高或呈结节状、各叶比例改变、脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等肝硬化和门脉高压的征象。彩色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。尽管不少研究发现肝脏超声半定量打分与肝组织纤维化分级有良好的相关性，但是目前来说对早期肝硬化不够敏感，对于纤维化的诊断难以定量化。肝脏弹力测定主要包括瞬时弹性波扫描(Fibroscan)和核磁共振弹性测定技术(magnetic resonanceelastography)。此类技术的优点是能够测定更大的范围甚至整个肝脏的弹性情况，在一定程度上弥补了肝活组织检查存在的取样误差不足；其缺点为肝脏脂肪沉积、腹水、腹腔炎等情况可影响测定效果。此类技术尚不能区分相邻的肝纤维分期，但对于诊断代偿性肝硬化有一定的临床指导意义。
糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。糖蛋白具有多种生物功能。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。
糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，目前糖链结构的分析方法主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：该方法分辨率高、检测速度快和重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
G-Test检测法(Glycan-Test)是基于DNA测序仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将血清样本中糖蛋白的N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N-寡糖链的含量即指纹图谱(简称G-Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
发明内容
针对现有的肝硬化检测中，血清学标志检测缺乏特异性，影像学检测易受检测环境影响，特异性和准确度不高的问题，本发明提供了肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，通过建立该模型，筛选出NA3(三天线)作为特异性标记物，能够用于肝硬化的诊断。
本发明的技术方案如下：
肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，具体步骤如下：
步骤1，收集肝硬化患者和正常对照人员的血清；
步骤2，配制含有5％SDS(十二烷基硫酸钠)的浓度为10mM、pH为8.3的NH4HCO3溶液为试剂A，试剂B由2.2U/μL的PNGaseF与3.33％的NP-40按体积比为1：20混合配制，试剂C由20mM APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸)和1M NaCNBH3等体积混合配制，试剂D由100mM NH4AC、2mU/μL的唾液酸酶和双氧水按体积比为5：1：14混合；
步骤3，寡糖链的制备：往稀释一倍的血清中加入一半体积的试剂A，95℃反应5min变性，然后加入与血清体积相同的试剂B，37℃反应3h后干燥；
步骤4，寡糖链的标记：在步骤3的液体中加入与试剂A体积相同的试剂C，65℃反应3h进行荧光标记，然后加入水终止标记反应；
步骤5，去唾液酸处理：取等体积的步骤4荧光标记后的液体与试剂D在45℃反应3h，然后加入水终止反应；
步骤6，寡糖链分离分析：取步骤5唾液酸处理后的液体，用DNA测序仪进行片段分析，得到N-糖组图谱；
步骤7，将得到的N-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，然后对量化后的肝硬化组和正常对照组N-糖组图谱中的NA3的峰值进行比对统计分析。
步骤1中，所述的血清经过灭活处理。
步骤4中，血清样品的荧光标记时间3h是确保标记的成功率，一般实验条件下2.5h即可满足试验要求。
步骤5中，去除末端唾液酸的反应时间为3h，为了确保酶的充分接触反应，延长至4h可以让反应更完全。
步骤7中，NA3的相对含量的cut-off值为6.18。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明方法采用灵敏度高、操作简单、仅需微量样品、重复性高、稳定性好和高通量的G-Test检测方法，建立了肝硬化患者和正常对照人员具有显著差异的N-糖组图谱模型，筛选出肝硬化组和正常对照组间存在显著表达差异的NA3。在后续应用中，通过比对待检测人员血清的N-糖组图谱中与本方法建立的图谱模型中单峰NA3的峰值，能够对待检测人员的肝硬化程度进行检测，与现有技术相比，具有更高的特异性以及准确度，对肝硬化的检测灵敏度和特异性分别达到84.3％和85.0％。基于本发明方法构建的N-糖组图谱模型，能够让众多肝硬化患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测肝硬化的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。
附图说明
图1为正常对照组(A)与肝硬化组(B)的血清糖蛋白N-糖组图谱。
图2为NA3用于鉴别诊断肝硬化的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件，试剂都为细胞培养专用。
利用G-Test检测技术对收集的130例肝硬化和对照组的血清样本进行处理，其中乙肝病毒引起的肝硬化患者血清60例，不携带乙肝病毒的正常对照组血清70例。对G-Test检测技术测定样本得到的N-糖组图谱进行统计学分析。
(1)检测样本：
乙肝病毒引起的肝硬化患者血清60例，不携带乙肝病毒的正常对照组血清70例。
(2)实验设备：
ABI3500dx DNA测序仪(Applied Biosystems美国生物应用公司)，PCR，离心机。
(3)试剂制备：
试剂A：SDS溶于10mM的NH4HCO3中，配制含有5％SDS、pH为8.3的NH4HCO3溶液。
试剂B：2.2U/μL的PNGaseF与3.33％的NP-40按体积比为1：20混合配制；
试剂C：混合同等体积的20mM APTS和1M NaCNBH3；
试剂D：100mM NH4AC，唾液酸酶(neuraminidase，2mU/μL)和双氧水按体积比为5：1：14混合。
(4)G-Test检测
步骤1，寡糖链的制备：往稀释一倍的4μL血清加入2μL的试剂A，95℃反应5分钟变性，然后加入同等体积的(4μL)的试剂B，37℃反应3小时后干燥；
步骤2，寡糖链的标记：在步骤1的液体中加入2μL的试剂C，65℃反应3小时进行荧光标记，然后加入200μL的水终止标记反应；
步骤3，标记后处理：取2μL荧光标记后的步骤2液体，加入2μL的试剂D，45℃反应3小时，然后加入200μL的水终止反应；
步骤4，寡糖链分离分析：取10μL步骤3反应后的液体，用ABI3500dx测序仪进行N-寡糖链分离，得到N-糖组图谱。
步骤5，将得到的N-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和定量计算得到每个峰的相对含量，进行统计学分析。
如图1所示，人血清的N-糖组图谱大概显示出近9个N-寡糖链峰，寡糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在N-糖组图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，所测出的峰高代表了寡糖链的相对浓度含量，A为正常对照组，B为肝硬化组。图1中，正常对照组中的NA3的相对含量为7％，乙肝肝炎肝硬化组的NA3的相对含量为3％，可以看出，乙肝肝硬化组与正常对照组的单峰NA3的寡糖含量有着显著差距。
对N-糖组图谱的各个峰值进行量化，然后对肝硬化组(60例)和正常对照组(70例)进行统计学分析，发现单峰NA3在两组的区分上具有统计学意义(p＜0.05)。ROC曲线分析显示，单峰NA3在检测肝硬化患者时具有显著的临床意义，即AUC可达0.912(图2)。用模型检测NA3时，规定cut-off值为6.18时，对肝硬化的检测灵敏度和特异性分别达到有84.3％和85.0％，而现有的Zeng Score和Hui Score血清标志物检测的灵敏度和特异性分别为59.1％、60％和56.8、68.9％(European Association for the Study of theLiver.EASL-ALEH Clinical Practice Guidelines:Non-invasive tests forevaluation of liver disease severity and prognosis[J].Hepatology,2015，63：237-264.)，显然地，本模型的检测灵敏度和特异性更高。结果说明血清中NA3的含量的改变与肝硬化患者疾病的发生存在显著的相关性。

Claims (2)

1.肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，收集肝硬化患者和正常对照人员的血清；
步骤2，配制含有5％SDS的浓度为10mM、pH为8.3的NH4HCO3溶液为试剂A，试剂B由2.2U/μL的PNGaseF与3.33％的NP-40按体积比为1：20混合配制，试剂C由20mM APTS和1M NaCNBH3等体积混合配制，试剂D由100mM NH4AC、2mU/μL的唾液酸酶和双氧水按体积比为5：1：14混合；
步骤3，寡糖链的制备：往稀释一倍的血清中加入一半体积的试剂A，95℃反应5min变性，然后加入与血清体积相同的试剂B，37℃反应3h后干燥；
步骤4，寡糖链的标记：在步骤3的液体中加入与试剂A体积相同的试剂C，65℃反应3h进行荧光标记，然后加入水终止标记反应；
步骤5，去唾液酸处理：取等体积的步骤4荧光标记后的液体与试剂D在45℃反应3h，然后加入水终止反应；
步骤6，寡糖链分离分析：取步骤5唾液酸处理后的液体，用DNA测序仪进行片段分析，得到N-糖组图谱；
步骤7，将得到的N-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，然后对量化后的肝硬化组和正常对照组N-糖组图谱中的NA3的峰值进行比对统计分析，NA3的相对含量的cut-off值为6.18。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述的血清经过灭活处理。
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