CN104792900B

CN104792900B - 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法

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Publication number: CN104792900B
Application number: CN201510224878.8A
Authority: CN
Inventors: 华权高; 沈鹤霄
Original assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-05-06
Also published as: CN104792900A

Abstract

本发明公开了一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，采用的技术方案是：将尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱‑串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。本发明的相对定量方法具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。

Description

一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学的技术领域，具体涉及一种采用蛋白质组学测定急性肾损伤患者尿液中生物标志物的方法。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指病程在3个月以内的肾脏结构与功能的异常(包括血、尿、组织学及影像学检查异常)，它以肾小球滤过率迅速下降为特征，是由不同病因导致的、具有不同临床表现的临床综合征。

随着人口的老龄化，糖尿病、心血管疾病、造影剂肾病发病率的增加，近年来AKI的发生率明显增加。尽管对AKI的认识不断深入，支持和辅助的治疗措施也有不断进展，但AKI的预后仍差，死亡率居高不下。改善AKI预后的关键是早期诊断，早期干预。

目前AKI的诊断标准为：肾功能在48h内突然减退，表现为至少两次血清肌酐升高的绝对值≥26.5μmol/L；或血清肌酐较基础值升高≥50％；或尿量<0.5ml/(kg·h)，时间超过6h(排除梗阻性肾病或脱水状态)。

由此可见，目前对AKI的诊断仍基于血清肌酐和尿量的测定，但它们并不能在早期反映肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)的下降，且受到众多外在因素的影响。因此以肌酐测定为基础的肾功能评价体系阻碍了AKI治疗的进展，需要用更加敏感、特异的方法测定肾功能的下降。

理想的AKI生物标志物最好具备如下特点：(1)检测标本容易获得，无创，易于在床边或临床标准实验室进行，快速、方便、测定费用低廉；(2)对AKI高度敏感，能早期发现和诊断AKI；(3)具有较宽的动态范围和诊断阈值，便于统计学分析；(4)能鉴别损伤部位(近端肾小管、远端肾小管、肾间质或肾血管)；(5)能评价肾脏损伤的持续时间(AKI、慢性肾脏病或慢性肾衰急性加重)；(6)能鉴别AKI的病因(缺血、中毒、混合型)；(7)能定义AKI的病程以及监测对AKI干预的临床效果；(8)在探索新药治疗AKI方面发挥关键作用。

近年来，随着功能性基因组学和蛋白质组学的发展，研究人员从血液或尿液样本中逐渐筛选出一些有临床应用前景的AKI新型生物标志物，这些新的标志物不仅能在血清肌酐升高之前诊断AKI，而且能为AKI的病因诊断提供帮助。2014年由Azra Bihorac和Lakhmir S Chawla等于Am J Resp Crit Care杂志上最新发表的文献《Validation ofcell-cycle arrest biomarkers for acute kidney injury using clinicaladjudication》报道确定了急性肾损伤的两个新标志物。同时，该研究小组验证了这两个新的标志物：尿中的金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)，当用这两个指标一起评估时，就能便于临床医生在现行标准指示疾病发生之前检测和治疗AKI。

目前，关于金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的准确定量检测手段并没有完整和确定的方法，因此，为了让这两个指标能够尽早的应用于诊断，辅助临床医生对急性肾损伤的诊断，需要开发一种方法对这两种物质进行准确的定量，为后续的研究和临床应用提供一种检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定尿液样本中金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)生物质谱相对定量方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。

进一步地，所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐。

进一步地，所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶。

进一步地，所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3-5倍体积的丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量。

进一步地，所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL 0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12-16小时，得到多肽片段溶液。

进一步地，所述样本脱盐方法为：首先用100％甲醇平衡C18柱1min，然后将酶切得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80％的乙腈溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液。

进一步地，所述液相色谱-串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptideC18柱，50mm×2.1mm I.D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速500μl/min；进样量20uL；所述的梯度洗脱程序如下表所示：

时间(min)	流速(μl/min)	％A	％B
				0.3	500	95	5
30	500	60	40
				45	500	20	80
18	500	20	80
				51	500	95	5
60	500	95	5

其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈混合溶液；

质谱条件为：四级杆飞行时间液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力15psi；源内气体2：氮气压力0psi；气帘气体：氮气压力30psi；扫描方式为多重反应监测。

进一步地，所述的生物信息分析方法为：用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计算出样本中金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对含量。

本发明提供的一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，具有的优势在于：

1、对正常和疾病状态的样本可同时进行分析和定量，具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。

2、尿液样品经过干燥和复溶处理可以使样本得以浓缩，提高样本中的蛋白浓度，便于后续的蛋白提取，同时减弱了样品测定过程中基质干扰，使得测定结果更准确且定量下限降低。

3、蛋白溶液经过酶解和脱盐处理，减少了盐分对质谱分析仪的污染，有利于仪器的维护，同时测定的结果也更加可靠。

4、本发明所用试剂及药品均采用现有的常规市售试剂或常规市售试剂的组合，且配制方法简单，利于方法推广。

5、本发明的样品处理过程和定量方法简单易行，对尿液中其他蛋白含量的检测有一定的借鉴意义，可用于其他疾病尿液诊断标志物的检测及疾病与对应诊断标志物的关联性研究。

附图说明

图1为本发明实施例提供的(TIMP)-2和IGFBP7所包含的肽段的比值。

其中P16035是金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2在uniprot数据库里的编码，对应的图显示的是病人和正常对照组尿液样本中金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2所包含的肽段的比值；其中Q16270是胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在uniprot数据库里的编码，对应的图显示的是病人和正常对照组尿液样本中胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)所包含的肽段的比值。

具体实施方式

实施例1尿液样本中金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)生物质谱相对定量方法

由于对于质谱定量检测而言，要求上机检测的样本蛋白含量不少于50ug，蛋白浓度不低于5ug/uL。所以对收集到的尿液样本需要进行前期的处理。步骤如下：

(1)样本收集与干燥处理

收集正常人群(即为正常组)和急性肾损伤病人(即为病人组)的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，其中正常组和病人组的样本量均为3个样本，每个样本取200uL用于真空冷冻干燥；真空冷冻干燥的条件为：温度-80℃，压缩泵抽真空。

(2)样本复溶

将(1)步的6份经过真空冷冻干燥得到的样品分别用100uL超纯水复溶。

(3)蛋白提取

向(2)步复溶的6份样本溶液中分别加入400uL的丙酮，混匀，并于室温下放置半小时使样本中的蛋白充分沉淀，并于4℃，12000rpm下离心15分钟，弃上清，收集蛋白沉淀。

(4)蛋白复溶

将(3)步经过离心收集到的蛋白沉淀物分别用100uL超纯水进行复溶，得到目标蛋白溶液。

(5)蛋白定量

将(4)步得到的蛋白溶液采用传统的Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量；具体的蛋白溶液的Bradford定量方法可参考实验手册。初步定量的目的是为了确定蛋白溶液中大概的蛋白含量，如果不满足上机检测的样本蛋白含量不少于50ug，蛋白浓度不低于5ug/uL的要求，要进行样本浓缩。

(6)样本酶切

向经过Bradford定量方法定量的蛋白溶液加入400uL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL 0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12-16小时得到酶解液，将酶解液于12000rpm离心15min收集上清即为多肽片段溶液。

(7)样本脱盐

将(6)步得到的多肽片段溶液用C18柱进行脱盐处理，收集多肽片段溶液；

C18柱对酶解样本进行脱盐处理的具体操作步骤如下：

①用100％甲醇平衡C18柱，甲醇平衡C18柱的时间为1分钟；具体的操作步骤为，于C18柱中加入1ml甲醇溶液，至液体自然流完；

②将(6)步得到的多肽片段溶液用注射器注入C18柱中，至液体自然流完，让酶解的多肽吸附到C18柱上；

③用超纯水过吸附多肽片段的C18柱，以洗脱掉盐分；具体的操作步骤为，于C18柱中加入1ml质谱级超纯水，至液体自然流完；质谱级超纯水的洗脱次数为2次。

④超纯水脱盐完成之后，用80％的乙腈溶液将C18柱上吸附的多肽片段进行洗脱；具体的操作步骤为，于C18柱中加入1ml 80％的乙腈溶液，至液体自然流完；80％的乙腈溶液的洗脱次数为2次；得到的洗脱液收集于聚乙烯管中；

⑤将聚乙烯管中的洗脱液真空冷冻干燥，后用50ul的超纯水溶解，用于后续的质谱分析过程；

(8)质谱分析：将脱盐处理的多肽片段溶液上样分析，LC-MS/MS质谱检测，利用依赖于数据的采集模式(IDA/DDA)收集图谱；

分别取对照组和病人组的多肽溶液进样，方法为取20uL(7)步所得的多肽溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录图谱用于后续的生物信息学分析。在多肽溶液LC-MS/MS分析过程中具体的色谱和质谱条件如下：

色谱条件为：LC-20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速500μl/min；进样量20uL；所述的梯度洗脱程序，过程如下表1所示：

表1 梯度洗脱程序表

其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈混合溶液；梯度洗脱的好处就是能让样本充分分离，便于样本进样之后各个组分的分离及后续的质谱分析，一定程度的避免杂质的干扰，采用这个程序可以最大程度的减少杂质的干扰。

质谱条件为：Triple TOF5600⁺型四级杆飞行时间液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1.6数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力15psi；源内气体2：氮气压力0psi；气帘气体：氮气压力30psi；扫描方式为多重反应监测。

(9)生物信息分析：将(8)步得到的图谱进行生物信息分析，并计算出各个样本中金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的相对含量。在对质谱图谱数据分析的过程中用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计算出样本中金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的相对含量。该分析过程主要是利用分析软件对各个样本的质谱图进行分析，然后对图谱进行比较，分析病人组与正常组中两个蛋白的表达差异变化情况。

具体的质谱分析箱线图如图1所示，其中对数化的蛋白肽段的比例超过0值的就可以认为该蛋白在样本中异常表达，从图1可以看出中位数位于0值线(0值线：假设病人组与正常组中特定蛋白含量一致时)以上，代表病人组样本中蛋白的含量高于正常组样本，说明该检测方法在检测样本中这两种蛋白的含量是可行的。

数据分析的表格如下表2所示。

表2 数据分析表

由表2的结果可知，蛋白编号为P16035的蛋白质，其结果分析得分(Unused)为134分，该蛋白的分子量为5862Da，数据分析的结果显示，蛋白的覆盖度(Coverage)为42.23000109，属于覆盖度较好的蛋白，且该蛋白的特有肽段序列(#of Unique peptides)为31个，另外该蛋白的病人组与对照组的比值(Case/Control ratio)为6.42，且病人组与对照组比值的P-value值极小，属于差异显著的结果，比值的可信度高，结合以上信息可以判断出，蛋白编号为P16035的蛋白质即金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2在病人样本中显著表达，且与对照组差异明显；蛋白编号为Q16270的蛋白质，其结果分析得分为186.2分，该蛋白的分子量为8540Da，数据分析的结果显示，蛋白的覆盖度(Coverage)为72.56000161，属于覆盖度较好的蛋白，且该蛋白的特有肽段序列(#of Unique peptides)为71个，另外该蛋白的病人组与对照组的比值(Case/Control ratio)为2.73，且病人组与对照组比值的P-value值极小，属于差异显著的结果，比值的可信度高，结合以上信息可以判断出，蛋白编号为Q16270的蛋白质即胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在病人样本中显著表达。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，其特征在于：分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量；

所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐；

所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶；

所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3-5倍体积的丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量；

所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL 50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL 0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12-16小时，得到多肽片段溶液；

所述样本脱盐方法为：首先用100％甲醇平衡C18柱1min，然后将酶切得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80％的乙腈溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液；

所述液相色谱-串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速500μl/min；进样量20uL；所述的梯度洗脱程序如下：时间0.3min，流速500μl/min，95％A，5％B；时间30min，流速500μl/min，60％A，40％B；时间45min，流速500μl/min，20％A，80％B；时间18min，流速500μl/min，20％A，80％B；时间51min，流速500μl/min，95％A，5％B；时间60min，流速500μl/min，95％A，5％B；

质谱条件为：四级杆飞行时间液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力15psi；源内气体2：氮气压力0psi；气帘气体：氮气压力30psi；扫描方式为多重反应监测；

所述的生物信息分析方法为：用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计算出样本中金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对含量。