CN104764796A - 基于MALDI-ToF MS的血液中糖化血红蛋白含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化生指标检测技术领域，具体为一种基于MALDI-ToF MS的血液中糖化血红蛋白含量检测方法。本发明方法基本步骤为，首先对总血红蛋白进行氨基封闭，再对封闭蛋白进行靶上酶解；然后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到肽段谱图，记录蛋白N末端信号对，根据血红蛋白糖基化末端和非糖基化末端的质谱峰高，计算糖化血红蛋白含量。利用本发明方法可以在一块MALDI-ToF MS靶板上负载一百多个血液样本，并在单次进样中实现糖化血红蛋白的相对定量，可以用于临床上糖化血红蛋白快速高通量检测，为相关疾病（如糖尿病）诊断和治疗提供参考。
Description
技术领域
本发明属于化生指标检测技术领域，具体涉及一种血液中糖化血红蛋白含量检测方法。
背景技术
糖化血红蛋白（HbA1c）是判断糖尿病患者血糖控制效果的指标，2010年美国糖尿病协会将其列入糖尿病诊断的标准。糖化血红蛋白是血红蛋白β链N末端缬氨酸与葡萄糖的结合产物，该过程不依靠体内酶的催化，是一个不可逆的过程。糖化血红蛋白含量和血糖浓度成正比，测试糖化血红蛋白可以反映人体的血糖控制情况，有助于提高糖尿病的治疗效果。
目前，检测糖化血红蛋白的方法主要有，离子交换色谱法、电泳法、亲和色谱法、免疫比浊法以及酶法等。其中，利用色谱的方法，因其稳定性被广泛应用。离子交换色谱法和电泳法分别利用了糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白表面所带电荷或等电点不同，对血红蛋白进行分离，计算中HbA1c的相对含量。亲和色谱法利用糖化血红蛋白与硼酸的结合，实现总糖化血红蛋白的捕获和相对含量的计算。
基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）技术是近年来发展的一种新型的软电离生物质谱，并被广泛应用于蛋白和寡核苷酸的分析。相比色谱法而言，MALDI-ToF MS能够实现上百个样本同时进样，因此具有分析速度快、通量高的优势；同时，利用质谱的质量信号以及串级信号，能够对目标肽段的序列进行确认，可以避免色谱法中，血液里其他糖化蛋白或者与糖化血红蛋白电荷性质相近的蛋白造成的干扰；另外，MALDI-ToF MS谱图直观，且具有操作简单的特点。结合MALDI-ToF MS可以实现糖化血红蛋白的高通量的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液中糖化血红蛋白含量的高通量、快速的检测方法。
本发明提供的血液中糖化血红蛋白含量的检测方法，是基于MALDI-ToF MS的，即利用酶解后蛋白的末端肽段，对血液中糖化血红蛋白含量进行检测，其基本步骤为：先对总血红蛋白进行氨基封闭，再对封闭蛋白进行靶上酶解；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到肽段谱图，记录蛋白N末端信号对，根据血红蛋白糖基化末端和非糖基化末端的质谱峰高，计算糖化血红蛋白含量。该方法具体步骤如下：
（1）从EDTA 抗凝管中取血样，经离心机离心、生理盐水清洗，得到血红蛋白提取液；在靶板上滴加1份体积该提取液；
（2）再在靶上滴加0.3-1份体积封闭试剂，该封闭试剂为8 mM 甲醛和4 mM 氰基硼氢化钠的混合水溶液，利用激光照射至靶板点干；
（3）将胰蛋白酶溶解于5%-20%乙腈的水溶液中,酶的浓度为0.01-0.02 ug/uL，滴加1-2份体积胰蛋白酶溶液于氨基封闭后的蛋白点上，利用一定波长激光脉冲照射蛋白点进行酶解；
（4）在蛋白靶点上添加α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质，将靶板送入MALDI-ToF MS仪器中，利用酶解肽段的一级谱图，记录图谱中非糖基化末端肽段（峰m/z=3245.7 Da）的峰高H1和糖基化末端肽段（峰m/z=3395.3 Da）的峰高H2，按照公式：x= H2/( H1+ H2)*100%，计算糖化血红蛋白含量。
本发明中，血红蛋白提取采用常规方法，具体操作步骤可为：从EDTA 抗凝管中取10体积血样，在离心机上离心足够时间使得血红细胞沉降，去除血浆，得到血红细胞，用3000体积或更多的生理盐水清洗红细胞两遍，离心后去除上层盐水；在红细胞中加入2000体积去离子水，超声4-10min，离心取上清即为血红蛋白提取液。
本发明方法精密度测算：批内精密度取中值和高值样本各一份，重复测定20次；批间精密度取高低值样本各一份，重复测定20天。经本方法测定的中值样本值为3.75±0.34%，CV值为9.1%；高值样本值为4.96±0.42%，CV值为8.4%。
本发明方法线性范围：取同浓度的已知糖化血红蛋白含量的高值（10.90%）和低值（4.80%）样本各一份，按照3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，配成9.38%，8.87%，7.85%，6.83%，6.33%，共七份，各测三次取均值，并记录所有数据。经计算本方法线性范围为y=0.5207x+8E-05，R值为0.9994。
本发明方法准确度测算：选取已确诊糖尿病患者以及体检中心志愿者的血样标本共12例，分别用上海惠忠医疗有限公司提供的MQ-2000PT全自动糖化血红蛋白仪（HPLC法）和MALDI-ToF MS法同时各测量三次取均值，并记录所有数据。经计算，两种方法相关，R值为0.9985。HPLC法测定值=1.0086*MALDI-ToF MS法测定校正值-0.0007。
利用本发明方法可以在一块MALDI-ToF MS靶板上负载一百多个血液样本，并在单次进样中实现糖化血红蛋白的相对定量，可以用于临床上糖化血红蛋白快速高通量检测，为相关疾病（如糖尿病）诊断和治疗提供参考。
附图说明
图1 为一种基于MALDI-ToF MS鉴定血液中糖化血红蛋白含量的高通量方法的流程示意图。
图2 为糖化和非糖化血红蛋白N末端肽段信号对MALDI-ToF MS一级谱图。
图3 为MALDI-ToF MS方法线性范围。
图 4 为MALDI-ToF MS方法和HPLC法测定结果对照。
具体实施方式
实施例1：
本发明提供了一种血液中糖化血红蛋白含量检测方法，该方法步骤如下：
（1）从EDTA 抗凝管中取5 μL血样，在离心机上以1000 g 离心10 min去血浆，得到血红细胞，用1.5 mL生理盐水清洗红细胞两遍，离心后去除上层盐水；
（2）在红细胞中加入1mL去离子水，超声5min，离心取上清即为血红蛋白提取液；在靶板上滴加0.5 μL 该提取液；
（3）再在靶上滴加0.5 μL 封闭试剂，该封闭试剂为8 mM 甲醛和4 mM氰基硼氢化钠的水溶液，利用激光照射至靶板点干；
（4）将胰蛋白酶以0.02 μg / μL溶解于20% 乙腈的水溶液中，滴加0.5 μL胰蛋白酶溶液于氨基封闭后的蛋白点上，利用808 nm 激光以10s脉冲照射蛋白点进行酶解；
（5）在蛋白靶点上滴加1 μL 4 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质，将靶板送入MALDI-ToF MS仪器中，利用酶解肽段的一级谱图，记录图谱中非糖基化末端肽段（峰m/z=3245.7 Da）的峰高H1为1409和糖基化末端肽段（峰m/z=3395.3 Da）的峰高H2为37，按照公式：x= 37/0.5207(1409+ 37)*100%，计算糖化血红蛋白含量；
（6）经计算，该样本糖化血红蛋白含量为4.91%。
实施例2：
本发明提供了一种高通量血液中糖化血红蛋白含量检测方法，该方法步骤如下：
（1）从EDTA 抗凝管中取20μL血样，在离心机上以1000 g 离心10 min去血浆，吸取2μL血红细胞，用1 mL生理盐水清洗红细胞两遍，离心后去除上层盐水；
（2）在红细胞中加入1mL去离子水，超声5min，离心取上清即为血红蛋白提取液；在靶板上滴加0.5 μL 该提取液；
（3）再在靶上滴加0.5 μL 封闭试剂，该封闭试剂为8 mM 甲醛和4 mM氰基硼氢化钠的水溶液，利用激光照射至靶板点干；
（4）将胰蛋白酶以0.02 μg / μL溶解于20% 乙腈的水溶液中，滴加0.5 μL胰蛋白酶溶液于氨基封闭后的蛋白点上，利用808 nm 激光以10s脉冲照射蛋白点进行酶解；
（5）在蛋白靶点上滴加1 μL 4 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质，将靶板送入MALDI-ToF MS仪器中，利用酶解肽段的一级谱图，记录图谱中非糖基化末端肽段（峰m/z=3245.7 Da）的峰高H1为1907和糖基化末端肽段（峰m/z=3395.3 Da）的峰高H2为106，按照公式：x= 106/0.5207(1907+ 106)*100%，计算糖化血红蛋白含量；
（6）经计算，该样本中糖化血红蛋白含量为10.11%。
Claims (3)
1.一种基于MALDI-ToF MS的血液中糖化血红蛋白含量检测方法，其特征在于基本步骤为：先对总血红蛋白进行氨基封闭，再对封闭蛋白进行靶上酶解；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到肽段谱图，记录蛋白N末端信号对，根据血红蛋白糖基化末端和非糖基化末端的质谱峰高，计算糖化血红蛋白含量。
2.根据权利要求1所述的基于MALDI-ToF MS的血液中糖化血红蛋白含量检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）从EDTA 抗凝管中取血样，经离心机离心、生理盐水清洗，得到血红蛋白提取液；在靶板上滴加1份体积该提取液；
（2）再在靶上滴加0.3-1份体积封闭试剂，该封闭试剂为8 mM 甲醛和4 mM 氰基硼氢化钠的混合水溶液，利用激光照射至靶板点干；
（3）将胰蛋白酶溶解于5%-20%乙腈的水溶液中,酶的浓度为0.01-0.02 ug/uL，滴加1-2份体积胰蛋白酶溶液于氨基封闭后的蛋白点上，利用一定波长激光脉冲照射蛋白点进行酶解；
（4）在蛋白靶点上添加α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将靶板送入MALDI-ToF MS仪器中，利用酶解肽段的一级谱图，记录图谱中非糖基化末端肽段的峰高H1和糖基化末端肽段的峰高H2，按照公式：x= H2/( H1+ H2)*100%，计算糖化血红蛋白含量。
3.根据权利要求2所述的基于MALDI-ToF MS的血液中糖化血红蛋白含量检测方法，其特征在于步骤（1）中血红蛋白提取液获得过程为：
从EDTA 抗凝管中取10体积血样，在离心机上离心足够时间使得血红细胞沉降，去除血浆，得到血红细胞，用3000体积或更多的生理盐水清洗红细胞两遍，离心后去除上层盐水；在红细胞中加入2000体积去离子水，超声4-10min，离心取上清即为血红蛋白提取液。
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