CN115389598A - 糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一种糖化血红蛋白含量测定计量领域,尤其是涉及一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法。
背景技术
糖化血红蛋白是血红蛋白的一种重要的存在形式,是血液红细胞中血红蛋白与葡萄糖结合的产物。其中,HbA1c是血红蛋白HbA0中β链N端缬氨酸与己糖相连构成的糖蛋白。在红细胞120天左右的生命周期内,HbA0不断转变为HbA1c,因而HbA1c含量水平能够反映人体红细胞生命周期(2-3个月)内血糖平均浓度,同时也是血糖控制好坏的关键参数。
目前,糖化血红蛋白检测技术主要有硼酸亲和层析、抗原-抗体免疫学方法、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳和质谱技术等。这些方法在分离HbA1c和HbA0的前提下,将HbA1c(%)定义为:
即HbA0所对应糖化血红蛋白条带HbA1c在该同系物中的比例。
但有研究报道,存在含有某些异常血红蛋白,导致HbA1c无法被分离检测到的情况(蒋伏松.云南基诺族成人糖尿病患病率调查及便携式糖化血红蛋白仪在该人群的应用价值探讨[D].苏州大学,2015.),如图1所示。此时,现有技术对HbA1c的测量是不准确甚至是错误的,无法准确反应个体2-3月平均血糖浓度。因而,在此情况下,需要一种替代方案去测量糖化血红蛋白。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法。其中通过微阵列等电聚焦电泳对人体血样中血红蛋白进行电泳分离,在聚焦完成后,再确定不同条带对应血红蛋白或糖化血红蛋白后,分别求得不同种血红蛋白相对含量。
当糖化血红蛋白HbA1c不存在时,本方法所测得的数值能够作为HbA1c(%)较好的替代,是对已有方法良好的补充。与现有的方法和技术相比,本发明具有分辨率高、抗干扰性强和检测计算简单等优点,并适用于绝大多数场景,具有较好的普适性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明的目的是提供一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,包括以下步骤:
S1:分离目标样品中血红蛋白及其对应糖化血红蛋白,得到对应特征条带,测定血红蛋白及其对应糖化血红蛋白含量;
S2:计算各条带i所对应糖化血红蛋白相对含量gHbi(%),其中:
进一步地,S1中,所述血红蛋白及其对应糖化血红蛋白含量为同一时刻在血液中的相对浓度或者绝对浓度。
进一步地,S1中,利用微阵列等电聚焦分离血红蛋白,获得血红蛋白及其对应糖化血红蛋白特征条带。
进一步地,S1中,所述血红蛋白及其对应糖化血红蛋白的种类包括A0,A2,C,E,F,H,J,K,S中的一种或多种。
进一步地,S1中,目标糖化血红蛋白特征条带的等电点低于未糖化条带,在聚焦完成后,目标糖化血红蛋白特征条带的等电点处于未糖化条带的靠阳极侧。
进一步地,S1中,通过等电聚焦电泳聚焦完成后,对应的糖化血红蛋白与未糖化血红蛋白条带的位置关系,以此快速辨别和区分各个血红蛋白糖化条带。
进一步地,S1中,在聚焦完成分离后,切除目标糖化血红蛋白特征条带,并经生物质谱测序,确定所述糖化血红蛋白特征条带为对应的糖化血红蛋白条带。
进一步地,S2中,各条带i所对应糖化血红蛋白相对含量gHbi(%)等于ki[G]t,其中t为红细胞在血循环系统中存活时间。
进一步地,S2中,不同类糖化血红蛋白比例与其反应速率常数的关系为:
即反应速率比值能够由糖化血红蛋白比例比值进行确定。
进一步地,当不存在HbA1c或是HbA1c与其他物质的保留时间存在重叠时,根据其他的糖化血红蛋白比例来反应平均血糖和血糖控制水平。
与现有技术相比,本发明具有以下技术优势:
1.分辨率高。因微阵列等电聚焦的高分辨率,本技术和方法能分离检测到多种糖化血红蛋白,从而能分别对其定量,而HPLC和毛细管电泳无法检测到;
2.抗干扰性强。当不存在HbA1c或是HbA1c与其他物质的保留时间存在重叠时,HPLC仍会输出HbA1c(%)信息,这个数值是不准确的甚至是错误的。而本方法在能同时检测分离到多种糖化血红蛋白,即使在HbA1c不存在的情况下,还能根据其他的糖化血红蛋白比例来反应平均血糖和血糖控制水平,适用于绝大多数场景,具有较好的普适性;
3.检测计算简单。本方法和技术推理出的方程十分简单明了,方程(12)也阐述了不同种血红蛋白含量之比和其反应速率常数之间的关系。若能求得等电聚焦后不同种糖化血红蛋白含量之比,即可求得其对应反应速率常数,当其一反应速率常数已知时,便能简单估算另一反应速率常数;反之,当反应速率常数之比已知,便能直接求得两者糖化血红蛋白含量之比。
附图说明
图1为引用文献的附图;
图2为实施例1中分离柱图和对应吸收谱图;
图3为实施例2中分离柱图和对应吸收谱图。
具体实施方式
本方法和技术首先通过微阵列等电聚焦电泳对人体血样中血红蛋白进行电泳分离;在聚焦完成后,再确定不同条带对应血红蛋白或糖化血红蛋白后,分别求得不同种血红蛋白相对含量。
通常来说,糖化普遍可以发生在各类蛋白上,其修饰位点也各有不同。对在血循环系统中存活时间为t的单一红细胞,不同类血红蛋白能与葡萄糖反应,生成对应糖化血红蛋白,反应如下所示:
其中Hbi为未糖化血红蛋白,G为葡萄糖,gHbi为该类血红蛋白对应糖化血红蛋白,ki为该化学反应的反应速率常数。
由反应(A)可得:
假设单个细胞生命周期内该类血红蛋白总量Hbti保持不变且平均葡萄糖含量保持相对恒定,其[G]和[Hbti]设为恒定值。由反应(A)又得:
[Hbti]=[gHbi]+[Hbi] (3)
将方程(3)带入方程(1)可得:
方程(4)积分可得:
因ki<6×10-5dL mg-1d-1,[G]<200mg/dL且t<150d,即ki[G]t<0.18,因而
方程(5)可以近似简化为:
[gHbi]=Hbtiki[G]t (6)
因而此红细胞该类糖化血红蛋白比例为:
即在血循环系统中存活时间为t的红细胞中HbA1c百分比含量为ki[G]t。
在人体被取血时,假设血细胞中各细胞在进入血循环系统后存活时间t(即当前年龄)比例函数为p(t),即已在血循环系统中存活时间t的红细胞占总的红细胞数量比例为p(t)。由此可得:
因而,取血时血样平均红细胞年龄(mean RBC age,MRBCa)为:
假设所有红细胞内Hbti基本一致,且所有红细胞大小体积基本一致,则所测得的gHbi(%)为所采血样中所有红细胞的gHbi(%)的加权平均值,即为:
同理可得:
gHbj(%)=kj[G]MRBCa (11)
由方程(10)和方程(11)可得:
方程(12)极其简单,但阐明了不同类糖化血红蛋白比例与其反应速率常数的关系,也表明反应速率比值可简单地由糖化血红蛋白比例比值进行确定。
又因还原糖与血红蛋白的结合使得其等电点减小,导致各类血红蛋白的等电点大于所对应的糖化血红蛋白的等电点,在等电聚焦电泳聚焦完成后,对应的糖化血红蛋白将会聚焦在未糖化血红蛋白条带的靠阳极侧,由此可简单和快速辨别和区分各个血红蛋白糖化条带,并测得其百分比含量。当存在某种异常血红蛋白或是HbA1c不存在时,导致HbA1c无法被检测时,本方法仍能通过检测其余糖化血红蛋白来衡量2-3个月的平均血糖浓度,是一种良好的补充和替代。
具体实施时,步骤(1)所述血红蛋白及其对应糖化血红蛋白含量为同一时刻在血液中的相对浓度或者绝对浓度。
具体实施时,步骤(1)利用微阵列等电聚焦分离血红蛋白,获得血红蛋白A0,A2,C,E,F,H,J,K,S等血红蛋白及其对应糖化血红蛋白特征条带,该血红蛋白分类依据来源于“异常血红蛋白病分类”。
具体实施时,对应糖化血红蛋白特征条带的等电点略低于未糖化条带,其在聚焦完成后处于未糖化条带的靠阳极侧。
具体实施时,在聚焦完成分离后,切除对应糖化血红蛋白特征条带,经生物质谱测序,确定所述糖化血红蛋白特征条带确为对应的糖化血红蛋白条带。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。技术方案中如未明确说明的结构/模块名称、控制模式、算法、工艺过程或组成配比等特征,均视为现有技术中公开的常见技术特征。
实施例1
本实施例中糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法和技术。如图2所示,微阵列等电聚焦能根据等电点将不同种血红蛋白聚焦于微分离柱的不同位置。
在电泳图可见两明显较高丰度血红蛋白:HbA0和另一异常血红蛋白,同时在上述较高丰度血红蛋白偏阳极侧(左侧)可见丰度略低的分别对应的糖化条带:HbA1c与糖化异常血红蛋白。
根据色谱峰图和权利要求1分别求得HbA1c(%)=8.6%,糖化异常血红蛋白(%)=5.3%,进而可知两者化学反应常数比值为8.6/5.3=1.62。
实施例2
本实施例中糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法和技术。如图3所示,电泳图种可见HbA0和另一异常血红蛋白。
而本应出现在HbA0偏阳极测的HbA1c因其等电点和异常血红蛋白的重合而未显示出单独的分离条带,此时电泳图和色谱峰图仅能显示糖化异常血红蛋白。
根据色谱峰图和权利要求1求得糖化异常血红蛋白(%)=4.8%,该值能在HbA1c不存在或是其等电点与其余血红蛋白重合时作为血糖控制水平的有效替代。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,所述血红蛋白及其对应糖化血红蛋白含量为同一时刻在血液中的相对浓度或者绝对浓度。
3.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,利用微阵列等电聚焦分离血红蛋白,获得血红蛋白及其对应糖化血红蛋白特征条带。
4.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,所述血红蛋白及其对应糖化血红蛋白的种类包括A0,A2,C,E,F,H,J,K,S中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,目标糖化血红蛋白特征条带的等电点低于未糖化条带,在聚焦完成后,目标糖化血红蛋白特征条带的等电点处于未糖化条带的靠阳极侧。
6.根据权利要求5所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,通过等电聚焦电泳聚焦完成后,对应的糖化血红蛋白与未糖化血红蛋白条带的位置关系,以此快速辨别和区分各个血红蛋白糖化条带。
7.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S1中,在聚焦完成分离后,切除目标糖化血红蛋白特征条带,并经生物质谱测序,确定所述糖化血红蛋白特征条带为对应的糖化血红蛋白条带。
8.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,S2中,各条带i所对应糖化血红蛋白相对含量gHbi(%)等于ki[G]t,其中t为红细胞在血循环系统中存活时间。
10.根据权利要求1所述的一种糖化血红蛋白的快速聚焦电泳定量分析方法,其特征在于,当不存在HbA1c或是HbA1c与其他物质的保留时间存在重叠时,根据其他的糖化血红蛋白比例来反应平均血糖和血糖控制水平。
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