CN112305207A - 基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法 - Google Patents

基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，包括以下步骤：(1)测定血样血液中HbA1c的浓度HbA1c(％)及血糖浓度[G]，(2)将测得的HbA1c(％)及血糖浓度[G]代入公式
Figure DDA0002732234300000011
计算得到血样红细胞平均寿命MRBCl，其中，MRBCl为血样红细胞平均寿命，HbA1c(％)为血液中糖化血红蛋白浓度，[G]为血糖浓度，K为校正系数。与现有技术相比，本发明具有操作简单、省时省力、成本低廉，样本需求量低、避免潜在放射性暴露、感染和过敏危害以及避免了众多影响干扰等优点，具有更广的适应性。

Description

基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法
技术领域
本发明属于人体红细胞平均寿命分析技术领域，具体涉及一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法。
背景技术
红细胞平均寿命的测定在缺血性贫血、遗传性贫血、药物性溶血、过敏性溶血、遗传性溶血、内出血和糖尿病等重大疾病诊断与鉴别诊断中十分重要作用。如遗传性溶血和遗传性血红蛋白病的红细胞寿命较正常人的明显缩短(Higgins P J,Bunn HF.J.Biol.Chem.,1981,256,5204-5208)。患者脾功能亢进、组织器官慢性内出血、血液黏度增加、二尖瓣狭窄和血管硬度增加均能导致红细胞寿命下降。
已发展多种红细胞寿命检测技术，包括放射性同位素标记法、荧光生物素标记法和内源性CO测定法等。放射性同位素(51Cr)标记法(Mock DM,Lankford GL,Widness JA,Burmeister LF,Kahn D,Strauss RG.Transfusion,1999,39,156–162)是利用放射性同位素51Cr标记红细胞，将其输注回人体；连续多日进行人体静脉血液放射性检测，通过检测放射性同位素衰减速率进行红细胞存活时间和寿命检测。该法被视作红细胞寿命测定的“金标准”，但该方法存在测量耗时(需一个月)、辐射暴露风险和检测费用昂贵等问题，一直很难推广应用。
荧光生物素标记法(Kuruvilla,D.J.,Widness,J.A.,Nalbant,D.,Schmidt,R.L.,Mock,D.M.,&An,G.,et al.Pediatric Research,2017,81,905-910)系利用生物素标记红细胞，将红细胞输注回人体；利用流式细胞仪对标记的人体红细胞进行连续多日检测，通过计数生物素标记的红细胞数量下降来分析红细胞寿命，除了测量耗时(需一个月)、检测仪器和费用昂贵和检测通量低等问题外，该方法有过敏和诱导抗生物素抗体产生风险。
CO呼气试验法是利用人体内源性CO来测定红细胞寿命，如专利CN108663503A公开的智能检测红细胞寿命的方法。总体上人体呼出气体中约70％CO来自红细胞降解的血红素。原理上，通过测定内源性CO能够推测红细胞寿命。CO测量可由气相色谱法(Ma，Jie；Dou，Yanna；Zhang，Hanjie；et al.，Blood Purification，2017，43，200-205)或非色散红外光谱法(CN209529179U)来实现，与前二种方法相比该方法的便捷性得到很大提升，但该方法操作复杂、受试者体验差，且样本前处理复杂，处理时间超过1天；尤其易受吸烟、肥胖、体重、心梗、肌肉坏死等影响。
发明内容
为了解决上述红细胞平均寿命检测存在的各种问题，本发明提供一种基于糖化血红蛋白HbAlc含量(HbA1c(％))和血糖浓度([G])为传感变量的红细胞寿命的检测方法，该方法操作简单、省时省力、成本低、样本需求量低，避免潜在放射性暴露、感染和过敏危害，以及避免众多影响干扰，具有更广的适应性。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，包括以下步骤：
(1)测定血样血液中HbAlc的浓度HbA1c(％)及血糖浓度[G]，单位mg/dL；
(2)将测得的HbA1c(％)及血糖浓度[G]代入以下公式计算得到血样红细胞平均寿命MRBCl：
Figure BDA0002732234280000021
其中，MRBCl为血样红细胞平均寿命；
HbA1c(％)为血液中糖化血红蛋白浓度；
[G]为血糖浓度；
K为校正系数。
进一步地，所述HbA1c(％)的测定方法包括但不限于：高效液相色谱(HPLC)法、毛细管电泳(CE)法、等电聚焦电泳(IEF)法、琼脂糖凝胶电泳法、质谱法、免疫检测法、ELISA法、硼酸亲和层析法、免疫比浊法、HbA1c浓度/HbA总浓度比值法及HbA1c浓度/Hb总浓度比值法。
进一步地，所述HbA1c浓度/HbA总浓度比值法及HbA1c浓度/Hb总浓度比值法，通过以下公式计算得到：
Figure BDA0002732234280000031
Figure BDA0002732234280000032
Figure BDA0002732234280000033
Figure BDA0002732234280000034
Figure BDA0002732234280000035
Figure BDA0002732234280000036
在公式(1)～(6)中，[HbAlc]、[HbA0]、[LA1c]分别表示检测方法测得的对应HbA1c、HbA0和LA1c浓度，[Hbi]表示红细胞内各类的血红蛋白浓度，包括但不限于A0、A1a、Alb、A1c、A2、A3、C、D、E、F、G、H、J、K、S血红蛋白的浓度，A和H分别为色谱或电泳峰的峰面积和峰高。
进一步地，所述血糖浓度的测定方法包括但不限于：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、微创电化学方法、无创血糖电化学微针阵列传感器法、无创石墨烯微型传感器法。
进一步地，所述血糖浓度[G]包括但不限于：1月平均血糖浓度[AGM]、1周平均血糖浓度[AGW]、1天平均血糖浓度[AGD]、早上空腹血糖浓度[GFBG]、葡萄糖耐受平均血浓度[GOGTT]。
进一步地，所述校正系数K值以HbA1c(％)与[G]计量和检测方法而调整。
进一步地，所述调整系数K值获得方法包括但不限于：基于正常人群平均红细胞寿命的反推法、HbA1c(％)及[G]/[AG]估算方法、动力学方程参数估算方法。
进一步地，所述K的动力学参数计算方法公式为：
Figure BDA0002732234280000037
其中，k1、k2和k3为红细胞内血红蛋白与葡萄糖无酶催化反应的速率常数，如下反应(A)、反应(B)所示，其值分别为1.6～5.2×10-5 dL mg-1h-1、0.33h-1和0.0025h-1。
进一步地，根据所得MRBCl数值，进一步得到红细胞当前平均年龄MRBCa，计算公式为：
Figure BDA0002732234280000038
进一步地，根据所得MRBCl数值、红细胞当前平均年龄MRBCa，进一步得到红细胞平均残余寿命MRBCra，计算公式为：
MRBCra＝MRBCl-MRBCa。
本发明技术方案基于以下原理得到：
在人红细胞内，血红蛋白A0(HbA0)与葡萄糖(G)无酶催化反应如下(Lowrey C H，Lyness S J，Soeldner J S.J.Biol.Chem.，1985，260(21)，11611-11618)：
Figure BDA0002732234280000041
Figure BDA0002732234280000042
在上述反应中，反应速率常数k1、k2和k3分别为1.6～5.2×10-5dL mg-1h-1、0.33h-1和0.0025h-1(León-Triana O，Calvo G F，Belmonte-Beitia J，eta1.J.Roy.Soc.Interface，2018，15(142)，20180224)。
对在血循环系统中存活时间为t的单一红细胞，由反应(A)和反应(B)可知，反应(A)为可逆反应；而在反应(B)中，因[G]大于100毫摩尔，且不稳定糖化血红蛋白(LA1c)浓度一般小于2％，转变成HbA1c速率相对较慢。因而，可假设反应(A)先达到平衡状态。因此得到：
k1[HbA0][G]＝k2[LA1c] (7)
其中，[HbA0]、[LA1c]和[G]分别为平衡时HbA0、LA1c和葡萄糖浓度，因存在：
[HbA]t＝[HbA0]+[LA1c]+[HbA1c] (8)
其中，[HbA]t为该单个细胞内血红蛋白HbA总含量，则得到：
k1([HbA]t-[LA1c]-[HbA1c])[G]＝k2[LA1c] (9)
从方程(9)进一步可得：
Figure BDA0002732234280000043
在此红细胞的生命周期内，[G]不断变化，但在一段时间内(数月～数年)，一般人的平均葡萄糖浓度([AG])相对恒定，因而上式可近似为：
Figure BDA0002732234280000044
继而从反应(B)可得：
Figure BDA0002732234280000045
假设在骨髓中新产生的红细胞刚进入血循环系统时其HbA1c浓度为0，即HbA1c(0)＝0，则方程(12)经变换后积分得：
Figure BDA0002732234280000051
因而该红细胞HbA1c的百分比浓度为：
Figure BDA0002732234280000052
因存在：
limx→0 ex-1＝x (15)
而同时[AG]＜200mg/dL，t＜200天，k1、k2和k3分别为1.6～5.2×10-5 dL mg-1h-1、0.33h-1和0.0025h-1，所以，
Figure BDA0002732234280000053
十分趋近于0，因而，方程(14)可简化为：
Figure BDA0002732234280000054
即在血循环系统中存活时间为t的红细胞中HbA1c百分比浓度为
Figure BDA0002732234280000055
在人体被取血时，假设血液中各红细胞在进入血循环系统后存活时间t(即当前年龄)比例函数为pa(t)，即已在血循环系统中存活时间t的红细胞占总的红细胞数量比例为pa(t)，则有：
Figure BDA0002732234280000056
因而，该取血血样平均红细胞年龄(mean RBC age，MRBCa)为：
Figure BDA0002732234280000057
假设所有单个红细胞内HbA浓度接近，则血样HbA1c百分比浓度为所用血样中所有红细胞的HbA1c(％)的加权平均值，即为：
Figure BDA0002732234280000058
将公式(18)代入公式(19)可得：
Figure BDA0002732234280000059
方程(20)变形得到：
Figure BDA00027322342800000510
另据文献(Shrestha，R.P，Horowitz，J.，Hollot，C.V.et al.J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.2016，43，259-274)，红细胞寿命分布p1(t)的均值与方差分别为和δ2。对于单个红细胞而言，其寿命RBC lifespan(RBCl)、当前年龄RBC age(RBCa)与剩余年龄RBCresidual age(RBCra)的关系为：
RBCl＝RBCa+RBCra (22)
因而，根据统计学原理RBCl、RBCa与RBCra三者在整个红细胞群体中的期望关系为：
E(RBCl)＝E(RBCa)+E(RBCra) (23)
又因在稳定状态下，
Figure BDA0002732234280000061
Figure BDA0002732234280000062
式中，和δ2分别为红细胞寿命分布p1(t)的均值与方差。
将方程(24)-(25)代入方程(23)得：
Figure BDA0002732234280000063
由于红细胞数量极大，即样本数量足够大，则红细胞年龄期望值E(RBCa)与红细胞平均当前年龄(MRBCa)相等；同时，红细胞寿命期望值E(RBCl)与红细胞平均寿命(MRBCl)相等，红细胞残余寿命期望值E(RBCra)与红细胞平均残余寿命(MRBCra)相等。因此，即存在以下关系：
E(RBCca)＝MRBCa (27)
E(RBCl)＝MRBCl (28)
MRBCl＝MRBCa+MRBCra (29)
将方程(27)-(28)代入(26)得到：
Figure BDA0002732234280000064
在方程(30)中，因存在：k1＝1.6～5.2×10-5 dL mg-1h-1、k2＝0.33h-1、以及k3＝0.0025h-1，且[AG]＜200mg/dL。因此，存在如下不等式：
k2＞＞k1[AG] (31)
因此，方程(30)可简化为：
Figure BDA0002732234280000065
在方程(32)中，令：
Figure BDA0002732234280000066
则将方程(33)代入方程(32)得到：
Figure BDA0002732234280000067
如果用血糖浓度[G]表达，则方程(34)可表达为：
Figure BDA0002732234280000071
因平均葡萄糖[AG]与空腹血糖浓度[GFBG]、一月平均血糖[AGM]、一周平均血糖[AGw]等血糖浓度存在一定的线性关系，方程(34)和(35)可进一步抽象表达为红细胞平均寿命传感函数：
MRBCl＝f(HbA1c(％)，[G]) (36)
该传感函数中[G]涵盖多种血糖浓度概念，包括但不限于以上已提及的[AGM]、[AGW]、[AGD]、[GFBG]和[GOGTT]。
方程(30)、(32)、(34)、(35)和(36)极其简单，但阐明了红细胞平均寿命检测的新原理，即通过测定血液HbA1c百分比浓度和[G]为输入传感参变量，来得到红细胞平均寿命的输出值(具体参见图1)。显然，这一检测原理不同于传统的放射性同位素标记方法、荧光生物素表记法、以及CO呼气试验法。
在获得MRBCl之后，进一步可获得红细胞平均当前年龄(MRBCa)：
Figure BDA0002732234280000072
依据方程(29)，进一步可获得红细胞平均残余寿命(MRBCra)：
MRBCra＝MRBCl-MRBCa (38)
与现有技术相比，本发明具有以下优点(具体参见表1)：
1、操作简单：相较于51Cr同位素表记法、生物素标记法和呼出其他CO检测法，本发明方法无需繁杂的血液细胞操作、无需后续多次频繁的取血、无需复杂庞大的检测或计数装置，本方法操作简单、易于使用。
2、省时省力：如背景技术所述，标记法需在多日内重复对受试者进行取血和后续检测，CO呼气试验法需要复杂的样本前处理和血液血气分析，十分耗时耗力，而本发明方法仅需1天时间或更短时间即可得到受试者红细胞平均寿命；在获得HbA1c(％)和[G]的数据后，只需简单的运算即可得知红细胞平均寿命，转换计算迅速。
3、成本低廉：相较于51Cr同位素表记法、生物素标记法和CO检测法，本发明方法所需检测HbA1c和葡萄糖浓度的仪器普及率高、仪器价格便宜；且所需试剂成本较低，整个检测成本不高，显著低于现有检测技术。
4、样本需求量低：相较于51Cr同位素表记法(25～50mL血液+血液1mL×30次)、生物素标记法(25～50mL血液+血液1mL×30次)和CO呼气试验法(1mL血液+呼出气体数升)，本方法只需要20L血液。
5、避免潜在放射性暴露、感染和过敏危害：相较于51Cr同位素表记法和生物素标记法，本发明方法无需大量的血液红细胞体外标记、无需标记后红细胞的回输，只需采集指尖血或静脉血，有效避免了潜在的放射性暴露、感染和过敏危害。
6、避免了众多影响干扰，具有更广的适应性：相比CO呼气试验法，本发明方法有效避免了吸烟、肥胖、体重、心梗、肌肉坏死等因素的干扰，更能反应红细胞实际寿命，具有更广的适应性。
表1不同红细胞寿命测定方法优缺点比较
Figure BDA0002732234280000081
附图说明
图1为本发明技术原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。以下为本发明方法概念、理论和方法上论证。
基于上述技术方案，以下给出具有具体应用示例。
实施例1
一种基于HbAlc和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命的检测方法，利用HPLC技术测得病人甲HbA1c＝8.4％，利用CGM血糖监测系统测得[AGD]＝140mg/dL，经方程(34)或(35)或(36)、(37)和(38)计算分别得到该患者红细胞平均寿命MRBCl＝176天、红细胞平均当前年龄MRBCa＝88天和红细胞平均残余年龄MRBCa＝88天。
实施例2
一种基于HbA1c和血糖浓度传感的红细胞平均寿命的检测方法，利用毛细管电泳技术测得病人乙HbA1c＝4.2％，利用血糖仪测得[GFBG]＝163mg/dL，经方程(34)或(35)或(36)、(37)和(38)计算分别得到该患者红细胞平均寿命MRBCl＝68天、红细胞平均当前年龄MRBCa＝34天和红细胞平均残余年龄MRBCra＝34天。
实施例3
一种基于HbAlc和血糖浓度传感的红细胞平均寿命的检测方法，利用等电聚焦技术测得病人丙HbA1c＝6.5％，利用血糖仪测得空腹血糖浓度及口服75g葡萄糖后0.5、1、1.5、2小时测定的血糖浓度，求得五次血糖浓度平均值为[GOGTT]＝244mg/dL，经方程(34)或(35)或(36)、(37)和(38)计算分别得到该患者红细胞平均寿命MRBCl＝96天、红细胞平均当前年龄MRBCa＝48天和红细胞平均残余年龄MRBCra＝48天。
实施例4
一种基于HbA1c和血糖浓度传感的红细胞平均寿命的检测方法，利用质谱技术测得病人丁HbA1c＝5.9％，利用CGM血糖监测系统测得[AGW]＝215mg/dL，经方程(34)或(35)或(36)、(37)和(38)计算分别得到该患者红细胞平均寿命MRBCl＝82天、红细胞平均当前年龄MRBCa＝41天和红细胞平均残余年龄MRBCra＝41天。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定血样血液中HbA1c的浓度HbA1c(％)及血糖浓度[G]；
(2)将测得的HbA1c(％)及血糖浓度[G]代入以下公式计算得到血样红细胞平均寿命MRBCl：
Figure FDA0002732234270000011
其中，MRBCl为血样红细胞平均寿命；
HbA1c(％)为血液中糖化血红蛋白浓度；
[G]为血糖浓度；
K为校正系数。
2.根据权利要求1所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述HbA1c(％)的测定方法包括但不限于：高效液相色谱(HPLC)法、毛细管电泳(CE)法、等电聚焦电泳(IEF)法、琼脂糖凝胶电泳法、质谱法、免疫检测法、ELISA法、硼酸亲和层析法、免疫比浊法、HbA1c浓度/HbA总浓度比值法及HbA1c浓度/Hb总浓度比值法。
3.根据权利要求2所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述HbA1c浓度/HbA总浓度比值法及HbA1c浓度/Hb总浓度比值法，通过以下公式计算得到：
Figure FDA0002732234270000012
Figure FDA0002732234270000013
Figure FDA0002732234270000014
Figure FDA0002732234270000015
Figure FDA0002732234270000016
Figure FDA0002732234270000021
在公式(1)～(6)中，[HbA1c]、[HbA0]、[LA1c]分别表示检测方法测得的对应HbA1c、HbA0和LA1c浓度，[Hbi]表示红细胞内各类的血红蛋白浓度，包括但不限于A0、A1a、Alb、A1c、A2、A3、C、D、E、F、G、H、J、K、S血红蛋白的浓度，A和H分别为色谱或电泳峰的峰面积和峰高。
4.根据权利要求1所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述血糖浓度的测定方法包括但不限于：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、微创电化学方法、无创血糖电化学微针阵列传感器法、无创石墨烯微型传感器法。
5.根据权利要求4所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述血糖浓度[G]包括但不限于：1月平均血糖浓度[AGM]、1周平均血糖浓度[AGW]、1天平均血糖浓度[AGD]、早上空腹血糖浓度[GFBG]、葡萄糖耐受平均血浓度[GOGTT]。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述校正系数K值以HbA1c(％)与[G]计量和检测方法而调整。
7.根据权利要求6所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述调整系数K值获得方法包括但不限于：基于正常人群平均红细胞寿命的反推法、HbA1c(％)及[G]/[AG]估算方法、动力学方程参数估算方法。
8.根据权利要求7所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，所述K的动力学参数计算方法公式为：
Figure FDA0002732234270000022
其中，k1、k2和k3为红细胞内血红蛋白与葡萄糖无酶催化反应的速率常数。
9.根据权利要求7所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，根据所得MRBCl数值，进一步得到红细胞当前平均年龄MRBCa，计算公式为：
Figure FDA0002732234270000023
10.根据权利要求9所述的一种基于HbA1c和血糖浓度为传感变量的红细胞平均寿命检测方法，其特征在于，根据所得MRBCl数值、红细胞当前平均年龄MRBCa，进一步得到红细胞平均残余寿命MRBCra，计算公式为：
MRBCra＝MRBCl-MRBCa。
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