CN106716138A - 用于确定细胞年龄的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了这样的系统和方法，其用于通过确定HbA1c的百分比来确定血样的独立红血细胞中的细胞血红蛋白的年龄。在实施例中，方法包括测量所述独立红血细胞的侧向散射和荧光，并且利用所述侧向散射和所述荧光测量值来识别未成熟红血细胞和成熟红血细胞。在实施例中，所收集的数据包括红血细胞的所述确切数量、以荧光和侧向散射单位计的所述级分界限、以荧光和侧向散射单位计的每个级分的所述平均值，以任意单位计的每个级分的所述平均FL1值以及以任意单位计的每个级分的所述平均侧向散射值。在实施例中，方法还包括由所述独立红血细胞的所述实测平均荧光导出HbA1c含量，并且利用所述红血细胞的所述HbA1c含量和所述血红蛋白含量来确定HbA1c的所述百分比。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请作为PCT国际专利申请提交于2015年9月11日，并且要求于2014年10月3日提交的美国专利申请序列号62/059,684的优先权，并要求于2014年9月12日提交的美国专利申请序列号62/049,970的优先权，这两份专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于确定细胞中的细胞血红蛋白的年龄和/或红细胞的平均年龄的系统和方法。
背景技术
已通过测量铬51标记的红细胞的体内清除率而导出红血细胞的寿命(参见Gray,S.J.and Stirling,K.1950,J.Clin.Invest.29:1604-1613(Gray,S.J.和Stirling,K.，1950年，《临床研究杂志》，第29卷，第1604-1613页)的综述；Dacie and Lewis；PracticalHaematology,Ninth Edition,2001,Ed.；S.M.Lewis,B.J.Bain and I.Bates,Publ.Churchill Livingstone(Dacie与Lewis《实用血液病学》，第九版，2001年，S.M.Lewis、B.J.Bain和I.Bates编辑，丘吉尔利文斯通出版))。该程序是侵入性的且较繁琐，并未广泛使用。已开发了其他技术来非侵入性地测量红血球的寿命，包括对呼气中一氧化碳的测量(M.A.Virtue et al.2004,Diabetes Care；vol.27No 4pp 931-935(M.A.Virtue等人，2004年，《糖尿病医疗》，第27卷，第4期，第931-935页))、对红细胞的密度离心(Borun ER,et al.J Clin Invest 36:676,1957(Borun ER等人，《临床研究杂志》，第36卷，第676页，1957年))以及对红细胞的细胞表面上的CD35的流式细胞术测量(Lach-Trifilieff et al.1999,Journal.Immunol.162,(12):7549(Lach-Trifilieff等人，1999年，《免疫学杂志》，第162卷，第12期，第7549页))。然而，这些技术都未显示出能恒定地提供对红细胞的寿命或平均年龄的确定。
因此希望开发用于确定细胞血红蛋白的年龄和/或红血细胞的平均年龄的系统和方法。
发明内容
本文所述的系统、方法、试剂盒和组合物提供了以逐个细胞为基础确定HbA1c的百分比的能力，提供了对红血细胞的群体或亚群的年龄概况的确定，提供了对红血细胞的平均年龄的确定，提供了对红血细胞的寿命的确定，并且提供了对估计葡萄糖含量的确定。单份血样的分析可提供此前100到约120天的信息。对细胞群体或亚群的年龄概况的确定可用于监测糖尿病以及其他涉及血液葡萄糖的疾病。对细胞群体或亚群的年龄概况的确定可用于监测贫血以及其他涉及红血细胞血红蛋白含量的疾病。在实施例中，可检测在过去100到约120天进行的输血。参见图13。
在一个方面，本公开涉及这样的系统和方法，其用于通过确定HbA1c的百分比来确定血样的独立红血细胞中的细胞血红蛋白的年龄。另一个方面涉及确定样品中的红血细胞的平均年龄。所述方法和系统可用于监测受试者中的糖尿病或贫血、输血的存在和/或出血事件的存在的方法。所述系统和方法也可用于监测糖尿病或贫血的进展或改善。
在一个方面，本公开提供了用于确定样品中的红血细胞的年龄的试剂盒和试剂。在实施例中，用于确定样品中的红血细胞群体的年龄概况的试剂盒包含：a)特异性地结合HbA1C或其变体的抗体或其抗原结合片段；b)特异性地结合于RNA的染料；以及c)红血细胞参考对照样品。在一些实施例中，红血细胞参考对照细胞具有已知百分比的HbA1C。在其他实施例中，参考对照细胞是正常对照样品，诸如取自未患有糖尿病或贫血的受试者。在其他实施例中，参考对照细胞取自患有糖尿病且HbA1C值已知的受试者。在实施例中，抗体或抗原结合片段被可检测地标记。在实施例中，特异性地结合于RNA的染料是吖啶橙。在实施例中，该试剂盒还可包含用于透化红血细胞的试剂。在其他实施例中，试剂盒还包含计算机可读介质，该计算机可读介质包含用于确定如本文所述样品中的红血细胞的年龄和/或密度的指令。
在另一个方面，本公开提供了用于确定样品中的红血细胞的年龄和/或密度的系统。在实施例中，用于确定红血细胞群体的年龄的系统包括独立红血细胞的侧向散射和荧光的检测器；利用独立红血细胞在至少一个波长处测得的荧光及测得的侧向散射来得出百分比HbA1c含量的计算器；使用网织红细胞HbA1c的平均百分比将红血细胞群体分成多个级分的分配器，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；每份样品的寿命系数的计算器；以及样品各级分的年龄的计算器。在其他实施例中，该系统还包括样品的平均年龄的计算器，并且将样品的平均年龄与正常对照样品的平均年龄相比较。在再其他实施例中，该系统还包括特定年龄的细胞的平均细胞血红蛋白的计算器，并且确定平均细胞血红蛋白是否会根据细胞的年龄而变化。
在其他实施例中，本公开提供了包括非临时性计算机可读介质的系统，该非临时性计算机可读介质具有用于执行包括以下的方法步骤的指令：确定样品中每个独立红血细胞的血红蛋白、HbA1c和RNA含量；利用每个独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定每个独立细胞中的HbA1c的百分比；通过将样品的独立细胞中的HbA1c的百分比与样品的参考细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，来将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比，并且通过将HbA1c的平均百分比与参考对照细胞或参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别该级分中的红血细胞的年龄。在实施例中，该系统还包括与参考对照细胞的相同级分相比，确定样品中属于特定HbA1c百分比的级分的红血细胞的密度。在实施例中，参考对照细胞具有至少28天的平均年龄。
本公开的另一个方面提供了确定样品中的红血细胞的年龄和/或密度的方法。在实施例中，用于确定血样中的红血细胞群体的年龄概况的方法包括：测量该群体中的每个独立红血细胞的血红蛋白和HbA1c含量；利用每个独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定每个独立细胞中的HbA1c的百分比；通过将独立细胞中的HbA1c的百分比与参考细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，来将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比，并且通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分或参考对照细胞的HbA1c的平均百分比相比较，来识别该级分中的红血细胞的年龄。
在再其他实施例中，该方法还包括与参考对照细胞的相同级分相比，确定样品中属于特定HbA1c百分比的级分的红血细胞的密度。在再其他实施例中，该方法还包括从每个级分收集数据，该数据包括样品中红血细胞的确切数量、网织红细胞级分的平均HbA1c以及每个级分中每个独立红血细胞以荧光和侧向散射单位计的值。
在实施例中，在本文所述方法中，通过侧向散射来测量每个独立红血细胞的血红蛋白。在实施例中，使用对HbA1c或其变体具有特异性的、可检测地标记的抗体来测量HbA1c。例如，该标记物是荧光部分。在实施例中，该方法还包括测量独立细胞中的RNA含量，其中RNA的存在将细胞识别为网织红细胞。在一个实施例中，通过结合于染料诸如吖啶橙来测量RNA。在实施例中，参考细胞级分或对照细胞是HbA1c百分比已知的细胞，诸如网织红细胞。在实施例中，参考对照级分是待分析的样品中的内部细胞类型。在实施例中，参考对照细胞具有至少28天的平均年龄。
在其他实施例中，该方法还包括确定红血细胞群体的年龄概况与参考细胞群体的年龄概况相比是否包括更多数量的较老细胞，由此指示病情或病情的状态。在一个实施例中，该病情是糖尿病。在实施例中，该方法还包括确定样品中的细胞的平均年龄，并且将该平均年龄与正常对照样品的平均年龄相比较，其中平均年龄的差异指示疾病或疾病的状态。在一个实施例中，该病情是糖尿病。
在再其他实施例中，该方法还包括确定样品中具有特定年龄的级分的平均细胞血红蛋白含量，并且确定不同年龄的级分中是否存在平均细胞血红蛋白含量的差异。在实施例中，该差异指示贫血、出血或输血。
附图说明
图1(A)示出了由取自正常受试者的人血样得出的流式细胞术数据的图形表示；FL4(675nm)荧光线性标度对FL1(525nm)荧光对数标度；区域A；对照细胞。区域B；红血细胞网织红细胞。区域C；成熟红血细胞。红血细胞标记有Fluor Alexa 647偶联的抗HbA1c抗体和吖啶橙。该测定法中包括的是此前标记有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的对照细胞。对照细胞源自糖尿病患者。在FC500流式细胞仪上测量荧光FL1(525nm)和FL4(675nm)。
图1(B)是在图1A、区域C中所示的分析中获得的数据的表示。细胞事件绘制在横坐标上，该横坐标表示FL4/SS或HbA1c百分比的任意值。使用该程序，将细胞群体分成包含大约等量细胞的十个级分。这些级分的平均值在HbA1c百分比轴上指示。
图1(C)是如在图1A、区域B中获得的网织红细胞群体的分析的表示。网织红细胞在FL4示意图中表示。具有相对较高水平HbA1c的细胞被排除在该群体之外。
图2(A)是不同血液裂解物对于抗HbA1c抗体结合于通透的红细胞的百分比抑制的图形表示。
图2(B)是流式细胞术HbA1c百分比测定值的标准曲线，示出了HbA1c百分比与FL4/SS值的相关性；横坐标；120个样品的预期IFCC HbA1c百分比值；纵坐标；相同120个样品的流式细胞术FL4/SS值。就背景和补偿对FL4值进行修正，并除以侧向散射。使用内部对照值将FL4/SS值归一化。
图2(C)是流式细胞术HbA1c百分比测定值在用公式I进行数据转换之后的标准曲线。如实例2中所述的那样使用公式I来转换归一化的FL4/SS值。120个样品的转换数据如图2B中那样表示。
图3(A)是每个级分的IFCC HbA1c百分比的图形表示。如实例3中所述的那样从正常人受试者获得FL4/SS级分，并如图1中所示的那样进行分析。这些级分如表1中所示并被赋予了1至10的值，R表示网织红细胞。对于每个级分而言，将平均FL4/SS值转换成如表1中所示的IFCC HbA1c百分比值。
图3(B)是IFCC HbA1c百分比在时间轴上变化的图形表示。级分界限值向时间的转换示于表1中。
图3(C)是IFCC HbA1c百分比在年龄轴上的图形表示。年龄以负值的天数表示。
图3(D)是导出的IFCC百分比HbA1c值对年龄的图形表示。图3C的求导得到常数值(参见表1)。该值已被归一化为参考样品的实测平均IFCC HbA1c百分比。
图3(E)是每个级分的级分大小的图形表示。如表1中所示的那样计算以IFCCHbA1c百分比单位表示的级分大小。
图3(F)是血液循环中所呈现的细胞的百分比在年龄轴上的图形表示。该百分比的计算结果在表1中给出。
图4提供了模拟正常受试者的血液葡萄糖浓度短暂上升的效应的图形表示；(A)；如图3B中那样呈现并如实例3和表1中那样确定的正常受试者的HbA1c曲线；(B)；与(A)中一样，但存在血液葡萄糖浓度的短暂上升；(C)；与(B)中一样，但如实例5和表3中所述的那样确定。
图5(A)是在样品采集之前30天的时间段内平均HbA1c百分比值与平均葡萄糖浓度的关系的散点图表示。如实例4中所述的那样获得数据。
图5(B)是患者样品级分的导出的HbA1c百分比值与在对应级分的年龄的时间段期间测量的平均葡萄糖浓度的关系的散点图表示。如实例4中所述的那样获得数据。如实例9中所述的那样对准平均葡萄糖值和导出的HbA1c百分比值。
图6示出了来自26名患有糖尿病的受试者的26张不同时间/年龄示意图的图形表示，其包含通过自我监测所获得的平均每日葡萄糖浓度值以及确定的HbA1c百分比。如实例4中所述的那样获得纵坐标上的平均每日葡萄糖浓度值。横坐标上的时间数据源自自我监测数据的日程表。纵坐标上的导出的HbA1c百分比值如实例5和表2C(列t)中所示的那样计算，并且如实例7中所述的那样归一化。横坐标上的年龄数据如实例6中及表2D列ad中所示的那样计算。
图7是寿命系数的关系的图形表示。纵坐标；由所确定的HbA1c百分比概况与血液葡萄糖概况之间的最佳拟合所确定的寿命系数。横坐标；由网织红细胞血红蛋白含量和RNA含量导出的寿命系数。利用网织红细胞的血红蛋白和RNA含量对寿命系数进行的确定示于实例7和表2中。
图8示出了时间示意图的图形表示，这些示意图包含26名患有糖尿病的不同受试者和6名正常受试者的血液的年龄级分中所呈现的细胞的百分比。百分比值如实例9中所述的那样计算。如实例10中所述的那样，采用外推法确定零百分点。
图9示出了时间示意图的图形表示，这些示意图包含26名患有糖尿病的受试者和6名正常受试者的不同年龄级分中细胞的平均细胞血红蛋白含量(MCH)。使用内部对照细胞确定MCH。各级分的年龄如实例6中及表2D列ad中所示的那样确定。
图10是示出了流式细胞仪的例子的示意性框图。
图11示出了可用于实施分选流式细胞仪的各方面的计算装置的示例性架构。
图12A-C示出了使用三种其他测试(包括东曹(Tosoh)、普莱默斯(Primus)和罗氏(Roche)测试策略)对120份血样进行的％HbA1C测量。
图13A-E示出了可从单份血样获得的信息，包括样品中红血细胞群体每个年龄的百分比HbA1c、红血细胞每个年龄的估计葡萄糖、细胞每个年龄的平均细胞血红蛋白、特定年龄的细胞的百分比。
图14示出了28名糖尿病患者的平均HbA1c和最高级分HbA1c的比较。
图15示出了如本文所述用于确定样品中红血细胞的年龄的示例性方法的流程图。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，“约”当涉及可测量值时，意在涵盖与指定值有±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±l％且还更优选地±0.1％的变化。
在血液分析仪上，血样的“平均细胞血红蛋白(MCH)”是每个红血细胞的血红蛋白的平均质量，并且由血样的红血细胞计数(RBC)和总血红蛋白(Hgb)导出。后者通过对裂解血样的血红蛋白浓度的分光光度法测量来获得。MCH是所有红血细胞的平均测量值；其不表示独立红血细胞的血红蛋白含量。其可通过将一定体积血液中血红蛋白的总质量除以红血细胞的数量来计算：
MCH＝(Hgb*10)/RBC。
在流式细胞仪上，通常使用“参考对照”校正仪器。参考对照通常由具有已知血红蛋白浓度、或等效血红蛋白浓度、已知侧向散射和荧光强度的荧光颗粒构成。这些通常包括但不限于合成颗粒、人或动物血细胞以及经处理的人或动物血细胞。在校正后，可在流式细胞仪上获得独立红血细胞中细胞HbA1c的定量测量值，即该血红蛋白变体的绝对量。
如本文所用，术语“参考细胞级分”是指具有与红血细胞的其他级分不同的特征的血样细胞级分。在实施例中，这些特征包括RNA的存在和较低的HbA1c含量。在实施例中，参考细胞级分是网织红细胞级分。
术语“正常细胞对照”是指来源于未知患有疾病或病症的受试者的细胞。在实施例中，正常细胞对照来自非糖尿病或非贫血个体。在实施例中，使用正常细胞对照来比较例如红血细胞的平均年龄与糖尿病受试者中红血细胞的平均年龄。
如流式细胞术中已知的术语“侧向散射”是指与入射光成约90度或成直角的光散射信号，该入射光由穿过流通池孔的颗粒或血细胞生成。前向散射信号是指与入射光成小于10度时所测量的光散射信号。侧向散射测量是指由光学检测器对侧向散射信号进行测量。所有市售流式细胞仪配备有能够测量前向散射和侧向散射信号的检测系统。
如本文所用，术语“HbA1c”是指血红蛋白的糖化形式。红血细胞中存在的该糖化血红蛋白是血浆葡萄糖与血红蛋白的反应产物。HbA1c的量作为血浆葡萄糖的函数而增加。
如本文所用，术语“网织红细胞”是指具有核糖体RNA网状网络的未成熟红血细胞。
术语“级分中所呈现的细胞的百分比”等同于1/(HbA1c百分比标度上表示的时间)。
公式
本公开包括可用于此处所述的方法和系统的多个公式。本文中包括的公式是：
(I)y＝c*e0.157*x，其中c是常数，y是HbA1c参考值，并且x是流式细胞术FL4/SS值
(II)y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)，其中通过与葡萄糖值的比较，根据经验确定这些常数的值，如下所示；a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(欧拉常数)，f＝1.8。x、y与公式I中一样
(III)y＝15.1*(e0.03*x-e-0.01*x)*(1.8+e-1.8*x)，其中x、y与公式I中一样
(IV)y＝c1*x1.3，其中x是以往的年龄值，y是新的年龄值。常数c1已被赋予一定值，以便保持最后级分的年龄处于115天。
(V)通过给出平均值(m)，其中a和b是相应的截止值
(VI)LOG10(c1*RNA)*LOG10(c2*29.8*Hb)，其中c1是值为3.33的常数，并且c2是值为0.028的常数
(VII)抗体结合动力学：
逆函数：y＝c1*(ex*c2-1)，
其中y是由参考实验室给出的以IFCC单位计的HbA1c百分比，x是在存在内部参考的情况下确定的流式细胞术HbA1c百分比，并且c1和c2是常数。
(VIII)(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)，其中级分界限值以表1中的IFCC百分比HbA1c表示。列d(d)的值由列c的值使用公式(VIII)得出。
(IX)NGSP＝(0.915*IFCC)+2.15
(X)IFCC HbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式细胞术任意HbA1c百分比-1)
(XI)w＝e0.157*(v)-1
系统
在实施例中，提供了用于确定红血细胞群体的年龄的系统，该系统包括：独立红血细胞的侧向散射和荧光的检测器；利用独立红血细胞在至少一个波长处测得的荧光及测得的侧向散射来得出百分比HbA1c含量的计算器；使用参考细胞级分HbA1c的平均百分比将红血细胞群体分成多个级分的分配器，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；每份样品的寿命系数的计算器；以及样品各级分的年龄的计算器。在实施例中，参考细胞级分是网织红细胞级分。
在其他实施例中，提供了用于确定红血细胞群体每个年龄的平均血红蛋白含量的系统，该系统包括：独立红血细胞的侧向散射和荧光的检测器；利用独立红血细胞的测得的荧光及测得的侧向散射来得出百分比HbA1c含量的计算器；使用参考细胞级分HbA1c的平均百分比将红血细胞群体分成多个级分的分配器，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；每份样品的寿命系数的计算器；样品各级分的年龄的计算器；以及样品中细胞每个年龄的平均细胞血红蛋白含量的计算器。在实施例中，参考细胞级分是网织红细胞级分。
在其他实施例中，系统还包括样品中的细胞的平均年龄的计算器，并且将样品中的细胞的平均年龄与正常对照样品中的细胞的平均年龄相比较，其中细胞的平均年龄的差异指示疾病或疾病的状态，诸如糖尿病。在其他实施例中，系统还包括样品中不同年龄的细胞的平均细胞血红蛋白的计算器，并且将不同年龄的细胞的平均细胞血红蛋白彼此相比较，以识别平均细胞血红蛋白随细胞年龄的变化，其中变化指示疾病或疾病的状态，诸如贫血，或者如出血或输血之类的事件。
在实施例中，样品级分的年龄的计算器包括与参考对照级分的平均百分比HbA1c的位置相比，计算每个级分中的平均百分比HbA1c的位置，计算该级分内的平均HbA1c的位置，计算每个级分的导出的NGPS HbA1c百分比，通过以下方式计算级分的年龄：将级分的平均百分比乘以常数，诸如3.44(参考样品的IFCC百分比HbA1c的示例值)。然后将乘积输入如表2D中所示的公式XI：
w＝e0.157*(v)–1
并且计算每个级分之间的差值，从而得到值x。将值x除以级分平均值的位置，然后除以级分中的总事件的百分比。接下来将该被除数乘以寿命系数，并确定该乘积的累积值。在实施例中，参考对照级分是HbA1c量已知的内部对照，诸如网织红细胞级分。
任选地，本文所述的任何系统可包括级分的导出的HbA1c百分比的计算器、采用本文所提供的公式的HbA1c的IFCC百分比的计算器、和/或对背景进行修正的百分比HbA1c的计算器。
在实施例中，该系统包括存储数据指令的一个或多个计算机可读介质，这些数据指令在被计算装置执行时，致使计算装置实施如本文所述的方法的步骤、功能或操作中的一者或多者。该系统还可包括被配置为执行本文所公开的步骤、功能或操作中的任何一者或多者的电子装置。计算装置和电子装置可包括例如软件或固件指令。电子装置还可包括其他电子硬件装置，这些电子硬件装置被专门设计或配置为执行本文所述的步骤、功能或操作，且可不利用任何额外的软件或固件指令。用于确定本公开一个或多个方面的本文所述模块或计算器可实施为硬件(诸如电子硬件装置)、硬件和软件(诸如计算装置)、软件、或存储可由处理装置执行的指令的计算机可读介质。
例如，方法包括测量群体中每个独立红血细胞的血红蛋白和HbA1c；利用每个独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定每个独立细胞中的HbA1c的百分比；通过将独立细胞中的HbA1c的百分比与参考细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，来将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比，并且通过将HbA1c的平均百分比与参考对照细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别该级分中的红血细胞的年龄。
在实施例中，该方法还包括与对照细胞的相同级分相比，确定样品中属于特定HbA1c百分比的级分的红血细胞的密度。在实施例中，对照细胞具有至少28天的平均年龄。在实施例中，该方法还包括测量样品中的独立细胞的RNA。在实施例中，参考细胞级分是网织红细胞级分。在实施例中，参考细胞级分是具有已知HbA1c含量的内部对照细胞群体，如美国专利No.7,968,279中所述，该专利据此全文以引用方式并入。
在实施例中，使用允许抗体和/或其抗原结合片段透过细胞的试剂，对样品中的细胞进行透化处理。在实施例中，待分析的细胞标记有：结合于DNA或RNA的试剂，和/或特异性地结合于HbA1c且标记有可检测试剂的试剂。结合DNA/RNA的试剂允许将细胞识别为网织红细胞。在实施例中，可检测试剂是荧光标记物。在实施例中，特异性地结合于HbA1c的试剂是对HbA1c或其变体具有特异性的抗体。在实施例中，RNA/DNA的可检测试剂在与抗体上的可检测标记物不同的波长处检测到。在实施例中，确定每个独立细胞的侧向散射。
通过将可检测试剂的荧光(FL4)除以侧向散射(SS)来确定每个细胞的HbA1c的百分比。在实施例中，使用公式(I)来转换归一化的FL4/SS数据：
y＝c*e0.157*x
其中y是转换的数据，x是归一化的FL4/SS数据，并且c是常数(例如，2.74)。然而，该函数并不经过原点。虽然该函数可用于修正大致在5％与15％之间变化的HbA1c百分比值，但其被替换以便用于我们分析中从大约0％变化至25％的级分。对于该函数的替换，选择了通式(II)；
y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)
通过与葡萄糖值的比较，根据经验确定这些常数的值，如下所示。示例性常数值是a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(欧拉常数或自然对数的底)，f＝1.8。该替换公式的第一部分使曲线经过原点；第二部分将轻微反S形曲线引入该曲线的下限值的区段中。
在实施例中，来自样品中的每个细胞的原始数据被分成多个级分。级分基于细胞事件的数量，并且事件的等级顺序基于由来自正常非糖尿病样品的样品得出的数据。在实施例中，血流中存在的网织红细胞的HbA1c的平均百分比被用作级分界限值。在实施例中，来自细胞的数据被分成十个级分，每个级分包含大约相同数量的细胞。最后级分10的级分界限估计为最后级分10的平均荧光值加上级分8和9的级分界限值之差的一半。针对荧光的背景和补偿对这些值进行修正。
在实施例中，使用内部参考对照样品与实测HbA1c值之间的线性相关曲线，将HbA1c的百分比换算为IFCC HbA1c百分比。在实施例中，使用以下方程式确定百分比IFCCHbA1c：IFCC HbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式细胞术任意HbA1c百分比-1)(公式X)。
在实施例中，确定每份样品的寿命系数。寿命系数与网织红细胞血红蛋白和RNA含量有关。在实施例中，计算每份样品的寿命系数。吖啶橙RNA染色；确定每份样品的网织红细胞的FL1(488nm)荧光值(侧向散射值)。发现与网织红细胞的FL1值的对数(RNA含量)和网织红细胞的侧向散射值的对数(血红蛋白含量)的乘积存在最佳相关性(R2＝0.8)。为了获得稳定的RNA值，通过以下方式确定RNA的值：从网织红细胞的FL1值减去第一级分的FL1值，并且将该差值除以不包含任何RNA的第三级分的FL1值。使用内部对照细胞的血红蛋白含量来确定网织红细胞的平均血红蛋白含量(Hb)。公式和常数是：
LOG10(c1*RNA)*LOG10(c2*29.8*Hb)
其中RNA和Hb如上所述，c1是例如为3.33的常数值，并且c2是在本公开中示例为0.028的常数值。29.8值是内部对照细胞的平均血红蛋白含量的例子。
在实施例中，通过以下方式确定取自疑似患有诸如糖尿病之类疾病的受试者的样品的寿命系数：从受试者样品中的网织红细胞的值减去所有细胞的吖啶橙RNA染色FL1(488nm)荧光值而得到值af。从所有细胞的值减去FL1背景值的荧光值(例如，0.17)而得到值ag。将值af除以值ag而得到值ah，然后乘1.3次方而得到值ai。将侧向散射所确定的网织红细胞的血红蛋白含量的值除以所有细胞的血红蛋白含量的值，然后乘1.7次方，而得到值al。为计算寿命系数，将值ai乘以值al。
在其他实施例中，可通过以下方式计算寿命系数：将10％最老细胞的HbA1c的百分比除以所有细胞的HbA1c的平均百分比。
在实施例中，使用级分中的细胞事件的总数并与每个级分的修正HbA1c的百分比平均值相比较，来计算级分的年龄。在实施例中，可通过以下方式计算每个级分的细胞年龄：将每个级分的级分界限值(FL4/SS标度上的级分界限值)除以级分的平均值。将每个级分的该值乘以参考样品的IFCC HbA1c百分比(例如，3.44％)而得到值v。使用公式XI转换每个级分的值v：
w＝e0.157*(v)-1
通过x＝wn-wn-1确定级分之间的差值。将(x)的值除以级分的平均值的位置(相对于参考对照的对应级分的平均值的位置)，从而提供值y。将每个级分中的细胞事件的总数除以十个级分的细胞事件的数量并乘以10，从而提供值aa。将值y乘以值aa。然后将该值乘以通过最佳拟合确定的或如表2E中给出的那样计算的寿命系数。该计算的结果是值ac。通过acn+acn-1确定(ac)的累积值，从而表示以天数计的级分的年龄。在实施例中，参考对照是具有已知HbA1c含量的内部对照细胞群体，如美国专利No.7,968,279中所述，该专利据此全文以引用方式并入。
在实施例中，该分析的级分中细胞年龄的确定可以将时间轴应用于所选的红血细胞参数。一定细胞年龄的级分的平均细胞血红蛋白如US7541190中所述的那样确定，该专利据此全文以引用方式并入。
在实施例中，还计算了红血细胞的平均年龄。在一些实施例中，通过以下方式计算平均年龄：将每个级分中的细胞的数量乘以级分的年龄。将这些乘积之和除以样品的红细胞的总数。
可使用每个级分以天数计的年龄来确定血样的平均年龄。可将取自疑似或已知患有疾病的受试者的血样的平均年龄，与取自未患有该疾病的受试者的对照样品的平均年龄相比较。在实施例中，该疾病是糖尿病。可在初始诊断时或在治疗后采集样品，以监测治疗的疗效。确定每个级分中的HbA1c百分比和每个级分中的细胞百分比，允许确定受试者在约100至约120天(红血细胞的寿命)内的病史。来自每份样品的数据允许确定治疗的疗效，并且比受试者随时间推移所报告的书写日志更准确。参见图14。在实施例中，细胞群体的平均年龄增加指示糖尿病的存在或糖尿病的状态。
在实施例中，可确定作为样品中细胞年龄的函数的平均细胞血红蛋白含量。细胞血红蛋白含量的变化指示贫血之类疾病的存在或贫血之类疾病的状态。在实施例中，细胞血红蛋白含量的减少指示贫血。在其他实施例中，细胞特定年龄时细胞血红蛋白含量的变化指示在过去100至约120天内的出血或输血事件。在实施例中，对于输血事件而言，平均细胞血红蛋白可增加。在实施例中，细胞血红蛋白含量的减少指示出血。
在实施例中，所述系统和/或计算机可读介质可包含于流式细胞仪内或作为独立式产品。在实施例中，所述系统和/或计算机可读介质可包含于用于测量细胞样品的HbA1c的试剂盒中。计算机可读介质是非临时性介质，并且不包括临时性信号。
参考图10、图11和图15，这些图作为用于执行如本文所述的方法的系统的示例性实施例。
图10是示出了流式细胞仪100的例子的示意性框图。在该例子中，流式细胞仪包括样品源102、流体源104、流体喷嘴106、光源108、检测器110(诸如包括检测器110A、110B和110C)、颗粒分析仪112(包括计算装置118和样品年龄评价引擎120)以及容器124。流体喷嘴106生成其中包含颗粒128的流体流126，并且光源108生成光束130。当光束130与流体流126和其中包含的颗粒128相交时，生成辐射的光132。流式细胞仪100的其他实施例包括与图10所示例子相比更多的、更少的或不同的部件。
样品源102为提供给流式细胞仪进行分析的样品的来源。样品包括由光束130照明且由颗粒分析仪分析的单独颗粒128。例如，样品可为血液，并且颗粒可为血细胞。样品可为所制备的样品的形式，诸如通过执行本文所述方案而获得的含通透的红血细胞的流体。样品源102可包括容纳待分析样品的一个或多个容器诸如试管。在一些实施例中，提供流体输送系统，诸如用于将样品从容器中抽出并将样品递送到流体喷嘴106。
样品通常被注入流式细胞仪内的鞘流体内，鞘流体由流体源104提供。鞘流体的一个例子为盐水。流体源104的一个例子为其中储存盐水的容器，以及可操作用于将鞘流体从流体源104递送到流体喷嘴106的流体输送系统。
在一些实施例中，提供流体喷嘴106以生成流体流126并将样品的颗粒128注入流体流中。流体喷嘴106的一个例子为流动池。流体喷嘴106通常包括孔，所述孔的尺寸被选择为至少大于样品中感兴趣颗粒的尺寸，但足够小以将颗粒布置到窄流中。理想情况下，颗粒被布置成单列或近单列构型，使得单个颗粒或较少数量的颗粒(例如，1至3个)可一次穿过光束130。在一些实施例中，颗粒使用水动力、声力或磁力来聚焦。
光源108(其如本文所论述可包括一个或多个光源)生成指向流体流126的至少一个光束。光源108的例子包括激光和弧光灯。在一些实施例中，光束130穿过光学组件，诸如用于将光束聚焦到流体流126上。在一些实施例中，光束为激光束。
来自光源108的光束130与流体流126相交。光束130中包含的颗粒128干扰了光束130并且生成辐射的光132。辐射的光132的类型和模式取决于颗粒128的类型和尺寸，但辐射的光132可包括前向散射光、侧向散射光、反向散射光以及荧光(这在光线被颗粒吸收和重发射时发生，这可通过光线的波长(即，颜色)的对应变化来检测)。
提供一个或多个检测器110以检测辐射的光132。在该例子中，检测器110包括被布置用于检测前向散射和荧光的检测器110A、被布置用于检测侧向散射和荧光的检测器110B以及被布置用于检测反向散射和荧光的检测器110C。检测器110的一个例子是光电倍增管。
颗粒分析仪112用于接收来自一个或多个检测器110的信号以执行各种操作来表征颗粒128。在一些实施例中，颗粒分析仪112包括计算装置118和样品年龄评价引擎120。计算装置的例子在本文有所描述，包括在图11中。样品年龄评价引擎120用于确定如本文所述样品中的细胞血红蛋白的年龄。在一些实施例中，颗粒分析仪112还包括模数转换器。
在一些实施例中，流式细胞仪100为分选流式细胞仪，其用于使用由颗粒分析仪112生成的颗粒的表征来分选颗粒128。分选流式细胞仪可包括分选系统，该分选系统包括分选控制器、至少一个分选板和多个容器。分选流式细胞仪可用于基于颗粒的特性(诸如红血细胞的成熟度或血红蛋白含量)来分选样品的颗粒。例如，分选控制器基于颗粒的表征来向由流体流形成的液滴施加正电荷、负电荷或中性电荷。在一些实施例中，流体喷嘴电耦合至电荷生成电路，所述电荷生成电路由分选控制器控制。当液滴穿过带电分选板时，液滴基于它们各自的电荷而朝向容器之一转向。分选流式细胞仪通常具有至少两个容器，并且也可具有超过三个容器。通常，一个容器为不需要的颗粒或被发现受到一个或多个颗粒污染的液滴所用的废物容器。
图11示出了可用于实施本公开的各方面的计算装置的示例性架构，所述计算装置包括可在流式细胞仪100内使用的所述一个或多个计算装置118中的任何一者。图11中所示的计算装置可用于利用处理装置180执行本文所述的操作系统、应用程序和软件模块(包括软件引擎)。
在一些实施例中，计算装置118包括至少一个处理装置180，如中央处理单元(CPU)。多种处理装置可得自多个制造商，例如英特尔公司(Intel)或AMD公司(AdvancedMicro Devices)。在此示例中，计算装置118还包括系统存储器182和系统总线184，该系统总线将包括系统存储器182在内的多个系统部件连接到处理装置180。系统总线184是任何数量的类型的总线结构中的一者，包括存储器总线或存储控制器；外围总线；以及使用多种总线架构中的任一者的局部总线。
适用于计算装置118的计算装置的例子包括台式计算机、膝上型计算机、平板计算机、移动计算装置(诸如智能电话、或(苹果公司(Apple Inc.)的注册商标)移动数字装置、或者其他移动装置)，或者被配置用于处理数字指令的其他装置。
图11中示出的计算装置也是可编程电子装置的例子，其可包括一个或多个此类计算装置，并且当包括多个计算装置时，此类计算装置可用合适的数据通信网络连接在一起，以便共同执行本文所公开的各种功能、方法或操作。
图15示出了可在计算装置上实施的本公开方法的示例性流程图，所述计算装置包括可在流式细胞仪100内使用的所述一个或多个计算装置118中的任何一者。在实施例中，计算装置包含用于实施方法的指令，所述方法包括确定血样的血红蛋白、HbA1c和RNA含量(1502)，利用每个细胞的HBA1c和血红蛋白含量确定每个细胞中的HbA1c百分比(1504)，将红血细胞群体分级成多个级分(1506)，确定每个级分中的HbA1c平均百分比(1508)，以及确定每个级分中的红血细胞的年龄(1510)。
方法
在本公开的一个方面，红血细胞的寿命、RNA参数与源自网织红细胞的血红蛋白参数之间的关系，提供了取自受试者的样品中红血细胞的年龄的表征。在网织红细胞的成熟期间，RNA含量逐渐消失，同时血红蛋白含量上升达到最高值。在RNA含量与血红蛋白含量乘积的函数中，递减的RNA和递增的血红蛋白将彼此平衡，并且该函数的值将在网织红细胞的成熟期间保持不变。然而，如果RNA和血红蛋白两者都较低，这意味着在抽取血样时网织红细胞未能达到正常血红蛋白水平。本文建立了网状内皮系统中红细胞的破裂与网织红细胞中血红蛋白的合成之间的联系。
在本公开的一个方面，逐个细胞流动分析允许针对至少一个指标而将细胞分级成亚群。在实施例中，该指标是HbA1c、血红蛋白和/或RNA。红细胞群体适用于分级成不同年龄的亚群。其他具有活性细胞核的细胞会经历增殖或对其成分的更新。然而，红细胞失去了其细胞核和其RNA，并且进入确定长度的寿命。最近开发了将抗体染色应用于红细胞的内部而不破坏细胞实体的技术。通过用抗HbA1c抗体来染色并测量细胞血红蛋白的量，可以确定每个细胞的HbA1c百分比。
由于葡萄糖可以自由进入细胞，始终存在于血液中并且HbA1c的形成是不可逆的(Amadori M.,Atti Accad.naz.Lincei,1925,2,337；1929,9,68,226；1931,13,72,195(Amadori M.，《国家林琴科学院院刊》，1925年，第2卷，第337页；1929年，第9卷，第68期，第226页；1931年，第13卷，第72期，第195页))，因此HbA1c的百分比始终上升并且可用作细胞年龄的量度。使用HbA1c作为年龄指标时，零点被定义为未成熟红细胞已产生其一半血红蛋白的点。细胞发育成网织红细胞和成熟红细胞，并在其寿命结束时最终被肝、骨髓和脾中的网状内皮系统清除。红细胞的寿命被定义为存活最长时间的细胞的年龄。
在本公开的另一个方面，测量独立红细胞的HbA1c百分比，并且在流式细胞仪中获得的红细胞事件在百分比HbA1c的标度上重新组织。由于红细胞的百分比HbA1c与年龄之间的关系，这种标度也表示细胞的年龄。其上仍然存在细胞事件的标度的最大值对应于最老红细胞的寿命。在第一种方法中，应用120天的寿命值，其一般用作人红细胞的平均寿命。然而，在本公开的实施例之一中，使用未成熟循环红血细胞(网织红细胞)的血红蛋白含量和RNA含量来测量寿命系数。已表明，使用这些参数，可以获得个体的红细胞的寿命的量度。
在细胞HbA1c百分比或年龄的标度上的红细胞事件允许通过游标的放置来划分细胞群体。游标之间的细胞事件称为级分。级分中具有限定数量的细胞事件。根据两个因素来设定这些级分的界限；坐标轴上的事件的等级顺序以及坐标轴上的细胞事件的数量。这样，不同级分的HbA1c百分比是独立参数，并且可用于级分中的细胞的年龄计算。可在其红细胞已暴露于不同葡萄糖浓度的不同个体之间比较对应级分。
在实施例中，这些级分包含类似数量的细胞。HbA1c百分比值基于级分界限的位置。在实施例中，使用这些级分的平均值来计算年龄值。对于级分中细胞的年龄的计算，重要的是首先确定细胞是否可能由于死亡或因固定化在实体器官中所致的不存在于循环血液，而从级分中缺如。
在本公开的一个方面，各级分的HbA1c百分比之间的差值除以各级分的平均值的差值，得到导出的HbA1c值。这种导出的HbA1c百分比值是HbA1c百分比在一定时间段内的百分比变化，并且是在这个时间段期间个体中的血液葡萄糖浓度的量度。对于取自非糖尿病个体的血样，各级分的导出的HbA1c百分比值不变。
在实施例中，独立红细胞或红细胞群的血红蛋白年龄和导出的HbA1c参数的测量和计算，是在血样的所有其他红细胞的测量和计算的背景下完成的。就取自糖尿病个体的血样而言，在与正常参考血样相比较的情况下完成该测量和计算。
在该实施例的另一个方面，对取自正常个体和取自糖尿病个体的对应级分的平均值和界限值进行比较。这允许测量糖尿病个体各级分的HbA1c的导出的百分比。将糖尿病受试者的不同年龄的级分的导出的HbA1c百分比值与相同受试者自测的随时间推移的血液葡萄糖浓度进行比较，发现这两种模式存在相似性。将糖尿病受试者登记的随时间推移的血液葡萄糖浓度与相同受试者的血样的年龄级分的导出的HbA1c百分比进行比较，验证了各级分的年龄测量。
在本公开的另一个方面，确定了取自每名患者的样品中红血细胞的寿命值，从而提供年龄级分的随时间推移的血液葡萄糖浓度和导出的HbA1c值的反映。这些独立寿命值显示出与网织红细胞的参数的相关性，尤其是这些细胞的血红蛋白含量和RNA含量的函数。考虑到作为网织红细胞参数的函数而计算的红细胞的寿命以及血细胞级分相对于该寿命的相对年龄的计算，可以测量血样中独立细胞或细胞群的细胞血红蛋白的年龄。
在另一个实施例中，个体红细胞的最老10％级分的HbA1c百分比及其所有红细胞的平均HbA1c百分比的商可被视为红细胞的寿命的函数。在另一个实施例中，最老级分的HbA1c百分比具有临床意义(Zoungas S et al.Diabetologia.2012Mar；55(3):636-43.doi:10.1007/s00125-011-2404-1.Epub2011Dec 21(Zoungas S等人，《糖尿病学》，2012年3月；第55卷，第3期，第636-643页。doi:10.1007/s00125-011-2404-1。电子版2011年12月21日))。具有最高HbA1c百分比的细胞会引起血管并发症。
在本公开的另一个方面，独立红细胞或红细胞群的计算年龄可与取自血样的这些细胞或细胞群的导出的HbA1c百分比结合，并且所结合的数据可用于重建受试者过往经历的时间标度上的血液葡萄糖浓度。
提供了将细胞群的计算年龄与导出的HbA1c百分比、与细胞血红蛋白含量及与血流中红细胞的呈现相结合的应用例子，从而允许确定细胞是否由于在其他器官中的消失或由于清除或死亡而从血流消失。然而，该应用不限于这些例子，并且独立细胞或细胞群的计算年龄与这些独立细胞或细胞群的其他参数的结合是本公开的组成部分。
在本公开的不同实施例中，流式细胞术数据的处理可在这样的方法中使用，所述方法用来将血红蛋白的年龄归属于取自血样的独立红细胞或红细胞群；确定取自个体的红细胞的寿命的长度；确定取自血样的红细胞的平均年龄；将HbA1c百分比和导出的HbA1c百分比归属于取自血样的红细胞群；将细胞血红蛋白含量或平均细胞血红蛋白含量归属于取自血样的一个红细胞或红细胞群；将血液循环中特定年龄的血红蛋白的红细胞群的呈现确定为细胞完全呈现的百分比，如果细胞没有因死亡、细胞从血流清除或缺失而消失，并且如果没有出现红细胞产量的短暂波动，则该百分比为100％；或者任何上述实施例的组合或任何上述实施例与红细胞的任何其他参数的组合。
用于确定红细胞的年龄-时间标度的系统和方法可用于糖尿病和/或贫血的诊断和监测。该系统检测相当突然的血液变化，并且可在持续约3-4月时间段的时间标度上记住这些变化。当该系统检测到数月前发生的葡萄糖变化时，该系统还可检测特定时间点后红细胞的密度变化。相似地，可在一定时间点处检测到血红蛋白含量的变化。
在其他实施例中，如本文所述的方法可用于检测出血或输血。如果两个月前发生了出血事件，则会在两月时间点处存在血红蛋白含量的断点。就输血而言，如果供血者与受血者血液之间存在血红蛋白含量的差异，则输入的血液是可检测的。接受输血的时间处的断点将是可检测的。
现在参见图15，在实施例中，方法包括测量独立红血细胞的HbA1c和血红蛋白(操作1502)；利用独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比(操作1504)；使用每个独立红血细胞的HbA1c百分比与参考细胞级分的平均HbA1c相比较，将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞(操作1506)；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比(操作1508)；以及通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别独立血细胞的年龄(操作1510)。
在实施例中，方法包括测量独立红血细胞的HbA1c和血红蛋白；利用独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比；使用每个独立红血细胞的HbA1c百分比与参考细胞级分的平均HbA1c相比较，将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比；以及通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别独立血细胞的年龄。在实施例中，在流式细胞仪中测量红血细胞的HbA1c和/或血红蛋白。在其他实施例中，该方法还包括与参考对照细胞的该级分相比，确定样品中属于特定HbA1c百分比的级分的红血细胞的密度。在实施例中，参考对照细胞具有至少28天的平均年龄。
在实施例中，该方法还包括测量样品中的独立细胞的RNA含量。在实施例中，参考细胞级分是网织红细胞级分。在实施例中，通过用结合RNA的染料诸如吖啶橙进行染色，来确定网织红细胞所占的细胞比例。
在实施例中，可通过与可检测地标记的抗体结合来确定独立细胞中的HbA1c，该抗体结合于HbA1c或其变体。在实施例中，该可检测标记物是可在与侧向散射和/或结合RNA的染料不同的波长处检测的荧光部分。
在实施例中，可通过侧向散射来测量细胞血红蛋白，如US7541190中所述，该专利据此以引用方式并入。
在实施例中，通过将HbA1c荧光除以侧向散射(例如，FL4/SS)来确定独立细胞中的百分比HbA1c。在各种实施例中，对百分比HbA1c进行修正，以考虑背景。在其他实施例中，使用公式II将百分比HbA1c换算为百分比IFCC HbA1c。
在实施例中，独立细胞的百分比HbA1c的值被分级为多个级分。在实施例中，通过参考网织红细胞级分的HbA1c的平均百分比来确定这些级分。在实施例中，样品被分成至少10个级分，每个级分具有大约相同数量的细胞。
在实施例中，确定每个级分中的HbA1c的平均百分比，通过将该级分的HbA1c的平均百分比与参考对照级分的经寿命系数修正的HbA1c的平均百分比相比较，来确定该级分中的血细胞的年龄。在实施例中，参考对照级分是具有已知HbA1c含量的内部对照细胞群体。
在本公开的一个实施例中，描述了一种方法，该方法用于将流式细胞术所测量的独立红细胞中的HbA1c百分比的增加值与这些红细胞中的血红蛋白的年龄相关联。该方法并不测量独立细胞中的HbA1c百分比增加所需的时间，而是提供了流式细胞仪所测量的细胞事件在上升的HbA1c百分比的标度上的重排。HbA1c百分比的上升值可与时间标度相关。在实施例中，时间标度的总长度约为红细胞的寿命。在实施例中，寿命为约1至200天、约10-200天、约50-200天以及约100-200天。
在另一个实施例中，细胞事件在递增时间标度上的重排与这些细胞中的HbA1c百分比的上升速度无关。本公开的方法将百分比HbA1c的增加值或减小值表示为与时间的关系并与独立细胞的百分比HbA1c值无关，并且将HbA1c百分比表示为时间的函数。这种与HbA1c形成或葡萄糖浓度的变化的无关以及与细胞的血红蛋白含量的变化的无关，提供了对疑似有或具有病态或病情的样品的分析。
在本公开的一个实施例中，描述了用于检测或监测糖尿病的进展的方法，该方法包括测量取自患有糖尿病的受试者的、独立红血细胞的HbA1c、血红蛋白以及任选的RNA；利用独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比；使用每个独立红血细胞的HbA1c百分比与网织红细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比；通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别该级分中的红血细胞的年龄；确定取自患有糖尿病或疑似患有糖尿病的受试者的样品中红血细胞的平均年龄；以及将该样品的红血细胞的平均年龄与取自正常受试者的样品的红血细胞的平均年龄相比较。在实施例中，对照细胞群体是取自没有疾病或病症诸如没有糖尿病的受试者的红血细胞。在实施例中，参考对照级分具有已知百分比的HbA1c，如美国专利No.7,968,279中所述。
在本公开的一个实施例中，描述了用于检测和/或监测贫血的进展的方法，该方法包括测量取自患有贫血的受试者的独立红血细胞的HbA1c、血红蛋白以及任选的RNA；利用独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比；使用每个独立红血细胞的HbA1c百分比与网织红细胞级分的HbA1c的平均百分比相比较，将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比；通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别该级分中的红血细胞的年龄；确定取自患有贫血的受试者的样品的每个年龄级分的平均细胞血红蛋白；以及确定不同年龄级分中是否存在平均细胞血红蛋白的差异。在实施例中，参考对照级分具有已知百分比的HbA1c，如美国专利No.7,968,279中所述。
在实施例中，可确定作为样品中细胞年龄的函数的平均细胞血红蛋白含量。细胞血红蛋白含量的变化指示贫血之类疾病。在实施例中，细胞血红蛋白含量的减少指示贫血。在其他实施例中，细胞特定年龄时细胞血红蛋白含量的变化指示在过去100至约120天内的出血或输血事件。在实施例中，对于输血事件而言，平均细胞血红蛋白可增加。在实施例中，细胞血红蛋白含量的减少指示出血。
在另一个实施例中，本公开包括对函数进行修改，该函数提供由流式细胞技术对全部红细胞所获得的HbA1c百分比值和参考实验室技术所获得的HbA1c百分比值之间的相关性。该修改的函数提供相似的相关性，但意味着从约5％至15％范围的测量范围扩展，这适用于由不同样品中的独立细胞表示的约0％至25％的全血值。
在本公开的另一个实施例中，并未测量独立细胞的HbA1c百分比值，而是计算了总细胞群体的各级分的平均HbA1c百分比值。以HbA1c百分比的上升值为基础来选择细胞的这些级分或亚群。本公开提供了各级分的平均HbA1c百分比向各级分的时间值的转换。
在另一个实施例中，建立了用于确定基本时间标度的参考。该参考包括取自多个正常受试者的血样的数据，其中可以推测他们具有稳定的血液葡萄糖水平和HbA1c百分比的正常定期上升值。应用HbA1c百分比的常数增加值，可以构建基本时间模板，其可用作利用其他受试者样品来计算时间标度的参考。
在另一个实施例中，得自正常样品的基本时间模板被应用于受试者的其他样品。在实施例中，需要多种修正。这些修正包括：1)细胞亚群的HbA1c百分比平均值在时间标度上的正确位置的计算，和/或2)基于网织红细胞的情况和/或红细胞的寿命进行的修正。在实施例中，在应用这些修正后，构建适用于其他患者或正常受试者的时间标度。
在另一个实施例中，一旦已构建时间标度，就可将相应级分或亚群之间的HbA1c百分比的上升值(HbA1c百分比值的导数)对该曲线上的时间点作图。这样可以直观表示HbA1c的形成速度。由于处于体内环境，HbA1c形成的速度取决于血液葡萄糖的浓度，这些微分HbA1c百分比曲线与血液葡萄糖曲线之间存在一定关系。
在另一个实施例中，本公开涉及确定糖尿病受试者的红血细胞年龄。在抽取血液后，这些受试者给出了每天一次或几次血液葡萄糖测量的结果。几个月监测的结果表示于葡萄糖/时间曲线上，并且与表示由相同受试者的血样的流式细胞术数据得出的、微分百分比HbA1c值/时间的曲线进行比较。数据的比较提供了用于测量细胞血红蛋白年龄的方法。
在本公开的另一个实施例中，时间数据用于将细胞血红蛋白含量作为时间的函数来表达。在本公开的另一个实施例中，本文所述的方法可用于确定受试者红血细胞的平均年龄和寿命的方法。在本公开的另一个实施例中，血样中所呈现的细胞的百分比是由于受试者的红细胞在器官中被固定或者通过自然清除或通过病理过程发生死亡而导致细胞消失的量度。
细胞处理
在一个实施例中，根据本文所述的方法，将全血红细胞稳定、通透，并且用在特定波长(例如675nm，FL4)发射的荧光标记的抗HbA1c抗体以及用在另一个波长(例如525nm，FL1)发射的RNA指标进行染色。这些细胞在配备有侧向散射(SS)倍增管的流式细胞仪中分析，并且在代表FL4/SS的坐标轴上给出(图1b)，FL4/SS是HbA1c百分比的量度，例如如美国专利No.7,968,279中所述。通过RNA染色(FL1)并以低HbA1c含量为基础来分离网织红细胞。
在实施例中，为了计算正确的HbA1c百分比和细胞血红蛋白含量，将具有已知HbA1c百分比值的参考对照细胞添加到样品中，如US7968279中所述。参考对照通常由具有已知血红蛋白浓度、或等效血红蛋白浓度、已知侧向散射和荧光强度的荧光颗粒构成。这些通常包括但不限于合成颗粒、人或动物血细胞以及经处理的人或动物血细胞。在校正后，可在流式细胞仪上获得独立红血细胞中细胞HbA1c的定量测量值，即该血红蛋白变体的绝对量。
使用同型对照抗体或通过在该测定法中添加糖化HbA1c肽来封闭抗体的HbA1c反应性，从而对网织红细胞和成熟红细胞测量HbA1c抗体的背景值。对HbA1c具有特异性的抗体是已知的或者可商购获得。这些抗体可易于使用可检测标记物，特别是可通过流式细胞术检测的那些标记物来进行标记。
在实施例中，该标记物(例如，对HbA1c具有特异性的可检测地标记的抗体)可透过细胞。使用细胞透化与稳定试剂对血样进行处理，该细胞透化与稳定试剂能够透过红血细胞的细胞膜，从而使细胞内标记物渗透到红血细胞中以便进行细胞分析。该细胞透化与稳定试剂还引起细胞内蛋白质在细胞膜内的沉淀和/或聚集，但保留细胞成分，诸如细胞内和细胞表面抗原位点、DNA和RNA分子以及细胞骨架元件。
术语“细胞成分”包括细胞膜内及细胞膜表面上的细胞组分，诸如细胞表面抗原位点。术语“细胞内成分”是指细胞膜内的细胞组分，其包括但不限于细胞内蛋白质，诸如红血球内的血红蛋白和血红蛋白变体，细胞骨架元件，以及DNA和RNA。细胞骨架元件包括但不限于微管蛋白和血影蛋白。
在实施例中，该细胞透化与稳定试剂包含：
由以下分子结构表示的N-酰基肌氨酸或其盐：R1-CO-N(CH3)CH2COOX1，其中R1是具有8至18个碳原子的烷基或亚烷基基团，并且X1是H、Na+或K+；
将该试剂的pH调至小于7的pH调节剂；以及
水性介质。
游离酸形式的N-酰基肌氨酸及其盐可商购获得。优选的是使用游离酸形式，其不会向试剂中引入金属离子。游离酸形式的N-酰基肌氨酸不是水溶性的。可将其预先溶解于乙醇溶液中，然后添加到水溶液中。当pH调节剂将该试剂的pH调至4至6时，N-酰基肌氨酸在溶液中呈阴离子的形式。
N-酰基肌氨酸的合适例子包括N-油酰肌氨酸、N-硬脂酰肌氨酸、N-月桂酰肌氨酸、N-肉豆蔻酰肌氨酸、N-椰油酰肌氨酸及其盐。在实施例中，R1的烷基或亚烷基基团具有12个碳原子。在一个优选的实施例中，使用N-月桂酰肌氨酸。
在实施例中，一旦细胞被标记，就可使用特定波长处的设门在流式细胞仪上分析一个或多个标记物诸如HbA1c和/或RNA的存在。
在实施例中，提供了用于确定样品中的红血细胞群体的年龄概况的试剂盒，该试剂盒包含：a)特异性地结合HbA1C或其变体的抗体或其抗原结合片段；b)特异性地结合于RNA的染料；以及c)红血细胞参考对照样品。在一些实施例中，红血细胞参考对照级分具有已知百分比的HbA1C。在其他实施例中，参考对照细胞是正常对照样品，诸如取自未患有糖尿病或贫血的受试者。在其他实施例中，参考对照细胞取自患有糖尿病且HbA1C值已知的受试者。在实施例中，抗体或抗原结合片段被可检测地标记。在实施例中，特异性地结合于RNA的染料是吖啶橙。在实施例中，该试剂盒还可包含用于透化红血细胞的试剂。在实施例中，试剂盒还包含计算机可读介质，该计算机可读介质提供对样品中的红血细胞的年龄和/或密度的确定。
数据分析
在实施例中，方法包括使用流式细胞仪测量独立红血细胞的侧向散射和荧光；通过侧向散射来确定独立红血细胞的血红蛋白含量；利用独立红血细胞的实测荧光导出HbA1c含量；以及利用红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比；使用独立细胞的HbA1c百分比与参考细胞级分(例如，网织红细胞)相比较，将红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的平均百分比，并且通过将HbA1c的平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别红血细胞的年龄。
在实施例中，使用内部对照细胞计算平均细胞血红蛋白(MCH)，例如包括以下步骤：(a)将血样的等分试样与通透试剂混合而形成第一样品混合物；以及在足以通透红血细胞的细胞膜并造成细胞内的血红蛋白聚集的第一时间段内温育第一样品混合物；(b)将中和试剂添加到第一样品混合物而形成第二样品混合物，并且在足以抑制通透试剂与红血细胞进一步反应的第二时间段内温育第二样品混合物；以及(c)在流式细胞仪上对第二样品混合物中的红血细胞的侧向散射信号进行逐个细胞测量；以及(d)使用由该测量得出的侧向散射信号来获得红血细胞的细胞血红蛋白(Hgb细胞)。在实施例中，利用分析仪报告的红细胞指数来获得每份血样的平均细胞血红蛋白(MCH)。应当注意到，在血液分析仪上，MCH(皮克)由裂解血样的总血红蛋白浓度(Hgb，克/分升)和血样的红血细胞计数(RBC，个数/升)计算。
在实施例中，单独分析了由样品的两个等分试样所得的平均侧向散射值与血液分析仪上得出的MCH的相关性。在获得细胞血红蛋白后，可通过将Hgb细胞乘以红血细胞计数来得出血样的总血红蛋白浓度。该红血细胞计数可独立地获得，或如果流式细胞仪器具有流体体积测量装置以有利于计数的话，可与上述测量一起获得。
在实施例中，利用每个独立红血细胞的HbA1c含量和血红蛋白含量来确定HbA1c的百分比，是通过使HbA1c含量和血红蛋白含量(例如，FL4/SS)相除而确定的。在实施例中，可应用一种或多种修正，以对HbA1c的百分比进行修正。在实施例中，使用公式y＝c*e0.157*x来转换归一化的FL4/SS数据，
其中y是转换的数据，x是归一化的FL4/SS数据，并且c是常数(例如，2.74)。然而，该函数并不经过原点。虽然该函数可用于修正大致在5％与15％之间变化的HbA1c百分比值，但其被替换以便用于我们分析中从大约0％变化至25％的级分。对于该函数的替换，选择了以下通式；
y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)
通过与葡萄糖值的比较，根据经验确定这些常数的值，如下所示。这些常数的示例值是a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(欧拉常数或自然对数的底)，f＝1.8。该替换公式的第一部分使曲线经过原点；第二部分将轻微反S形曲线引入该曲线的下限值的区段中。在固相免疫测定法中经常观察到这种类型的标准曲线(参见Ekins,R.P.Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine IAEA,Vienna,1974,STI/PUB/350,pp 91-121(Ekins,R.P.，放射性免疫测定法与医学中的相关程序，维也纳国际原子能机构，1974年，STI/PUB/350，第91-121页))。该替换公式(2)如(1)中那样在相关性方面进行修正，分别具有0.95和0.94的R2值。
在实施例中，为了计算血样中每个独立细胞的年龄和HbA1c百分比，在实施例中，优选地已知以下因素：
(1)HbA1c标记物与HbA1c分子结合的动力学
(2)细胞寿命期间的葡萄糖浓度
(3)细胞寿命的长度。
(4)HbA1c形成的动力学。
在实施例中，根据已公布的说明，将参考HbA1c百分比值从当前NGPS值换算为新IFCC值(David B.Sacks发表的ADA/EASD/IDF working group of the HbA1c assay；Clinical Chemistry.2005；51:681-683.(HbA1c测定法的ADA/EASD/IDF工作组；《临床化学》，2005年；第51卷，第681-683页))。新IFCC值与NGSP值不同之处在于没有对于零值的截距，因此更适合包括幼小细胞的较低值的情况。考虑到作为一级反应的抗体结合响应于对数函数，将其逆函数指数公式应用于流式细胞术数据，得到线性相关性，其中回归线经过图形的原点。
抗体结合动力学：
逆函数：y＝c1*(ex*c2-1)
其中y是由参考实验室给出的以IFCC单位计的HbA1c百分比，x是在存在内部参考的情况下确定的流式细胞术HbA1c百分比，并且c1和c2是常数。
在其他实施例中，在细胞HbA1c百分比或年龄的标度上的红细胞事件允许通过游标的放置来划分细胞群体。游标之间的细胞事件称为级分。级分中具有限定数量的细胞事件。在实施例中，这些级分包含类似数量的细胞。HbA1c百分比值基于级分界限的位置。在实施例中，使用这些级分的平均值来计算年龄值。对于级分中细胞的年龄的计算，首要的是首先确定细胞是否可能由于死亡或因固定化在实体器官中所致的不存在于循环血液，而从级分中缺如。
在实施例中，细胞的分级涉及使用样品中存在的网织红细胞的HbA1c百分比的平均值作为级分界限值。在实施例中，细胞被分成至少10个级分。在一个实施例中，最后级分10的级分界限估计为最后级分10的平均荧光值加上级分8和9的级分界限值之差的一半。针对荧光的背景和补偿对这些值进行修正。
在本公开的一个方面，各级分的HbA1c百分比之间的差值除以各级分的平均值的差值，得到导出的HbA1c值。这种导出的HbA1c百分比值是HbA1c百分比在一定时间段内的百分比变化，并且是在这个时间段期间个体中的血液葡萄糖浓度的量度。对于取自非糖尿病个体的血样，各级分的导出的HbA1c百分比值不变。
在一些实施例中，级分界限值以最初IFCC百分比HbA1c表示，如表1中所示。将列b中的每个级分界限值除以列b的平均值。将所得值乘以样品的平均IFCC HbA1c百分比值3.44。级分界限值以IFCC百分比HbA1c表示。列d的值由列c的值使用公式(VIII)得出；
(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)
级分大小(以HbA1c百分比计)＝来自列d的级分(n)-级分(n-1)。
在实施例中，在确立上述因素的基础上，使用由六份正常血样组成的参考，构建时间轴。级分的HbA1c百分比界限值用作任意年龄或时间单位，并构建反应曲线。反应曲线的导数是水平线，这表示HbA1c形成的恒定速率，如在恒定葡萄糖浓度及上述假设下所预期的(图3D)。如可从图3E观察到，时间标度上的级分的大小不规则，并且彼此有很大差异。这可能是由于这样的事实：某些年龄的红细胞由于不同原因而从循环中消失。
在本公开的一个方面中使用的策略是对取自血样的属于不同年龄段的红细胞群体(级分)进行比较，以确定这些群体的细胞的呈现中是否存在波动。可由于以下原因而出现这些波动：死亡、清除，或停留在骨髓、脾等器官中而脱离循环，在特定时间段期间所产生的细胞的数量出现波动。在理想模型中，红血细胞处于恒定葡萄糖浓度的环境中，HbA1c以恒定速率形成，细胞以恒定速率形成，所有细胞在相同寿命之后被破坏，并且血液循环之外未发生细胞的进一步死亡或隐藏。在这种情况下，各级分中的细胞的呈现被称为100％。在这种样品中，如图1B中所示分析的、其中具有等量细胞的级分将显示出每个级分的HbA1c百分比的恒定上升，并且所有级分将具有恒定大小。对于理想模型而言，当细胞从给定级分中消失时，级分大小将以一定系数增大，该系数是来自理想样品的级分中的100％细胞除以来自样品的给定级分中所呈现的细胞的百分比。
使用上述公式VIII，并保留恒定葡萄糖浓度和HbA1c形成的线性动力学的假设，可计算级分中呈现的细胞的百分比。年龄轴开头的级分(其中细胞较幼小)较大，推测起来是因为细胞在释放到血流中之前隐藏在骨髓或脾中。在该坐标轴的末尾，级分较大，推测起来是因为老细胞经历了清除。在(图3F)中，所呈现的细胞的百分比被绘制在年龄轴上。最小级分的值被用作100％。该模式响应于这样的普遍预期：至少在相当长时间期间，红细胞在血流中被完全呈现并且尚未经历消除。
在实施例中，采用该方法分析血样中的细胞的呈现。使用这些条件时，细胞数量的波动看起来是在正常个体中公认正常的波动，从而有力地指示所选条件是正确的(参见示例3、图3F)。
在如上所述的时间轴的计算中，血液所经历的恒定葡萄糖浓度是一种条件。就糖尿病血样而言，必须考虑葡萄糖浓度的变化。细胞事件分成所述十个级分并不取决于葡萄糖浓度或细胞血红蛋白，因此可以比较来自正常样品和糖尿病样品的对应级分。
当葡萄糖浓度发生变化或呈现的细胞的百分比发生变化时，级分界限的值可变化。与呈现的细胞的百分比的变化相比，葡萄糖浓度的变化在HbA1c百分比对时间的曲线图上可具有不同效应。时间轴由HbA1c百分比轴导出，如在例如实例3中所述。
如图4和图4b的模拟中所示，级分中的HbA1c百分比的变化或呈现的细胞的百分比的变化均产生类似效应。上述分析表明，在不引入新参数的情况下，无法决定级分界限值的变化是可归因于时间轴(呈现的细胞的百分比的变化应归因于该坐标轴)还是可归因于HbA1c百分比轴(葡萄糖浓度的变化应归因于该坐标轴)。
级分内的平均值的位置是细胞所经历的葡萄糖浓度的指标。由于级分以及级分中的细胞的等级顺序与葡萄糖浓度无关，葡萄糖浓度的变化将使细胞向级分的下端移动或向级分的上端移动，这分别属于葡萄糖浓度降低或升高的情况。该变化会影响级分中的细胞事件的所计算的平均HbA1c百分比值。为了针对平均值的位置来比较患者级分和参考级分，将参考级分及其级分界限值的位置调整成适应患者的级分(实例5)。将来自正常个体的样品的、HbA1c百分比轴上的级分的大小与来自糖尿病个体的那些级分的大小进行比较，并且还将级分内的平均HbA1c值与参考的调整平均值进行比较，可以计算导出的HbA1c百分比或葡萄糖浓度的变化。
在患者级分平均值与正常参考的对应级分平均值相比较的情况下，将表示各自平均值的比率的系数乘以患者的总细胞平均HbA1c百分比。为了补偿不同HbA1c百分比对年龄计算的效应，将由该级分表示的时间段除以相同系数(实例6)。这种双重修正的结果在图4c中示出。正常样品与糖尿病样品的级分之间的平均值的位置差异较小。用于计算微分HbA1c值的关系式在实例5中给出。
为了比较时间/年龄曲线图中的平均血液葡萄糖浓度和HbA1c百分比值，对每名患者引入不同系数，以使葡萄糖浓度值的平均值与经调整的平均HbA1c百分比值对准(实例7)。HbA1c百分比/年龄曲线图与患者葡萄糖/实际时间曲线图相比较，揭示了相似性。通过调整HbA1c百分比曲线图的时间轴上的总范围，可进一步改善该相似性(实例8、图6)。该经调整的总范围反映了不同患者的红细胞寿命的长度。
在实施例中，发现了红血细胞的寿命与属于网织红细胞的RNA参数和血红蛋白参数之间存在相关性(实例8、图7)。最开始，在样品的较老级分中寻找这些参数。在网织红细胞的成熟期间，RNA含量逐渐消失，同时血红蛋白含量上升达到最高值。在RNA含量与血红蛋白含量乘积的函数中，递减的RNA和递增的血红蛋白将彼此平衡，并且该函数的值在网织红细胞的成熟期间保持不变。然而，如果RNA和血红蛋白两者都较低，则在抽取血样时网织红细胞未能达到正常血红蛋白水平。根据实例8中的观察结果，网状内皮系统中红细胞的破裂与网织红细胞中血红蛋白的合成之间存在联系。铁的循环利用也可在这种反馈机制中起到主要作用。
多份样品的最老级分的所计算年龄给出了大约100天的平均值，这短于用铬标记技术得出的120天。HbA1c百分比标度上的细胞事件扩展到较高值，这表明达到极高年龄的细胞相当罕见。非常灵敏的铬标记技术可能考虑了这些罕见事件。在实施例中，为了估计与用铬标记技术得出的寿命可比较的寿命，将外推法应用于血液循环中所呈现的红血细胞的曲线。如实例10中所述那样计算独立样品中的红细胞的平均年龄。
该分析的级分中细胞年龄的确定提供了时间轴对所选红血细胞参数的应用。在上述分析中，当前确定了细胞年龄级分的平均细胞血红蛋白。在图9中，示出了这些平均细胞血红蛋白曲线。通常，血红蛋白在5或6天年龄的细胞中达到最大水平。如所报道，更老年龄的细胞丧失了血红蛋白(Gifford SC,Derganc J,Shevkoplyas SS,Yoshida T,BitenskyMW.Br J Haematol.2006Nov；135(3):395-404(Gifford SC、Derganc J、Shevkoplyas SS、Yoshida T、Bitensky MW，《英国血液学杂志》，2006年11月，第135卷，第3期，第395-404页))。
在实施例中，方法包括通过将红血细胞级分的平均百分比HbA1c与表进行比较来确定该级分的年龄的步骤，所述表提供该级分的平均百分比HbA1c与红血细胞的年龄之间的关系式。在实施例中，该方法还包括样品是否包含比参考细胞群体更老的细胞的较大级分，这指示病情。在实施例中，该病情是糖尿病或贫血。
实例1
描述了一种测定法，该测定法测量血样的细胞血红蛋白和HbA1c百分比，并且将细胞分级成网织红细胞和十个级分的成熟红细胞。葡萄糖和血红蛋白一起不可逆地反应而形成HbA1c(Amadori产物)。该反应是作为时间和葡萄糖浓度的函数的连续现象。HbA1c的形成是糖尿病患者的血糖平衡的控制要素。HbA1c的正常值：占总血红蛋白的5％。
材料与方法。
在该测定法中使用以下材料：
1.使用作为抗凝剂的0.7mM乙二胺四乙酸(EDTA)处理并且在4℃下储存不超过十天的血样。
2.球化试剂；0.137M氯化钠、0.005M HEPES、0.0005M(D+)海藻糖、0.083M甲醛、0.04mM正十二烷基β-D-麦芽糖苷、0.5ml/l Proclin-300、0.5mg/l吖啶橙及用于将pH调至7.5的一定量氢氧化钠的水溶液
3.通透试剂；2.03mM N-月桂酰肌氨酸、10mM琥珀酸、0.22M蔗糖、0.015mM牛血清白蛋白、0.5ml/l Proclin-300及用于将pH调至5.4的一定量吡咯烷的水溶液。
4.中和试剂；40mM HEPES、0.5M氯化钠、0.91mM牛血清白蛋白、0.03M叠氮化钠、用于将pH调至7.25的一定量氢氧化钠及与荧光染料Alexa(生命科技公司(LifeTechnologies))647共价偶联的浓度为5mg/l的单克隆抗HbA1c抗体(IgG1)的水溶液。
5.固定试剂；0.155M氯化钠、0.04M磷酸钠、0.18M硼酸、0.01M EGTA、0.016μM硫酸葡聚糖(MW 500,000)、0.62M甲醛及用于将pH调至7.1的一定量氢氧化钠或盐酸的水溶液。
6.标记的参考对照细胞的解冻样品。
示例性方法涉及将血样置于单支试管中。用吖啶橙稀释血样。用通透剂固定细胞并共同温育。然后将对照细胞加入试管中。将荧光标记的抗HbA1c抗体(如美国专利No.7541190中所述的抗体)加入试管中。将荧光抗体/细胞固定，然后通过流式细胞术测量。
标记和分析
将4μl体积的不同血样各自悬浮于200μl的球化试剂中。在温育1分钟后，接着将3μl的悬浮液与60μl的通透试剂混合。在温育1.5分钟后，添加并混合5μl的标记的参考对照细胞，并且在温育1分钟后，添加并混合100μl的中和试剂。在再温育10分钟后，添加80μl的固定试剂。
在FC500MPL流式细胞仪上，通过侧向散射(SS)测量以及在525nm(FL1)和675nm(FL4)处的荧光测量，分析最终样品混合物。取自正常受试者的代表性样品的分析在图1A中示出。通过侧向散射来测量总细胞血红蛋白。通过荧光标记物的确定来测量HbA1c。通过以下方式计算％HbA1c：将荧光值除以侧向散射值并乘以100。
结果
使用提供荧光(FL4)除以侧向散射(SS)的参数的算法程序，进一步分析流式细胞仪软件所提供的样品列表模式数据。分别对区域A、B和C(图1A)进行自动设门和分析。区域A；取自糖尿病患者的对照细胞，区域B；红血细胞网织红细胞，区域C；成熟红血细胞。
将百分比HbA1c轴上扣除网织红细胞的红细胞群体分级为包含大约相等数量的细胞的十个级分(图1A和B)。通过与流式细胞仪相连的计算机程序，给出每个级分的FL4和侧向散射的平均值。对每个通道中的FL4针对荧光溢出进行补偿，并且通过乘以级分SS与总平均SS(如通过FLI确定)之比，将如上所述确定的FL4的背景调整成适应每个级分，背景被视为与不同级分中的细胞的侧向散射值成比例。
红细胞的侧向散射是这些细胞的细胞血红蛋白含量(MCH)的量度。因此可利用流式细胞仪所测量的平均侧向散射值来导出样品的MCH。可利用流式细胞仪所测量的675nm处的细胞荧光平均值(FL4)来导出样品的HbA1c含量。扣除背景值。通过以下方式获得背景值：在不存在抗HbA1c抗体的情况下且在存在与荧光染料Fluor Alexa 647共价偶联的非特异性同型对照单克隆抗体(IgG1)的情况下，用样品运行该测定法。通过将红细胞或样品的HbA1c含量除以血红蛋白含量，获得以任意单位计的HbA1c百分比的量度。在第一种情况下，这种量度通过简单的除法获得；FL4/SS。
单独地分析网织红细胞。如图1C中所示，将具有低FL4值的含RNA细胞(图1A、区域B)与具有高FL4值的污染细胞分离。测量纯网织红细胞的级分。确定以FL4/SS单位计的级分界限和平均值、以任意单位计的FL1值以及以任意单位计的SS值。
实例2
由参考实验室使用三种不同测定法得出的HbA1c百分比数据与使用流式细胞术程 序得出的HbA1c百分比数据的相关性曲线图的比较。
由参考实验室使用三种不同HbA1c测定方法对120份样品确定HbA1c百分比；(Primus Ultra2：亲和色谱法，Roche Unimate：免疫比浊法，以及Tosoh G7变型：阳离子交换色谱法)。在存在HbA1c百分比已知的参考对照细胞的情况下确定流式细胞术HbA1c百分比值。本文描述了任意HbA1c百分比单位向百分比HbA1c值的换算。
方法和结果
在第一种情况下，我们显示了荧光标记的抗体可以自由接近固定的红细胞内的HbA1c分子。红细胞经甲醛固定并在水中裂解，并且在存在洗涤剂的情况下进一步解体。将裂解物用于竞争性实验，其中裂解物中和通透的红细胞中存在等量的HbA1c。在非饱和条件下使用抗体时，裂解物起到抑制作用，并且以与细胞中HbA1c类似的方式进行甲醛固定并用月桂酰肌氨酸处理的裂解物，对抗体结合抑制达到50％，表明抗HbA1c抗体可以自由接近细胞中的HbA1c分子(图2A)。通过以下方式计算样品的HbA1c百分比：将样品的HbA1c含量除以样品的平均细胞血红蛋白含量。通过与混合了样品的参考对照细胞的MCH和HbA1c百分比的已知值的比较，可以确定MHC和HbA1c百分比。由参考实验室获得120份样品。在每份样品中，参考实验室使用三种不同测定法测量了HbA1c百分比值。(图12)
根据NGSP标准化来表示参考实验室所提供的HbA1c百分比值。患者和正常个体的NGSP HbA1c百分比值与平均葡萄糖浓度值的比较显示，与相关性曲线的原点具有2.15％的截距。在细胞的较幼小级分中发现极低HbA1c百分比值。因此，使用了根据IFCC标准化的HbA1c百分比值，这在HbA1c百分比对平均葡萄糖浓度相关性曲线中未显示截距，并且反映更合理的HbA1c百分比。换算公式：
NGSP＝(0.915*IFCC)+2.15 (公式IX)
在以下文献中提供(David B.Sacks发表的ADA/EASD/IDF working group of theHbA1c assay.Clinical Chemistry,2005；51:681-683(HbA1c测定法的ADA/EASD/IDF工作组；《临床化学》，2005年；第51卷，第681-683页))。
在换算成内部参考对照细胞及参考实验室所提供的值的IFCC HbA1c百分比值之后，构建了如图2B中给出的相关性曲线。该曲线的分析揭示了如一级反应所预期的对数函数。使用以下公式换算流式细胞术任意HbA1c百分比值：
IFCC HbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式细胞术任意HbA1c百分比-1) (公式X)，
得到斜率为1、R2为0.9且经过原点的线性相关曲线(图2B)。对于血样或细胞群而言，该公式用于计算IFCC HbA1c百分比值。
利用此前公布的相关性实验的数据来确定如该测定法中所用的抗HbA1c抗体的结合动力学，例如如美国专利No.7,968,279中所述，其中通过参考实验室并通过所述的流式细胞分析，同时分析120份样品。根据已公布的说明，将参考实验室所提供的由该实验得出的参考HbA1c百分比值从当前NGPS值换算为新IFCC值(David B.Sacks发表的ADA/EASD/IDFworking group of the HbA1c assay；Clinical Chemistry.2005；51:681-683.(HbA1c测定法的ADA/EASD/IDF工作组；《临床化学》，2005年；第51卷，第681-683页))。新IFCC值与NGPS值不同之处在于没有对于零值的截距，因此更适合我们的研究，在我们的研究中包括幼小细胞的较低值。所得的相关性在图2B中示出。
考虑到作为一级反应的抗体结合响应于对数函数，将其逆函数指数公式应用于流式细胞术数据，得到线性相关性，其中回归线经过图形的原点(图2c)。
抗体结合动力学：
逆函数：y＝c1*(ex*c2-1) (公式VII)
其中y是由参考实验室给出的以IFCC单位计的HbA1c百分比，x是在存在内部参考对照细胞的情况下确定的流式细胞术HbA1c百分比，并且c1和c2是常数。计算抗HbA1c抗体的结合动力学并在整个研究中使用。
在图2C中，使用以下公式来转换归一化的FL4/SS数据：
y＝c*e0.157*x (公式1)
其中y是转换的数据，x是归一化的FL4/SS数据，并且c是常数(2.74)。相关系数R2＝0.94。
实例3
得自六名正常受试者的数据；不同级分中FL4/SS值和经修正的FL4/SS值的表示， 以及各级分中的HbA1c百分比向时间的转换。
该实例提供得自六名正常受试者的数据以及级分界限FL4/SS值向时间的换算。出于与取自糖尿病个体的血样进行比较的原因，在第一种方法中，选择代表被认为经历了恒定血液葡萄糖浓度的正常非糖尿病个体的血样。为了进一步确认由正常样品得出的参数代表恒定血液葡萄糖浓度，对6份正常样品的参数取平均值。
如实例1中所述，使用由流式细胞仪产生的原始数据将成熟细胞群体分级为包含等量细胞的级分。按细胞的HbA1c百分比的增加，在HbA1c百分比轴上组织细胞(图1B)。不论该增加是快速、缓慢还是不规则，都对细胞事件在该坐标轴上的等级顺序没有影响。只有当增加值为零或负时，才会严重干扰该组织。然而由于葡萄糖始终存在于血液中并且形成HbA1c复合物的Amadori反应具有不可逆性，因此这不可能发生。如下所述，FL4/SS轴上的级分的大小的计算将依据参考样品所提供的数据。因此可将其他样品的所计算HbA1c百分比值应用于级分而无需修改。细胞等级顺序的稳定性使该技术也适用于分析取自糖尿病受试者或血液学异常的受试者的样品。
通过流式细胞分析来确定这些样品的HbA1c百分比值。被认为恒定的导出的HbA1c百分比值被赋予HbA1c百分比的值。
方法和结果
对取自六名正常受试者的血样按实例1进行处理和分析。
在理想模型中，红血细胞处于恒定葡萄糖浓度的环境中，HbA1c以恒定速率形成，细胞以恒定速率形成，所有细胞在120天的相同寿命之后被破坏，并且血液循环之外未发生细胞的进一步死亡或隐藏。在这种样品中，如图1b中所示分析的、其中具有等量细胞的级分将显示出每个级分的HbA1c百分比的恒定上升。在这种模型中，图1b中的FL4/SS或HbA1c百分比轴上的区段应具有相等大小。图1b的样品从正常受试者采集(实例3)以便接近理想模型。图1b中的区段大小不相等的原因可归结于所用样品的特性与如上所概述的理想样品的任何特性之间的差异。使用取自未患糖尿病的血液学正常受试者的样品时，可推测图1b的区段分布根源于独立细胞的不同寿命以及细胞隐藏在从中取样的血液之外。对于理想模型而言，因死亡或隐藏而消失的细胞(以血流中的所呈现的细胞的百分比来表示)将使如图1b中的HbA1c百分比轴上的级分大小增大。考虑到构建图1b时的条件，关系式为；(级分中所呈现的细胞的百分比)＝1/(HbA1c百分比标度上的级分大小)。
在我们使用的模型中，可推测血液中红细胞的HbA1c百分比随时间而增加，因此(级分中所呈现的细胞的百分比)＝1/(HbA1c百分比标度上表示的时间)。在图3a中，示出了未修正的HbA1c百分比与级分编号的关系。在图3b和3c中，对HbA1c百分比进行修正，并且将级分大小替换为最初时间并进行调整，以给出HbA1c百分比随细胞年龄的线性增加。具有高HbA1c百分比且细胞表现性较低的级分此时被分配更大的时间量。这是合理的，因为与理想模型相比，在真实情况下，高HbA1c级分表示一部分尚未出现或已消失的细胞。
为了解释取自六名正常受试者的参考样品与假设模型之间较老级分的差异，可假定较老级分中的时间轴的修正主要针对网状内皮系统对红细胞的清除率进行修正。该模型还允许计算分配给未成熟细胞的年龄。在该参考样品中，此时间大约为分配给成熟细胞的第一级分的时间的30％，该年龄级分直接跟随在网织红细胞之后。考虑到存在10个级分，这意味着未成熟细胞的数量大约占红血细胞总数的3％。我们在该测定法中发现的网织红细胞占细胞总数的百分比仅为0.5％。明显地，处于血红蛋白形成与RNA消失之间的成熟阶段的细胞大约80％未进入血流。
对于时间计算而言，该实例中使用了FL4/SS的级分界限值和每个级分中的细胞数量的数据。未使用网织红细胞级分的级分界限值。实际上，大多数未成熟红细胞从血液循环缺如。因此，循环中存在的网织红细胞被视为未成熟红细胞的最成熟部分，故而网织红细胞的平均FL4/SS值也被用作未成熟细胞的级分界限。
图3A是每个级分的IFCC HbA1c百分比的图形表示。如实例2中所述的那样从正常人受试者获得FL4/SS级分，并如图1中所示的那样进行分析。这些级分如表1中所示并赋予了1至10的值，R表示网织红细胞。对于每个级分而言，将平均FL4/SS值转换成如表1中所示的IFCC HbA1c百分比值。将来自列(a)和(c)的值用于图3A。
图3(B)是IFCC HbA1c百分比在时间轴上的图形表示。
图3(C)是IFCC HbA1c百分比在年龄轴上的图形表示。年龄以负值的天数表示。将来自表1的列(d)和(i)的值用于图3B和图3C。
图3(D)是导出的IFCC百分比HbA1c值对年龄的图形表示。图3C的求导得到常数值(参见表1)。该值已被归一化为参考样品的实测平均IFCC HbA1c百分比。将列(i)的值以及针对样品的平均IFCC HbA1c百分比值进行归一化的常数值(d)/(i)(3.44)用于图3D，作为图1C的微分。
图3(E)是每个级分的级分大小的图形表示。如表1中所示的那样计算以IFCCHbA1c百分比单位表示的级分大小。
图3(F)是血液循环中所呈现的细胞的百分比在年龄轴上的图形表示。该百分比的计算结果在表1中给出。将列(a)和(e)的值用于图3E，并且将来自列(h)和(i)的值用于图3F。
图3A-3F中表示的值汇总于表1中。
表1
计算每个级分的IFCC HbA1c百分比(图3A)、以天数计的每个时间的IFCC HbA1c百分比(图3B)或以天数计的每个年龄的IFCC HbA1c百分比(图3C)；以及计算以天数计的每个时间的IFCC HbA1c百分比的导数(图3D)。每个级分的级分大小(图3E)，以及计算作为以天数计的时间的函数的呈现的细胞(图3F)。
a.网织红细胞以及按编号列出的级分，如图1B中给出。
b.HbA1c荧光值除以级分界限的侧向散射值，如图1B中给出。血流中存在的网织红细胞的平均值被用作级分界限值。最后级分10的级分界限估计为最后级分10的平均荧光值加上级分8和9的级分界限值之差的一半。针对荧光的背景和补偿对这些值进行修正。
c.以最初IFCC百分比HbA1c表示的级分界限值。将列b中的每个级分界限值除以列b的平均值。将所得值乘以样品的平均IFCC HbA1c百分比值3.44。
d.以IFCC百分比HbA1c表示的级分界限值。列d(d)的值由列c的值使用公式(VIII)得出；
(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)
e.以HbA1c百分比计的级分大小＝来自列d的级分(n)-级分(n-1)。
f.倒数值；1/根据公式(II)的列e的级分(n)的值。
g.每个级分的细胞事件的数量。
h.列f的值乘以列g的值。列h的最大值被用作100％。相应地计算其他值。
i.来自列e的级分10的值被用作100天。相应地计算列j的其他值。
使用上述公式VIII，并保留恒定葡萄糖浓度和HbA1c形成的线性动力学的假设，可计算级分中呈现的细胞的百分比。年龄轴开头的级分(其中细胞较幼小)较大，推测起来是因为细胞在释放到血流中之前隐藏在骨髓或脾中。在该坐标轴的末尾，级分较大，推测起来是因为老细胞经历了清除。在(图3F)中，所呈现的细胞的百分比被绘制在年龄轴上。最小级分的值被用作100％。该模式响应于这样的普遍预期：至少在相当长时间期间，红细胞在血流中被完全呈现并且尚未经历消除。
在实施例中，采用该方法分析血样中的细胞的呈现。使用这些条件时，细胞数量的波动看起来是在正常个体中公认正常的波动，从而有力地指示所选条件是正确的(图3F)。
在如上所述的时间轴的计算中，血液所经历的恒定葡萄糖浓度是一种条件。就糖尿病血样而言，必须考虑葡萄糖浓度的变化。细胞事件分成所述十个级分并不取决于葡萄糖浓度或细胞血红蛋白，因此可以比较来自正常样品和糖尿病样品的对应级分。
当葡萄糖浓度发生变化或呈现的细胞的百分比发生变化时，级分界限的值可变化。与呈现的细胞的百分比的变化相比，葡萄糖浓度的变化在HbA1c百分比对时间的曲线图上可具有不同效应。时间轴由HbA1c百分比轴导出，如在例如实例3中所述。
时间轴相对于HbA1c反应/时间曲线的修正。
使用由标准曲线导出的公式以及根据实例3对时间/百分比轴的修改，提供了与葡萄糖值的合理拟合，但对于不同年龄的细胞从血流回收而言给出了不太可能的图形。尤其是较幼小年龄群体似乎代表性不足。明显地，葡萄糖和血红蛋白的反应遵照的时间曲线不完全呈直线而是具有饱和曲线的外观。Amadori反应的最开始几步不是不可逆的，这可能造成饱和效应。另外，糖化血红蛋白经历进一步反应而生成糖化终末(AGE)产物(参见Makita,Z.et al Science 1992,vol.258,pp 651-653(Makita,Z.等人，《科学》，1992年，第258卷，第651-653页))。
应用于时间轴的公式(XII)：y＝x 1.3的应用
给出了与不同年龄的细胞从血流回收的百分比的良好拟合(实例3、图3H)。所得的曲线提供了作为时间的函数的“实际HbA1c值”(图3E)。该曲线的导数于是提供了作为时间级分的函数的实际HbA1c百分比形成速率(图3F)。“HbA1c速率”在本文被定义为样品的平均HbA1c值，要是给定年龄级分中的HbA1c百分比的形成速率将为红细胞整个生命周期的形成速率。
由于实际HbA1c形成速率随时间下降，与葡萄糖值进行比较是不可行的。为此，将如图3D中所示给出随时间推移的常数值的导出的HbA1c百分比值与新构建的时间轴结合。假定标准曲线的应用以及饱和效应的排除提供了仅依赖于葡萄糖浓度的HbA1c形成速率，则经修改的HbA1c形成速率将称为“葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率”。
用于计算时间轴的参考值用作计算来自不同样品的级分中的细胞年龄的模板(“时间模板”)。级分的HbA1c百分比界限值用作任意年龄或时间单位，并构建反应曲线(实例3、图3A、B和C)。反应曲线的导数将为水平线，这表示HbA1c形成的恒定速率，如在恒定葡萄糖浓度及上述假设下所预期的(图3D)。如可从图3E观察到，时间标度上的级分的大小不规则，并且彼此有很大差异。这可能是由于这样的事实：某些年龄的红细胞由于不同原因而从循环中消失。
实例4
该实例描述了26名糖尿病患者的血红蛋白的分析。
方法和结果
在获得当地伦理委员会批准的情况下进行包括26名糖尿病患者的研究。这些患者从到糖尿病门诊看病的患者中选取，而不考虑糖尿病的类型或其他病理状况。选取一天测量并管理其自身毛细血管葡萄糖值数次的患者，并从他们记录了一段时间葡萄糖测量的笔记本中复制。将血液抽取到EDTA上，并如实例1中所述的那样分析。使用流式细胞术程序测量HbA1c。计算在抽取血样之前的30天时间段内每名患者的平均葡萄糖值，并且将这些平均值与流式细胞术程序的HbA1c值进行比较，显示出R2值为0.45的相关性(图5A)。该低相关性正如预期，在文献中已有报道(McCarter et al.Diabetes Care.2004；27:1259-1264(McCarter等人，《糖尿病医疗》，2004年；第27卷，第1259-1264页)，Hudson etal.Ann.Clin.Biochem.1999；vol.36,451-459(Hudson等人，《临床生化年鉴》，1999年；第36卷，第451-459页))。
表2A-2E示出了患者8的各年龄级分相对于参考而言的HbA1c百分比导数或葡萄糖浓度的计算。
表2A参考；各级分相对于参考级分的位置的计算。
表2A患者8；各级分相对于参考级分的位置的计算。
| a | b | c | d | e | f |
| 网织红细胞(R) | |||||
| 级分1 | 49.00 | 1.26 | 0 | 0.74 | 0.26 |
| 级分2 | 72.00 | 1.25 | 0 | 0.75 | 0.25 |
| 级分3 | 95.00 | 1.28 | 0 | 0.72 | 0.28 |
| 级分4 | 117.00 | 1.30 | 0 | 0.70 | 0.30 |
| 级分5 | 136.00 | 1.31 | 0 | 0.69 | 0.31 |
| 级分6 | 154.00 | 1.32 | 0 | 0.68 | 0.30 |
| 级分7 | 171.00 | 1.30 | 0 | 0.70 | 0.30 |
| 级分8 | 191.00 | 1.30 | 0 | 0.70 | 0.30 |
| 级分9 | 217.00 | 1.28 | 0 | 0.72 | 0.28 |
| 级分10 | 261.89 | 1.24 | 0 | 0.76 | 0.24 |
a.按编号列出的级分，如图1B中给出。
b.FL4/SS标度上的级分界限值，如图1B中给出；最后级分10的级分界限估计为最后级分10的平均荧光值加上级分8和9的级分界限值之差的0.5倍。未针对对荧光的背景和补偿对这些值进行修正。
c.样品的(b)值除以参考的(b)值，显示了级分界限相对于参考的位置。
d、e和f.样品级分中分别分配给参考的前一个级分(d)、对应级分(e)和下一个级分(f)的部分。
表2B参考；各级分内的平均HbA1c值的位置的计算。
表2B患者8；各级分内的平均HbA1c值的位置的计算。
| a | g | h | i | j | k | l | m | n |
| 网织红细胞(R) | 15.26 | 15.26 | 15.26 | 50.16 | 0.59 | 1.79 | 0.33 | |
| 级分1 | 30.37 | 30.37 | 43.13 | 44.79 | 44.79 | 1.67 | 1.60 | 1.05 |
| 级分2 | 55.90 | 25.54 | 24.31 | 67.71 | 22.93 | 0.94 | 0.82 | 1.15 |
| 级分3 | 78.99 | 23.09 | 22.78 | 90.76 | 23.05 | 0.88 | 0.82 | 1.07 |
| 级分4 | 101.47 | 22.48 | 21.57 | 112.79 | 22.03 | 0.84 | 0.79 | 1.06 |
| 级分5 | 122.124 | 20.65 | 19.48 | 131.84 | 19.05 | 0.75 | 0.68 | 1.11 |
| 级分6 | 140.44 | 18.32 | 17.96 | 149.94 | 18.10 | 0.70 | 0.65 | 1.08 |
| 级分7 | 158.04 | 17.59 | 17.91 | 167.05 | 17.10 | 0.69 | 0.61 | 1.14 |
| 级分8 | 176.27 | 18.23 | 20.56 | 187.20 | 20.15 | 0.80 | 0.72 | 1.11 |
| 级分9 | 199.15 | 22.88 | 34.61 | 213.36 | 26.16 | 1.34 | 0.93 | 1.44 |
| 级分10 | 245.48 | 46.33 | 46.33 | 258.48 | 45.12 | 1.80 | 1.61 | 1.12 |
g.FL4/SS标度上的级分平均值，如图1B中给出。针对荧光的背景和补偿对这些值进行修正。
h.级分平均值之间的差值；hn＝gn-gn-1。单独地添加网织红细胞值。
i.级分平均值差值(h)与级分界限的同步(参见图1B)；in＝(hn+hn+1)/2。在级分1中，因h1的长度只有一半，故乘以2。网织红细胞级分不同步。
j.(b)的级分界限值，但针对荧光的背景和补偿对其进行了修正。作为网织红细胞的级分界限值，取平均值。
k.级分界限值之间的差值(级分大小)；kn＝jn-jn-1。单独地确定网织红细胞的级分大小。
l.将同步的级分平均值差值(i)除以(i)值的平均值，得到平均值为1的值。
m.将级分界限值(k)除以(k)值的平均值，得到平均值为1的值。
n.平均值在级分内的位置；l/m。
表2C参考；每个级分的导出的NGSP HbA1c百分比的计算以及与葡萄糖浓度值的比较。
| a | o | p | q | r | s | t | |
| 网织红细胞(R) | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分2 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分3 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分4 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分5 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分6 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分7 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分8 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分9 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 | |
| 级分10 | 1 | 0 | 0 | 1 | 5.30 | 106 |
表2C患者8；每个级分的导出的NGSP HbA1c百分比的计算以及与葡萄糖浓度值的比较。
o.参考平均值相对于样品级分的位置的计算；将(d)、(e)和(f)乘以参考的(n)并求和。
p.(o)-1。
q.平均值在级分内的位置相对于参考的修正位置的转换；将(q)绝对值的平方根乘以1或-1，具体取决于(q)的符号。将结果乘以常数；0.4。
r.(r)+1
s.每个级分的导出的NGPS HbA1c百分比值，其通过将(s)乘以样品的NGPS HbA1c百分比值得出。
t.将自我监测所确定的以mg/100ml表示的级分的葡萄糖浓度的平均值除以级分(t)的导出的HbA1c百分比值的平均值。将所得系数乘以每个级分的(t)值，得到与葡萄糖浓度值可比较的相对导出的HbA1c百分比值。
表2D参考；各级分的年龄的计算。
表2D患者8；各级分的年龄的计算。
| a | u | v | w | x | y | z | aa | ab | ac | ad |
| 网织红细胞(R) | 0.12 | 0.40 | 0.07 | 0.07 | 0.08 | 233 | 0.08 | 3.51 | 3.51 | |
| 级分1 | 0.34 | 1.18 | 0.20 | 0.14 | 0.14 | 3575 | 1.00 | 0.14 | 6.41 | 9.92 |
| 级分2 | 0.52 | 1.78 | 0.32 | 0.12 | 0.11 | 3625 | 1.01 | 0.11 | 5.10 | 15.01 |
| 级分3 | 0.69 | 2.39 | 0.45 | 0.13 | 0.13 | 3501 | 0.98 | 0.13 | 5.85 | 20.87 |
| 级分4 | 0.86 | 2.97 | 0.59 | 0.14 | 0.14 | 3666 | 1.02 | 0.15 | 6.82 | 27.69 |
| 级分5 | 1.01 | 3.47 | 0.72 | 0.13 | 0.12 | 3557 | 0.99 | 0.12 | 5.61 | 33.31 |
| 级分6 | 1.15 | 3.94 | 0.86 | 0.13 | 0.14 | 3592 | 1.00 | 0.14 | 6.32 | 39.63 |
| 级分7 | 1.28 | 4.39 | 0.99 | 0.14 | 0.13 | 3501 | 0.98 | 0.12 | 6.65 | 45.28 |
| 级分8 | 1.43 | 4.92 | 1.17 | 0.17 | 0.20 | 3623 | 1.01 | 0.20 | 9.19 | 54.47 |
| 级分9 | 1.63 | 5.61 | 1.41 | 0.25 | 0.22 | 3543 | 0.99 | 0.22 | 10.24 | 64.71 |
| 级分10 | 1.98 | 6.80 | 1.91 | 0.49 | 0.48 | 3723 | 1.04 | 0.49 | 22.84 | 87.55 |
u.除网织红细胞级分以外与列(j)中相同的级分界限值。在该级分中，取平均值。将每个级分的值(j)除以各级分的平均值。
v.将(u)的值乘以参考样品的IFCC HbA1c百分比(3.44％)
w.将公式XI应用于(v)的值；w＝e0.157*(v)-1
x.w的值之间的差值；x＝wn-wn-1。
y.将(x)的值除以级分的平均值的位置，后者是相对于参考的对应级分的平均值的位置(如列(s)中)而言的。
z.每个级分中的细胞事件的总数。
aa.将(z)除以十个级分的细胞事件数并乘以10。
ab.(y)*(aa)。
ac.将(ab)乘以通过最佳拟合确定的或如表E中给出的那样计算的寿命系数。在该表中，使用通过最佳拟合确定的寿命系数。
ad.(ac)的累积值；acn+acn-1，表示以天数计的级分的年龄。
表2E参考；寿命系数的计算。
| a | ae | af | ag | ah | ai | aj | ak | al | am |
| 5 | |||||||||
| 网织红细胞(R) | 6.43 | 5.38 | 6.12 | 10.55 | 40.92 | 1.00 | 1.00 | 64.64 | |
| 全部样品 | 1.05 | 0.88 | 40.80 |
表2E患者8；寿命系数的计算。
| a | ae | af | ag | ah | ai | aj | ak | al | am |
| 网织红细胞(R) | 8.39 | 7.30 | 7.93 | 18.17 | 37.60 | 0.94 | 0.90 | 81.10 | |
| 全部样品 | 1.09 | 0.92 | 40.00 |
ae.吖啶橙RNA染色；FL1(488nm)荧光值。
af.将网织红细胞(ae)减去细胞总数(ae)。
ag.将细胞总数(ae)减去FL1背景值(0.17)。
ah.将网织红细胞(af)除以细胞总数(ag)。
ai.将(ah)乘1.3次方。
aj.细胞血红蛋白含量；侧向散射值。
ak.将网织红细胞(aj)除以细胞总数(aj)。
al.将(ak)乘1.7次方。
am.将(ai)*(al)乘以常数值(6.10)。(am)表示寿命系数。
使用时间轴的参考值计算不同样品的时间轴。
假定葡萄糖HbA1c百分比速率的水平恒定及大约120天的寿命，以此假定为基础，确定参考样品的时间轴。然而无法直接计算如实例4中所述的患者样品的时间轴，这是由于葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率在这些患者中将不恒定。为了由患者样品计算时间轴，使用参考(时间模板)的HbA1c值的微分，因为其用于参考的最初时间轴的计算。
应用患者样品所固有的变量来修改样品的x轴。这些变量的选择很重要，这是由于它们不仅影响x轴上的时间，而且间接影响患者样品的葡萄糖依赖性HbA1c百分比值，原因在于x值构成葡萄糖依赖性HbA1c值的公式的一部分；d(y)/d(x)。如参考样品情形中所进行的那样由d(y)导出d(x)将得到平直线，这是参考样品情形的目的，而非患者样品情形的目的。影响x轴上的时间的变量是：1)如由计算机给出的每个级分中的细胞的数量，2)相对于理想模型而言患者样品中所呈现的细胞的数量，或如图1B(公式1)中给出的原始FL4/SS标度上的级分的长度的倒数，这也由计算机给出。
应用这些修正不会得到如上所述的平直线。级分内的平均值的位置已明确地排除在外，这是由于该位置确切地反映各级分之间的HbA1c速率水平的差异。如需演示说明；参见实例6。该操作还可以相反方式进行，不对样品时间模板就级分的长度的倒数进行修正，而是对级分内的平均值的位置(这可如实例6中所示的那样使用几何平均数计算)进行修正。实例5和表2中展示了修正系数1和2的应用。为了确认最新构建的时间轴与参考样品的时间轴最佳可比较，将坐标轴上的时间级分的总天数恢复到参考时间轴的115天总天数。
如实例7中所示，此时将患者样品的HbA1c百分比值的微分d(y)除以级分的最新计算的时间值d(x)。按如下方式进行图形表示：将d(x)/d(y)或葡萄糖依赖性HbA1c百分比值对级分时间值d(x)的积分(x)作图。
实例5
该实例描述了取自糖尿病患者的血样的分析以及各级分内的平均HbA1c值的位置。
方法和结果
如实例1和图1中所示，制备并分析非糖尿病和糖尿病全血样。收集每个成熟红细胞级分的FL4/SS级分界限值以及FL4/SS平均值。作为非糖尿病参考，使用六名正常受试者的数据，如实例3中所述。参考的级分的导出HbA1c百分比，作为年龄的函数，本意是平坦的，并且被赋予平均NGSP HbA1c百分比的常数值。
如实例3中展示的那样FL4/SS轴向时间轴的转换，仅可应用于其导出的HbA1c百分比值被认为恒定的血样。在血液葡萄糖浓度随时间推移而发生变化的糖尿病患者中，无法作出这种假设。就糖尿病患者而言，如FL4/SS轴上测量的级分的大小不仅是由该级分表示的年龄段的函数，而且是HbA1c百分比的可能变化的函数。
在一个级分中，以导出HbA1c百分比表达的HbA1c百分比的变化，与由算法计算的该级分内的平均FL4/SS值的位置具有关系。
如图1B中所示的曲线图中平均值在一个级分内的位置，由细胞的数量与细胞的FL4/SS值的乘积限定。平均值的位置是这样的位置：低于平均位置的这些乘积和高于平均位置的这些乘积是相等的。这意味着如图1B中所示的级分的表面被分成两个相等部分。糖尿病患者的细胞所经历的导出HbA1c值的偏高或偏低变化，将分别引起级分内的平均FL4/SS值偏高或偏低的重新定位。通过将平均值的值除以级分的大小，级分内的平均值的位置的每次移动都与细胞的年龄无关，因此可用于计算糖尿病患者的级分的导出的HbA1c百分比值。
使用样品的级分内的平均值的位置与参考的级分内的平均值的位置相比较，来直接计算患者样品的导出的HbA1c百分比。为了确保计算正确，必须考虑患者级分不具有与参考级分类似的大小。由于级分的平均值取决于级分界限在FL4/SS轴上的位置，在第一步中，确定样品级分相对于参考级分的重叠。相应的、前面的和后面的级分的这些重叠的计算在表2A中示出。叠加的级分由值1表示(列d、e和f)。考虑到如表2A中所示的重叠，计算了样品级分的平均值的相对位置。计算对重叠进行修正后样品位置与参考位置的商，如表2B列n中所示。值1表示两个位置的同一性(表2C、列o)。
为了比较患者与参考之间对应级分中平均值的相对位置，通过减去1而得到患者级分的平均值的偏差(表2C列p)。为了获得与级分相关的微分HbA1c百分比或葡萄糖浓度的线性关系式，必须应用两种另外的修正；首先，如上所述，如图1B中所描绘的平均值将级分分成具有相等表面的两个部分。平均值的位置因此取决于该表面，并取决于决定HbA1c百分比增加值的函数的积分。该增加值的函数未知，但可推测该函数应呈线性或接近线性。在这种情况下，平均值的偏差是导出的HbA1c百分比或葡萄糖浓度的平方的函数。相反，平均值的位置相对于参考的偏差与微分HbA1c值或葡萄糖浓度的平方根有关(表2C、列q)。上述计算提供了平均值的偏差与导出HbA1c百分比值的变化之间的关系式，从而在参考样品(据信已经历恒定葡萄糖浓度)与糖尿病患者样品之间进行比较。在对由患者管理的葡萄糖浓度的变化与导出HbA1c百分比的计算的变化进行仔细比较之后，将常数(表2C、列q)乘以该计算的最终结果，从而确认与葡萄糖浓度的最佳拟合。
由此获得的系数显示出HbA1c百分比的导数相对于参考的增加值或减小值。与样品的HbA1c百分比相乘，得到级分的导出HbA1c百分比值(表2C列r)。
如表2D中所示，在对每个级分中的细胞的确切数量进行修正后，时间段不与如实例3中那样给出120天寿命的系数相乘，而是与如实例7和表2E中所概述的寿命系数相乘，所计算的时间提供了级分的年龄。此时可构建级分的导出HbA1c百分比的时间曲线，并且与患者血浆中的所监测葡萄糖浓度进行比较(图6)。
在计算导出HbA1c年龄曲线时计入以下考虑因素。对于级分界限而言，使用以下修改。在最后级分N°10的区域中，细胞事件非常分散，还疑似有污染事件。因此，该级分界限由其平均值和之前的两个级分界限之差估算得出，如表2B中所示。
网织红细胞级分的RNA染色不同于成熟红细胞，被单独分析。只有少部分最成熟的网织红细胞在血液中循环。因此，网织红细胞级分的平均值将实际上与级分界限一起下降。为了计算时间轴，将平均值用作级分界限。然而，对于导出HbA1c百分比的计算而言，这将不允许测量级分内的平均值的变化。在这些网织红细胞的最高HbA1c值处选择级分界限得到了相对较高值，这是由于最高HbA1c的网织红细胞伸展很远。然而，该级分界限的选择看起来可用于测量HbA1c平均值的相对位置的变化(表2b、列k)。
平均值在级分内的相对位置是平均值除以级分大小。由于级分界限值比级分的平均值提前半个级分，将级分的平均值向前移动半个级分，以便级分界限值和级分平均值在时间标度上同步(表2B、列i)。
实例6
该实例显示了应用于糖尿病患者样品的最初时间标度的构建。
方法和结果
如实例1以及实例3和5中所述的那样得出和计算FL4/SS级分界限值。并不使用网织红细胞级分界限值，而是使用网织红细胞平均值。如实例3和5中所概述，网织红细胞级分界限值是虚高的，应当处于或接近级分值。针对FL1的补偿和背景，对级分界限值进行修正。
用于6名正常受试者的参考汇编的最初时间标度在图3c和3d中示出，并且如表1中所示的那样计算。该最初时间标度用作确定糖尿病患者的时间标度的模板，其中以与参考样品的级分类似的方式导出和计算级分。在参考样品与糖尿病患者样品之间比较，用于构建图1b的计算机数据。对以下两者进行比较：A，患者样品每个级分中的细胞的确切数量，与参考样品相应级分中的细胞的确切数量。将患者值除以参考值，并且将模板时间值除以根据细胞百分比与时间呈负相关的原则得出的系数(参见表2A，了解该计算)。比较患者样品与参考样品之间相应级分在FL4/SS轴上的级分长度。为此，通过减法运算来测量如图1b中所示的相邻截止值之间的距离(参见表2B)。对于相应级分而言，将患者值除以参考值，并且将模板时间值乘以所得的系数(参见表2C，了解该计算)。
上述修正系数不能应用于网织红细胞级分，后者须单独分析。然而在将网织红细胞的葡萄糖浓度与FL4/SS值进行比较的实验中，观察到归属于网织红细胞的时间与成熟细胞的第一级分的时间之间存在相关性。将参考样品的网织红细胞的时间与参考样品的第一级分的时间之比应用于患者样品。根据网织红细胞的血红蛋白含量进行第二次修正。血红蛋白的低水平与网织红细胞的缓慢成熟相关，因此必须通过除以下列系数来增加额外时间；(参考样品的网织红细胞细胞血红蛋白/患者样品的网织红细胞细胞血红蛋白)0.3(参见表2D，了解该计算)。
为了计算级分的年龄，以与实例3中给出的计算类似的方式应用时间计算。图4中给出了HbA1c百分比导数的变化将如何影响时间的计算。上述计算提供了HbA1c导数的变化系数(表2C、列r)，并且将时间段除以该系数。使用参考的平均HbA1c将患者样品的修正FL4/SS值归一化，并且代入公式(I)进行计算，如(表2D列w)中所示。
如图4中所概述，所得出的值对HbA1c百分比值的微分变化进行修正。图4提供了正常受试者的血液葡萄糖浓度短暂上升的效应的模拟的图形表示；(A)；如图3B中那样呈现并如实例3和表1中那样确定的正常受试者的HbA1c曲线；(B)；与(A)中一样，但存在血液葡萄糖浓度的短暂上升；(C)；与(B)中一样，但如实例5和表3中所述的那样确定。由于时间轴由HbA1c百分比值导出，在如以下4(a)所示的曲线图中，％HbA1c的短暂升高将影响％HbA1c轴以及时间轴4(b)。需要％HbA1c的独立参数，以便可修正时间并且可单独地确定％HbA1c，以给出正确表示4(c)。
所得到的时间标度被给定100天的长度，产生大约120天的寿命，如实例3、图3F中所示。
实例7
该实例示出了葡萄糖值与葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率的对准。
方法和结果
在构建患者样品的时间轴并计算葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率值之后，获得检验该程序有效性的统计数据。在相应患者的自我监测葡萄糖读数的日程表上规划患者样品的流式细胞术程序的时间点。
在图5中，示出了级分平均值在FL4/SS轴上及“计数”轴上的行为。在图5A中，区域A的表面等于表面区域B，这是由于“计数”值是累积的。如果级分的FL4/SS轴的中间被给定值1，则通过给出平均值(m)的位置；其中a和b是如图所示的相应截止值。在图5B中，FL4/SS值不是累积的。如图所示，只有当该曲线以指数方式升高或降低时，“计数”轴上的平均值(m)才会移位。如果级分的“计数”轴的中间被给定值1，则通过以下公式给出平均值(m)的位置；1+(反正切(级分的平均FL4/SS值的二阶导数))/3.14。
该实例显示，在每种情况下，级分内的平均值的位置与葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率一致地向上和向下移动。计算机在数值上计算平均值，并且按与上文用几何平均值计算的类似方式将平均值定位在级分中。针对患者样品的FL4/SS级分的长度对基本模板进行修正，将使平均值在级分内的位置保持原样，并且将生成与葡萄糖依赖性HbA1c速率相关的值。由于参考样品与患者样品之间的差异相对较小，已通过假定参考样品和患者样品的特定级分内的平均值的相应位置之间的线性关系来简化该计算。
在图3d中，示出了葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率在最初时间标度上的图形表示。这些值的计算在表2A和2B中示出，并且在表2B列k和l中给出。最初时间标度(表1；列k)由表1；列j计算。表1；列j和k在表2中作为“时间模板”和最初时间标度给出。对于如实例5中所述的每份样品而言，在对每个级分中的细胞的确切数量以及由每个级分代表的时间量进行修正之后，构建最初时间标度，如实例5中所述。每份样品的级分的时间总量与参考样品一样保持在115天。
表1；列i给出了参考样品的级分的HbA1c百分比值的微分(时间模板)。与参考样品类似，对每份患者样品计算这些微分。如表2E中对于一份患者样品所示，将HbA1c百分比值的微分除以经修正的最初时间标度的微分，并且对样品的总HbA1c百分比值进行修正，得出了最初时间标度上的葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率。为了如图3e中给出的那样给出时间标度上的葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率，使用实例3中所述的公式转换级分的时间值(如需了解该计算，参见表2F)。术语“实际时间标度”还无法用于患者样品，因为患者样品似乎显示出重要的寿命变化，有必要采取进一步修正措施。
然而直接比较所有患者的葡萄糖和葡萄糖依赖性HbA1c速率值会遇到葡萄糖与HbA1c之间低相关性的问题，如实例4和图5A中所示。为了更好地比较，将患者的总平均葡萄糖值除以由流式细胞术测定法所得出的总HbA1c值(表2C列t)。另外，需要针对归属于样品的120天寿命进行修正。基于导出的HbA1c百分比概况与葡萄糖监测概况之间的最佳拟合，来确定如表2D列ad中所应用的寿命系数。所得的独立寿命显示出患者之间的变化。在应用这两种调整之后，可在每个时间点附近的平均葡萄糖值与对应时间点的导出HbA1c百分比之间进行比较。所得的相关性具有0.8的R2(图5B)。图6中示出了个别比较。
结果的统计分析
如可在图6中看出，葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率与患者自我监测葡萄糖值之间存在随时间推移的良好一致性。在长时间搜索之后，通过比较得出的寿命系数似乎与归属于网织红细胞的参数相关，这提示了红细胞破坏与红细胞形成之间的反馈机制。寿命系数为网织红细胞的血红蛋白含量与RNA含量的乘积。
然而，如实例9中所示，只有在这两种数据对准之后，才可以对数据进行统计分析。葡萄糖水平与HbA1c形成的不一致性尚有争议(Hudson et al.Ann.Clin.Biochem.1999；vol.36,451-459(Hudson等人，《临床生化年鉴》，1999年；第36卷，第451-459页))。图5中所示的数据清楚显示了葡萄糖水平和HbA1c形成的以时间计的模式之间的预期相关性。只有绝对水平的相关性较差。原因可能是HbA1c反应/时间曲线在各个体之间有很大差异。血液中的氧化条件可产生晚期糖基化终产物的不同形成速率，如Makita,Z.et al Science1992,vol.258,pp 651-653(Makita,Z.等人，《科学》，1992年，第258卷，第651-653页)中所述。
在上述计算中，使用应用于时间轴的如下固定公式：
y＝x1.2
在各别情况下，指数值的变化进一步改善了葡萄糖水平随时间推移的模式与葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率随时间推移的模式的比较。用较高指数值拟合的模式将表明，HbA1c百分比值将比平均葡萄糖水平低。
平均细胞血红蛋白时间曲线。
该分析的级分中细胞年龄的确定提供了时间轴对所选红血细胞参数的应用。在上述分析中，确定了细胞年龄级分的平均细胞血红蛋白。在图9中，示出了这些平均细胞血红蛋白曲线。通常，血红蛋白在5或6天年龄的细胞中达到最大水平。如所报道，更老年龄的细胞丧失了血红蛋白(Gifford et al.,Br.J.Haematol.2006Nov；135(3):395-404(GiffordSC、Derganc J、Shevkoplyas SS、Yoshida T、Bitensky MW，《英国血液学杂志》，2006年11月，第135卷，第3期，第395-404页))。在患者样品中，发现了一些异常模式(患者7和患者10)。明显地，这些异常模式与HbA1c的高水平相关。
血液中所呈现的细胞的百分比。
图8中所示的模式给出了初始形成的细胞中有多少在血液中呈现的印象。该类型的示意图是时间量的关系式的结果，该时间量的关系式由级分表示并且是所呈现的细胞的百分比的倒数。对于该类型的曲线而言，没有限定所呈现的细胞的100％值的参考。因此该曲线的最高点被任意分配100％的值。
该曲线的形状高度依赖于该时间轴上的时间点的值。这些时间轴使用已应用于该时间轴的以下HbA1c反应/时间公式构建：
y＝x1.3
由于该指数可能受到如上所述患者之间的变化的影响，因此随该指数的此类变化，这些曲线的模式可能略有差异。
在所有情况下，这些曲线在该曲线的最后部分描述了细胞死亡，并且在该曲线的最开始部分描述了新形成的红细胞在血液中缓慢出现。众所周知，红细胞在成熟期间，从骨髓进入脾，然后再释放到血液中。然而还没有这需要多长时间的相关信息。根据我们的分析以及图8，红细胞释放至血液的过程，在各个体之间似乎存在高度变化。
实例8
该实例示出了患者样品的寿命系数的计算。
方法和结果
将实例6中所述和表2中计算的葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率和时间标度的图形表示，与实例4由患者自我监测所测量的登记葡萄糖值的图形表示进行比较。使用与葡萄糖值相关的日程表建立自我监测的葡萄糖值的时间标度。通过检查时间标度上的葡萄糖概况以及所计算的时间标度上的葡萄糖依赖性HbA1c值，可清楚看出这两种测量之间存在大量一致性。这两种模式之间的变化显然是由于患者样品的寿命的变化。如实例7中所示，对于每名患者而言，将所计算的时间标度的值乘以一个系数，该系数是变化的，直到获得这两种模式之间的最佳拟合。对于每名患者获得不同的系数，并且在这些系数与目前所知的患者不同参数之间寻找相关性。
发现网织红细胞的FL1值(RNA含量)函数与侧向散射值(血红蛋白含量)函数的乘积有最佳相关性(图7；R2＝0.9)(见表2E)。
患者中红血细胞的寿命的计算
如实例8中所述的模拟实验示出了红血细胞的寿命与归属于网织红细胞的参数之间的相关性。最开始，在样品的较老级分中寻找这些参数，但无法找到。在网织红细胞的成熟期间，RNA含量逐渐消失，同时血红蛋白含量上升达到最高值。在实例8中给出的RNA含量与血红蛋白含量乘积的函数中，逐渐降低的RNA和逐渐上升的血红蛋白将彼此平衡，并且该函数的值将在网织红细胞的成熟期间保持恒定。然而，如果RNA和血红蛋白两者都较低，这意味着在抽取血样时网织红细胞未能达到正常血红蛋白水平。根据实例8中的观察结果，可以推断出网状内皮系统中红细胞的破裂与网织红细胞中血红蛋白的合成之间存在联系。铁的循环利用可在这种反馈机制中起到主要作用。
实例9
该实例示出了血液中所呈现的细胞的时间曲线。
方法和结果
在构建患者样品的时间轴、计算葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率值以及应用患者的红细胞寿命值之后，获得统计数据以检验该程序的有效性。在相应患者的自我监测葡萄糖读数的日程表上规划患者样品的流式细胞术程序的时间点。对于一个时间点而言，收集到上一时间点的一半时间和到下一时间点的一半时间的葡萄糖读数值，并计算平均值。这样，对于用流式细胞术测定法得出的每名患者的每个时间点而言，可在葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率与血液葡萄糖浓度之间进行比较。但排除超出患者日程表的时间及没有可用计数器值的那些时间点。然而直接比较所有患者的葡萄糖和葡萄糖依赖性HbA1c速率值(图5A)会遇到葡萄糖与HbA1c之间低相关性的问题，如实例4和图4中所示。为了更好地比较，将患者的总平均葡萄糖值除以由流式细胞术测定法所得出的总HbA1c值。将所得的系数乘以分析的每个时间点的葡萄糖依赖性HbA1c百分比速率，从而允许更好地比较。所得的相关性具有0.8的R2(图5B)。图6中示出了个别比较。
根据公式VIII，通过对年龄级分的大小(表2D列ac)乘以每个级分中的细胞数(表2D列z)并取倒数，可以导出与理想模型中的细胞数相比在血液中可回收多少细胞，在该理想模型中，细胞立即出现于血液中并在完全相同的时间全部死亡。显示每名患者随时间推移的细胞百分比的示意图在图8中给出。每个系列中的最高值被用作100％参考点。
实例10
该实例示出了寿命和平均年龄的估计。
方法和结果
如图8中所示循环中的细胞的呈现允许将曲线外推到零值。该零值在时间轴上的点将反映血液中的最老细胞的年龄以及红血细胞的寿命。图8中所示的外推是曲线在级分10的值之后的延长部。该延长部与时间轴所成的角度占第9和第10级分之间的线段与时间轴所成的角度的一半。通过以下方式计算平均年龄：将每个级分中的细胞的数量乘以级分的年龄。将这些乘积之和除以该分析的红细胞的总数。表3汇总了图8和9中所述的参考样品和患者样品的估计寿命和平均年龄。
表3
实例11
该实例示出了平均细胞血红蛋白含量的时间曲线。
方法和结果
使用患者血液的年龄曲线的时间点，并且在葡萄糖依赖性HbA1c速率测定法中确认这些时间点之后，有可能构建平均细胞血红蛋白时间曲线。该研究的患者的时间曲线在图9中给出。
上述内容是对本公开的举例说明，而不应理解为是对本公开的限制。本公开由以下权利要求限定，权利要求的等同内容应被包括在其中。本文提到的所有参考文献和资料均据此以引用方式并入。
Claims (28)
1.一种用于确定血样中的红血细胞群体的年龄概况的方法，所述方法包括：
测量所述群体中每个所述独立红血细胞的血红蛋白和HbA1c含量；
利用每个所述独立红血细胞的所述HbA1c含量和所述血红蛋白含量来确定每个所述独立细胞中的所述HbA1c的百分比；
通过将所述独立细胞中的所述HbA1c的百分比与参考细胞级分的HbA1c的所述平均百分比相比较，来将所述红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；以及
确定每个级分中的HbA1c的所述平均百分比，并且通过将HbA1c的所述平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别所述级分中的所述红血细胞的年龄。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括与所述参考对照细胞的所述级分相比，确定所述样品中属于特定HbA1c百分比的级分的所述红血细胞的所述密度。
3.根据权利要求3所述的方法，其中所述参考对照细胞具有至少28天的平均年龄。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过侧向散射来测量每个独立红血细胞的所述血红蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中使用对HbA1c或其变体具有特异性的、可检测地标记的抗体来测量HbA1c。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体标记有荧光部分。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括测量所述独立细胞中的RNA含量，其中RNA的所述存在将所述细胞识别为网织红细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过结合于染料来测量RNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述染料是吖啶橙。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述参考细胞级分包含HbA1c百分比已知的细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括从每个级分收集数据，所述数据包括所述样品中红血细胞的确切数量、所述网织红细胞级分的所述平均HbA1c以及每个独立红血细胞以荧光和侧向散射单位计的每个级分的所述值。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中通过将所述HbA1c含量除以所述细胞血红蛋白含量，来确定每个独立细胞的HbA1c的所述百分比。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括确定所述红血细胞群体的所述年龄概况与所述参考细胞群体的年龄概况相比，是否包括更多数量的较老细胞，由此指示病情。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，还包括确定所述样品中的细胞的平均年龄，并且将所述平均年龄与正常对照样品的平均年龄相比较，其中所述平均年龄的差异指示疾病或疾病的所述状态。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，还包括确定所述样品中具有特定年龄的级分的所述平均细胞血红蛋白含量，并且确定不同年龄的级分中的所述平均细胞血红蛋白含量是否存在差异。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述差异指示贫血、出血或输血。
18.一种用于确定红血细胞群体的年龄的系统，包括：所述独立红血细胞的侧向散射和荧光的检测器；利用所述独立红血细胞在至少一个波长处所述测得的荧光及测得的侧向散射来得出百分比HbA1c含量的计算器；使用参考对照级分的HbA1c的所述平均百分比将所述红血细胞群体分成多个级分的分配器，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；每份样品的寿命系数的计算器；以及所述样品的所述级分的所述年龄的计算器。
19.根据权利要求18所述的系统，还包括所述样品的所述平均年龄的计算器，并且将所述样品的所述平均年龄与正常对照样品的所述平均年龄相比较。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的系统，还包括特定年龄的细胞的所述平均细胞血红蛋白的计算器，并且确定所述平均细胞血红蛋白是否会随所述细胞的所述年龄而变化。
21.一种包括非临时性计算机可读介质的系统，所述非临时性计算机可读介质具有用于执行包括以下的方法步骤的所述指令：确定样品中每个所述独立红血细胞的血红蛋白、HbA1c和RNA含量；利用每个所述独立红血细胞的所述HbA1c含量和所述血红蛋白含量来确定每个所述独立细胞中的HbA1c的所述百分比；通过将所述样品的所述独立细胞中的HbA1c的所述百分比与所述样品的参考细胞级分的HbA1c的所述平均百分比相比较，来将所述红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的所述平均百分比，并且通过将HbA1c的所述平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别所述级分中的所述红血细胞的所述年龄。
22.根据权利要求21所述的系统，还包括与平均年龄为28天的所述参考对照级分相比，确定所述样品中属于特定HbA1c百分比的级分的所述红血细胞的所述密度。
23.一种用于确定样品中的红血细胞群体的所述年龄概况的试剂盒，包含：a)特异性地结合HbA1C或其变体的抗体或其抗原结合片段；b)特异性地结合于RNA的染料；以及c)红血细胞参考对照样品。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述红血细胞参考对照级分具有已知百分比的HbA1C。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合片段被可检测地标记。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述标记物是荧光标记物。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的试剂盒，其中特异性地结合于RNA的所述染料是吖啶橙。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，还包括存储指令的非临时性计算机可读介质，所述指令在被计算装置执行时，致使所述计算装置：确定样品中的每个所述独立红血细胞的血红蛋白、HbA1c和RNA含量；利用每个所述独立红血细胞的所述HbA1c含量和所述血红蛋白含量来确定每个所述独立细胞中的HbA1c的百分比；通过将所述样品的所述独立细胞中的HbA1c的所述百分比与所述样品的参考细胞级分的HbA1c的所述平均百分比相比较，来将所述红血细胞群体分级成多个级分，每个级分包含基本上相等数量的红血细胞；确定每个级分中的HbA1c的所述平均百分比，并且通过将HbA1c的所述平均百分比与参考对照级分的HbA1c的平均百分比相比较，来识别所述级分中的所述红血细胞的所述年龄。
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