CN102177437A

CN102177437A - 用于逐一细胞分析的参考对照

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Publication number: CN102177437A
Application number: CN2009801405996A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·范阿格托万; 法布里斯·马莱格
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2008-08-13
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2029-07-24
Also published as: US7968279B2; EP2324350A4; US20100041011A1; ES2536739T3; USRE45617E1; EP2324350A1; EP2324350B1; WO2010019372A1; CN102177437B

Abstract

一种用于在流式细胞分析仪上逐一细胞分析的参考对照，其包含由被渗透的血细胞制成的细胞类似物和悬浮介质，所述血细胞内含有被聚集的胞内蛋白质和被保留的该胞内蛋白质的抗原位点，具有可渗透抗体的细胞膜。参考对照在被制备后可被冷冻并在使用前解冻。细胞类似物在其内进一步包含荧光标记物。还公开了一种制备参考对照的方法和一种使用参考对照的方法，其作为内部对照或者独立对照用于测定血样中的细胞血红蛋白和细胞血红蛋白变体。

Description

用于逐一细胞分析的参考对照

技术领域

本发明涉及含有由被渗透的血细胞制成的细胞类似物的参考对照，所述被渗透的血细胞含有聚集的胞内蛋白质和被保留的抗原位点，还涉及制备所述参考对照的方法、以及通过在流式细胞分析仪上在细胞成分的逐一细胞测定中使用该参考对照的方法。

背景技术

在逐一细胞试验中，细胞成分的定量测定通常是在细胞计数器上或者血液学分析仪上进行的。通过使用特定的试剂和程序来制备血样，并且通过利用在这些分析仪上测量的光散射和荧光信号来确定细胞成分的存在。许多物理或化学的因素会影响细胞中存在的靶细胞成分的比例和测定分析仪上的信号输出。没有合适的对照或参照，很难获得精确的细胞成分定量测定。参考对照可以作为外部对照被包括在一系列样品的测定中，或者参考对照可以作为内部对照被添加进每一个要测定的样品中。在后一情况中，分析仪必须能区分参考对照的细胞成分和所测定的样品中的血细胞的细胞成分。

参考对照可以包含一种合成的颗粒，比如一种覆盖着已知含量靶细胞成分的乳胶珠子。其它参考对照可包含被稳定化的血细胞，所述血细胞具有已知量的靶细胞成分并且在较低的非冷冻温度下在给定的一段时间内是稳定的。

只要信号的变化不仅是由于测定仪器固有的误差造成的，而且是由于用于测定的样品制品的不同造成的，则优选参考对照的颗粒的表现类似于在样品制备条件下的样品中的血细胞。在这一方面，稳定化的血细胞优于合成的粒子。然而，在制备对照细胞的过程中或者在非冷冻温度下的保藏期间，细胞成分或者细胞成分的抗原特性常常会恶化。

冷冻细胞和在超低温下保藏将克服对照细胞随着时间的过去而降解的问题。然而，细胞内冰晶会损害细胞膜，并且要采取特别预防措施，比如在冻融循环中采取添加保护性试剂例如甘油或者二甲亚砜的方法来保护细胞。即使细胞未损坏，然而被处理的细胞在冻融循环后常常呈现大量的变化，这将影响随后的测定。此外，保护性试剂也会干扰将要进行的试验。

因此，理想的是被用于参考对照的细胞具有与被测定的血细胞相当的细胞形态，并且具有被保留的细胞成分和被保留的待测定的细胞成分的抗原，并且参考对照的细胞可以经受冻融循环且细胞形态和细胞成分抗原没有恶化。

此外，虽然所关注的具有已知参数值的参考对照可用于校正组间分析误差(inter assay variability)，但是理想的是用含有呈标记形式的内部对照来校正组内分析误差(intra assay variability)以及组间分析误差。参考对照中的细胞标记使得测定仪器可以区分待测定的样品中的细胞和被添加至样品中的对照细胞，并且使用这些被标记的细胞作为测定过程的内部对照。

此外，在使用抗体或者其它分子探针测定细胞内成分的逐一细胞试验中，必需渗透细胞膜，以便抗体或者其它分子探针可以穿透细胞膜。对于这样的试验，理想的是使用的参考对照含有细胞膜已经被渗透的细胞，该细胞膜允许大的探针例如抗体穿透。

美国专利号4,777,139(Wong等人)教导一种具有增强稳定性的红细胞成分的血液学对照。Wong等人教导，在足以增加细胞稳定性且不损害溶解试剂溶解细胞能力的条件下，将洗涤后的红细胞暴露于不饱和的醛例如丙烯醛(丙烯醛)。在处理后，洗涤被处理的细胞，并且细胞被悬浮在一种稳定化悬浮液介质中。参考对照在低的非冷冻温度下保藏。这些被稳定化的细胞的膜没有被渗透。

红细胞中的细胞血红蛋白是一种用于临床诊断的重要参数。在大多数血液学分析仪上，通过溶解试剂溶解血样的红细胞，并且通过使用分光光度法来测定被释放的血红蛋白分子形成的色原，获得血样的总血红蛋白浓度。血样的红细胞平均血红蛋白(MCH)来源于红细胞(RBC)数目和血样的总血红蛋白浓度。平均红细胞血红蛋白量是所有红细胞的平均测定值，它不表示单个红细胞的血红蛋白含量。

相反，在流式细胞仪上细胞血红蛋白的测定是逐一细胞的测定，提供的诊断信息是通过平均红细胞血红蛋白量得不到的。Campbell等人(Cytometry 35，pp 242-248(1999))使用荧光抗血红蛋白A的抗体进行单个红细胞中的血红蛋白的流式细胞分析。Burshteyn等人(美国专利申请公布号2004/0214243)使用抗pan血红蛋白抗体进行流式细胞分析。因为红细胞具有高浓度血红蛋白，为了使用抗体测定总细胞血红蛋白，需要大量荧光标记的抗体。此外，由于抗体结合位阻，存在可能的假象；或者由于细胞中的高密度血红蛋白，存在可能的荧光消失的情况。因此，理想的是具有一种能够测定总的细胞血红蛋白且不依赖于使用抗体的方法。

识别和/或定量血红蛋白的变体和异常形式对于不同的疾病比如镰刀形红细胞贫血病、地中海贫血和糖尿病的临床诊断是重要的。血红蛋白A_1C的测定已经是最频繁使用的血红蛋白变体测定法中的一种，并且是用于糖尿病病人的一项重要的临床测定。

已知大约90％的总的血红蛋白是非糖基化的。非糖基化血红蛋白的主要部分是非糖基化HbA，称为HbA0。糖化血红蛋白指的是通过添加不同的糖类至血红蛋白分子而形成的一系列较少的血红蛋白成分。对于葡萄糖而言，人红血球是可以自由渗透的。每个红细胞内，糖化血红蛋白以与周围葡萄糖浓度成正比例的速度形成。葡萄糖和血红蛋白的反应是无酶催化的、不可逆转的和缓慢的，以致于在红细胞生存期间(120天)仅有总血红蛋白的一小部分被糖化。因此，被糖化的血红蛋白的测定可提供一种加权的“移动性的”血糖平均水平，可用于长期监控血糖水平，提供了在头2至3个月内的血糖浓度平均值指数。这个最重要的临床应用是用于糖尿病病人中糖血控制的评定。

血红蛋白A1c(HbA1c)是糖化血红蛋白的一种具体类型，并且是与糖尿病相关的最重要的血红蛋白类型。HbA1c占非糖尿病血红蛋白总量的约3至6％，占糖尿病血红蛋白总量的20％或者更高，即控制不佳(Goldstein等人，CHn.Chem.32：B64-B70，1986)。HbA1c浓度的测定在诊断和监控糖尿病中是很有用的。

在最近几十年，已经开发了一些标准HbA1c测定法。一种测定HbA1c的标准方法使用离子交换高压液相色谱(HPLC)，基于电荷密度差异，分离并分析血红蛋白HbA0和Hb_A1c及其他较少的血红蛋白成分。另一种色谱分离法是硼酸盐亲合层析，使用一种含固定化的硼酸的凝胶基质来捕获糖化血红蛋白的顺式二醇基。在这些方法中，血样首先利用溶解试剂溶解，然后形成的溶血液(hemolysate)被用于色谱分离分析。

进一步的HbA1c测定法是基于免疫比浊法。在此方法中，血样首先利用溶解试剂溶解，然后形成的溶血液被用于两个分开的测定。通过一种比色法测定总血红蛋白浓度。使用浊度免疫抑制法测定HbA1c浓度，其中试剂中的HbA1c抗体结合样品的HbA1c从而形成可溶的抗原-抗体复合物。然后来自试剂的多半抗原结合多余抗体，并且生成的凝集的复合物通过浊度法测定。样品混合物的混浊度与样品中的HbA1c浓度成反比。使用血红蛋白总量和HbA1c浓度计算样品HbA1c的百分比。

这些标准的HbA1c测定法是总血红蛋白平均浓度和由样品中所有溶解红细胞获得的溶血液的HbA1c百分比的整体分析，所述样品包含成熟红细胞和网织红细胞。这个结果只能被用作在头2至3个月内的血糖浓度平均值指数，它并不代表单个红细胞的细胞HbA1c百分比，并且没有提供成熟红细胞和未成熟的红细胞之间的HbA1c百分比的信息。因此，这些标准方法没有提供病人对医学治疗的反应的及时信息。

许多HbA1c对照是可商业性购买的。大多数这些对照呈冻干蛋白质粉末或者溶血后的液体溶液的形式，被用于上述方法中。

最近，美国专利号7,361,563(Ryan等人)教导了用于糖化血红蛋白HbA1c测定的细胞对照，其适用于离子交换或者亲和层析和如上所述的免疫学检测。Ryan等人教导了一种制备参考对照的方法，包括：洗涤血样；从红细胞中除去白细胞和血小板；利用戊二醛固定红细胞；利用一种含葡萄糖、氟化钠和大豆胰蛋白酶抑制剂的稳定化稀释剂洗涤并悬浮被固定的红细胞。Ryan等人教导这个参考对照在300天6℃下是稳定的，并显示出其在一些利用离子交换HPLC、硼酸盐亲合层析或者免疫比浊法的临床化学分析仪上的实用性。如上所述，使用这些方法，Ryan等人的被稳定化的红细胞首先被溶解，然后测定来自对照的所有红细胞的总血红蛋白和总HbA1c浓度。Ryan等人没有教导渗透被固定的红细胞的细胞膜使得它们可渗透抗体，用于在流式细胞仪上逐一细胞的免疫测定。

基于以上所述，因此理想的是提供一种包含细胞类似物的参考对照用于在流式细胞仪上逐一分析HbA1c、其它血红蛋白变体或者其它细胞成分，该细胞类似物具有被渗透的细胞膜。还期望的是具有一种参考对照，其中细胞类似物中的总细胞血红蛋白可以在一步中与血红蛋白变体一起被测定。进一步地理想的是具有一种含被标记的细胞类似物的参考对照，以便可以通过使用常用的检测装置来容易地识别并区分类似物和待测定的血细胞。并且，理想的是具有一种可以被冷冻和解冻的用于长期保藏的参考对照，同时保持待测定的细胞类似物的细胞成分，比如保持蛋白质抗原的位点。此外，还期望一种具有抗冻融处理且不使用可能干扰要进行的试验的保护性试剂的参考对照。

发明内容

在一个方面，本发明的目的是提供一种用于在流式细胞分析仪上逐一细胞分析的参考对照。该参照对照包含由被渗透的血细液胞制成的细胞类似物和悬浮介质，所述血细胞中含有被聚集的胞内蛋白质和一个以上被保留的胞内蛋白质的抗原位点，具有可渗透抗体的细胞膜。该参照对照在制备后可被冷冻，并在使用前被解冻。所述细胞类似物在解冻后保持被保留的抗原位点。

在一个实施方式中，该参考对照包含被标记的细胞类似物，所述细胞类似物含有与被处理的血细胞的细胞成分相结合的细胞标记物。在一个特定的实施方式中，所述细胞类似物是由含有被保留的一种以上血红蛋白变体的抗原位点的红细胞所制成的红细胞类似物。

在另一个方面，本发明的目的是提供一种制备本发明的参考对照的方法。该方法包括：将渗透试剂和血细胞混合，并且温育所形成的渗透混合物足够长的一段时间，以便引起所述血细胞内的胞内蛋白质的聚集并同时保留它的抗原位点，并使所述细胞膜可渗透抗体；向所述渗透混合物中添加中和试剂来抑制渗透剂的进一步反应；用洗涤液洗涤被渗透的血细胞，以便除去渗透剂和中和试剂；以及在保藏溶液中悬浮被渗透的血细胞，以便形成参考对照。优选地，参照对照可被冷冻用于保藏，并且在使用前被解冻。

在进一步的方面，本发明的目的是提供一种通过使用本发明的参考对照在流式细胞分析仪上进行细胞成分的逐一细胞测定的方法。在一个实施方式中，该方法的目的是使用参考对照用于在流式细胞分析仪上进行血样的细胞血红蛋白测定。该方法包括：提供一种含有红细胞类似物的参考对照，所述红细胞类似物由被处理的其内含有被聚集的胞内蛋白质的红细胞制成，所述参考对照具有平均细胞血红蛋白参考值；在流式细胞分析仪上逐一细胞地测定所述参考对照中红细胞类似物的侧向角散射信号；以及使用测得的侧向角散射信号和所述参考对照的参考值来确定待测定样品中单个红细胞的细胞血红蛋白。

该方法可以进一步包括：将所述参考对照与渗透试剂混合；随后添加含有对所述血红蛋白变体具有特异性的荧光标记抗体的中和试剂，并使所述抗体与所述红细胞类似物内的所述血红蛋白变体结合；逐一细胞地测定所述参考对照中所述红细胞类似物的荧光信号，一并测定侧向角散射信号；以及使用测得的荧光信号和测得的侧向角散射信号、以及所述参考对照中血红蛋白变体的参考百分比值来确定待测定样品中单个红细胞的所述血红蛋白变体。所述血红蛋白变体包含糖化血红蛋白、胎儿血红蛋白或者异常形式的血红蛋白。

在进一步的实施方式中，该方法的目的在于使用一种被标记的参考对照用于在流式细胞分析仪上测定血样中的细胞血红蛋白。该方法包括：将一定量的血液与渗透试剂混合以便形成第一样品混合物；添加含有红细胞类似物并具有细胞血红蛋白参考值的参考对照至所述第一样品混合物中，所述红细胞类似物由被处理的其中含聚集的胞内蛋白质和被保留的血红蛋白变体的抗原位点的红细胞制成，并且所述被处理的红细胞具有可渗透抗体的细胞膜，所述红细胞类似物包含与细胞蛋白质结合的荧光染料；随后添加中和试剂以便形成第二样品混合物；在所述流式细胞分析仪上逐一细胞地测定所述血液中的所述红细胞和所述参考对照中的所述红细胞类似物的侧向角散射信号和第一波长处的荧光信号；使用在所述第一波长处测得的荧光信号，将所述血液中的所述红细胞和所述参考对照中的所述红细胞类似物区分开来；以及使用测得的所述红细胞和所述红细胞类似物的侧向角散射信号、以及所述参考对照的所述细胞血红蛋白参考值，来确定所述红细胞的细胞血红蛋白。

该方法进一步包括：在所述血液与所述渗透试剂混合之前，将所述血液与核酸染料混合以便染色RNA；通过使用在所述第一波长处的所述荧光信号，将网织红细胞与所述血液中的成熟红细胞以及与所述红细胞类似物区分开来；以及使用所述侧向角散射信号和所述参考对照的所述细胞血红蛋白参考值，来确定所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的细胞血红蛋白。

此外，中和试剂可以进一步包含一种对所述血红蛋白变体特异的荧光标记抗体。该方法进一步包括：温育所述第二样品混合物，使得所述被标记的抗体与所述血液的所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的、以及所述参考对照的所述红细胞类似物中的所述血红蛋白变体相结合；逐一细胞地测定所述血液中的所述网织红细胞和所述成熟红细胞以及所述参考对照中的所述红细胞类似物在第二波长处的荧光信号，一并测定所述侧向角散射信号和在第一波长处的所述荧光信号；以及使用在所述第二波长处的荧光信号和所述侧向角散射信号、以及所述参考对照的所述血红蛋白变体百分比的参考值，分别确定所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的所述血红蛋白变体的细胞百分比。

本发明的优点可以从下面显示本发明典型实施方式的说明书、连同附图中体现出来。

附图说明

图1A、1B和1C显示了含被标记的参考对照的正常血样的前向角散射对侧向角散射、前向角散射对FL1、和FL1对FL4的散点图，该参考对照包含如实施例3描述的由糖尿病病人的血样制成的红细胞类似物。在这三个散点图中，所有的轴都是对数刻度。

图2A和图2B分别显示了正常人血样(A)和内部对照(B)中红细胞的侧向角散射平均值和FL4平均值，在参考对照解冻后的不同时期获得，如实施例4所描述。

图3显示了随着用于测定FL4信号的PMT的电压变化的HbA1c百分比变化，和通过使用本发明的参考对照所达到的校正效果。

图4显示了随着重新配制的血样中红细胞浓度的变化的HbA1c百分比变化，和通过使用本发明的参考对照所达到的校正效果。

图5A和5B显示了分别在数学转换前后通过本方法获得的HbA1c百分比与通过来自于参考实验室的标准方法所报导的结果之间的相关性，如同实施例7所述。

图6A至6F分别显示了在没有和有使用内部对照的情况下，通过使用本方法获得的HbA1c百分比与通过来自于参考实验室的标准方法所报导的结果之间的相关性，如同实施例8所述。

具体实施方式

一方面，本发明提供了一种包含细胞类似物的参考对照及其制备方法，该参考对照用于在流式细胞分析仪上进行逐一细胞分析。

在一个实施方式中，该参考对照包含由被渗透的血细胞制成的细胞类似物和悬浮介质，所述血细胞中含有被聚集的胞内蛋白质和一个以上被保留的该胞内蛋白质的抗原位点，并具有可渗透一种以上抗体的细胞膜。该参考对照在制备后可被冷冻，并在使用前被解冻。

在一个特殊的实施方式中，该参考对照包含由被渗透的红细胞制成的红细胞类似物，所述红细胞中含有被聚集的胞内蛋白质和一个以上被保留的血红蛋白变体的抗原位点，并具有可渗透对血红蛋白变体的抗原位点特异的一种以上抗体的细胞膜。

现在具体描述本发明制备参考对照的方法。在一个实施方式中，本方法包含以下处理步骤：(a)将渗透试剂和血细胞混合，并且温育所形成的渗透混合物足够长的一段时间，以便引起所述血细胞内的胞内蛋白质的聚集，同时保留它的抗原位点，并使所述细胞膜可渗透抗体；(b)向所述渗透混合物中添加中和试剂来抑制渗透剂的进一步反应；(c)用洗涤液洗涤被渗透的血细胞，以便除去渗透剂和中和试剂；以及(d)在保藏溶液中悬浮被渗透的血细胞，从而形成呈类似物悬浮液形式的参考对照。

为长时间保藏，参考对照在制备后可被冷冻，在运送过程中仍保持冷冻，正如下文所进一步描述的那样。参考对照在使用前能被使用者在室温下自然地解冻。参考对照可以被用作在流式细胞分析仪上进行逐一细胞分析的内部或外部对照，正如下文所描述的那样。

血液细胞有代表性地由合适个体的外周血液中(也称为全血)收集，所述个体包括，但不限于，哺乳动物、鸟类或爬行动物。为测定特殊的临床病情的目的，血液优选从人类收集，包括正常的个体和已经被诊断为所关注的特殊临床病情的病人，因此，所关注的细胞成分如抗原是存在的或增加的。例如，为制备用于测定HbA1c的参考对照，血液能够从被诊断为糖尿病的病人处收集。对于用于测定镰状细胞性贫血或地中海贫血的参考对照，血液能够从患有各自疾病的病人处收集。在其他情况下，血液能够从具有异常低含量的所关注细胞成分的个体处收集。

血液被收集至包含抗凝血剂的容器中。乙二胺四乙酸(EDTA)或其他通常使用的抗凝血剂，如肝素和柠檬酸钠能被使用。血液在被处理前能在4℃温度下保藏，优选保藏不超过3天。

在与渗透试剂混合前，所关注的血细胞能够通过使用本领域已知的技术例如离心、透析或其他合适的方法进行分离。例如，当制备白细胞类似物时，白细胞能够在全血离心后通过分离血沉棕黄层(buffy coat)而与红细胞分离。然而，当通过使用上述方法制备红细胞类似物用于细胞血红蛋白测定时，发现白血细胞和血小板不需要被从红血细胞中去除，因为在逐一细胞分析中，通过使用光散射和/或荧光测定，血小板和白血细胞能够与红细胞类似物区分开来。

实施例2描述了通过上文所描述的本发明方法，使用全血制备被标记的红细胞类似物的示例性方法。应当注意，参考对照的制备特别被描述在制备被标记的红细胞类似物的方法中，该方法将在后面更详细地被描述，然而，除了与标记相关的步骤外，该方法能被用于制备不做标记的细胞类似物。还应当注意的是，当制备无荧光标记的细胞类似物时，血细胞不需要被洗涤，并且全血能够直接用于制备参考对照。此外，该方法也能用于制备其他细胞类似物，如白血细胞，或特殊的白血细胞亚群。

为测定细胞血红蛋白的目的，优选被标记的红血细胞在用渗透试剂处理之前也可被暴露于球形化剂，以便球形化红细胞。应当注意，球形化步骤是可选的。而且，当制备白血类似物时，不需要该步骤。

此处使用的渗透试剂也被称为细胞透化和稳定化试剂，U.S.20060178294 A1中描述了它在渗透细胞膜和保留细胞成分中的功能，用于流式细胞仪测定，其全部内容并入此文以供参考。

在一个实施方式中，渗透试剂是包含下述分子结构式表示的N-酰基肌氨酸或其盐的水溶液：R₁-CO-N(CH₃)CH₂COOX₁其中R₁是具有8-18个碳原子的烷基或亚烷基，X₁是H、Na⁺或K⁺，和一种以上用以调节试剂pH值至少于7的pH调节剂。渗透试剂优选pH范围是大约4到6的微酸性试剂。更优选试剂的pH值是大约4.6至5.6。

pH调节剂优选强碱性或强酸性，因此，小剂量的化合物可以用于调节pH在所需要的范围内。在一个优选的实施方式中，使用N-酰基肌氨酸游离酸，并且使用吡咯烷(强有机碱)或者氢氧化钠(强无机碱)来调节pH值在4到6之间。若使用N-酰基肌氨酸盐，则可以使用强酸如HCl来调节pH值。另外，可以使用有机缓冲液来维持pH。在一个典型的实施方式中，使用pK_a1是4.19并且pK_a2是5.57的琥珀酸。

渗透试剂具有电导率限定为小于9.0mS/cm的低离子强度。研究发现，将细胞暴露于渗透试剂时，胞内蛋白的聚集在低离子强度下更加有效。为本发明的目的，通过试剂电导率来定量含水试剂组合物所需要的离子强度。人们认为胞内蛋白聚集对于渗透后维持细胞完整性是必须的。当渗透试剂的离子强度太高时，例如当试剂电导率是9mS/cm以上时，试剂不再能够聚集胞内蛋白，细胞会失去它们的完整性。优选渗透试剂的电导率小于3.0mS/cm，最好小于1.2mS/cm。因为离子化合物，例如盐，是水溶液离子强度的主要贡献者，因此渗透试剂优选低盐浓度。

游离酸形式的N-酰基肌氨酸及其盐是市场上可买到的。优选使用不会将金属离子带入渗透试剂中的游离酸形式。游离酸形式的N-酰基肌氨酸不是水溶性的，它能够预先溶解在酒精溶液中，然后被加入到水溶液中。当渗透试剂的pH值用碱调节到4到6之间时，作为pH调节剂，N-酰基肌氨酸游离酸可以被溶解且以溶液中阴离子的形式存在。

N-酰基肌氨酸合适的例子包括N-油酰肌氨酸，N-硬脂酰肌氨酸，N-月桂酰肌氨酸，N-肉豆蔻酰肌氨酸，N-椰油酰肌氨酸和它们的盐。R₁烷基或亚烷基优选具有12个碳原子。在一个更优选的实施方式中，使用N-月桂酰肌氨酸。

渗透试剂N-酰基肌氨酸及其盐的用量足以渗透细胞膜，足以允许胞内标记物穿透被渗透的膜，同时基本上保留细胞膜结构和细胞成分，用于与其细胞标记物特异性地结合，用于通过流式细胞术的逐一细胞分析。研究发现，N-酰基肌氨酸的浓度可以在大约0.01mM至大约100mM的范围，优选大约0.1mM至大约10mM的范围，更优选大约1mM至大约5mM的范围。

可以选择的，渗透试剂进一步包含下述分子结构式表示的阴离子表面活性剂：R₂-O-SO₃X₂其中R₂是具有8到18个碳原子的烷基或亚烷基；X₂是Na⁺、K⁺、NH⁴⁺或者NH₂C(CH₂OH)₃(即，三羟甲基氨基甲烷)。优选阴离子表面活性剂中的R₂烷基或亚烷基具有12个碳原子。合适的例子包括钠、钾、铵和三羟甲基氨基甲烷十二烷基硫酸盐。在一个更优选的实施方式中，使用三羟甲基氨基甲烷十二烷基硫酸盐，即下文所称的Tris十二烷基硫酸盐。烷基或亚烷基硫酸盐可以在大约0.01mM至大约5mM的范围内，优选大约0.05mM至大约2mM的范围内。

此外，渗透试剂优选还包含一种以上有机渗透压调节剂。渗透压调节剂的合适的例子包括，但不限于，糖、乙二醇、二甲亚砜或甘油。优选使用糖或甘油。糖可以是多糖如双糖、或单糖。在如实施例1所示的典型的实施方式中，使用了蔗糖。在存在有机渗透压调节剂的情况下，虽然渗透试剂具有非常低的离子强度，但它仅仅是低渗的，并具有大约240至大约280mOsm/kg水的渗透压浓度。

可选择地，渗透试剂进一步包括血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)。血清白蛋白增强了水溶液中表面活性剂的溶解度，且有利于渗透试剂的长期使用和保藏。

此外，渗透试剂可进一步包含一种以上防腐剂。合适的例子包括抗菌剂和抗氧化剂，用以延长渗透试剂保质期。防腐剂以一定数量存在不会影响渗透试剂的功能。在一个实施方式中，5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮被作为抗菌剂使用。由罗门哈斯公司(费城，宾夕法尼亚州)制备的商品名为Proclin

150和Proclin

300的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的组合物是可以买到的。实施例1显示了本发明的渗透试剂的示例性组合物。

优选以试剂对血液为大约100∶1或以上的比例混合血液和渗透试剂。形成的渗透混合物被温育足以允许渗透试剂与细胞反应的一段时期。温育时间优选大约1分钟至10分钟，更优选大约2分钟至大约5分钟。

已经发现，当混合了血细胞时，渗透试剂能有效地渗透细胞膜至一定程度，以允许大分子胞内标记物比如抗体渗透入细胞以便与胞内成分相结合用于进行随后的测定。渗透试剂导致胞内蛋白质在细胞内聚集，同时保留了细胞成分，如胞内和细胞表面的抗原位点、DNA和RNA分子以及细胞骨架成分，用于随后的逐一细胞分析。此外，在渗透处理期间，红细胞也可被渗透试剂球形化，使得可以通过光散射测定法来测定红细胞，而不会有因不同的细胞形状和朝向造成的不良影响。

为本发明的目的，术语“细胞成分”或“细胞组成”包括细胞内的、细胞膜表面上的细胞成分，例如细胞表面抗原位点。而术语“胞内成分”或“胞内组成”指的是细胞内的细胞成分，包括，但不限于胞内蛋白质，如红细胞内的血红蛋白和血红蛋白变体、细胞骨架成分、DNA和RNA。细胞骨架成分包括但不限于微管蛋白和血影蛋白。此处使用的术语“细胞标记物”包括，但不限于：对于胞内蛋白质抗原位点、细胞表面抗原位点或细胞骨架成分有特异性的抗体；染料如核酸染料或对细胞蛋白质有特异性的染料；和对DNA或RNA分子有特异性的核酸探针，如寡聚核苷酸探测剂。细胞标记物优选是荧光性的或是用荧光染料标记的。此外，对胞内成分特异的细胞标记物指的是胞内标记物。

如U.S.2006/0178294 A1中所描述的，渗透试剂引起由全血制备的血清部分、可溶性细胞部分(胞液)和膜部分的沉淀。尤其是在可溶性细胞部分中，通过样品混合物光密度的大量增长证明，因为血红蛋白的存在，在与渗透试剂反应后发生了强力聚集和沉淀。如U.S.2007/0020612 A1中所进一步描述的，在被暴露于渗透试剂的全血样品中，红细胞侧向角散散信号的大量增长反映了血细胞的胞内蛋白质聚集。然而，另一方面，正如U.S.2006/0178294 A1所进一步显示的，被渗透的血细胞维持了它们的抗原位点和抗体结合特异性，例如，红细胞和淋巴细胞的微管蛋白与抗微管蛋白-FITC抗体的结合、胎儿血红蛋白和抗HbF-FITC的结合、胎儿红细胞和胞外标记抗i-藻红蛋白(PE)的结合。

正如上述描述的，在暴露于渗透试剂后，中和试剂被加入渗透混合物中以抑制渗透试剂的进一步反应。中和试剂是高渗性的，并具有7或稍微高一些的pH值。当与渗透混合物混合后，中和试剂将混合物的pH值调至中性并增加了混合物的离子强度。同样地，它有效地抑制了渗透试剂的进一步反应。人们认为与渗透试剂的过度反应能导致过度紧密的胞内蛋白质聚集，这导致了蛋白质的抗原位点的掩蔽并影响它们与胞内标记物的结合。通过渗透试剂处理血细胞的程度可以被上述的温育时间和中和试剂的有效抑制所控制。

中和试剂包含渗透压调节剂和缓冲液。渗透压调节剂优选一种以上的碱金属盐，优选碱金属卤化物，如钠或氯化钾。中性试剂的渗透压度优选大约800至大约1200mOsm/kg水。缓冲液可以是提供中性pH值的有机缓冲液或无机缓冲液。中性试剂的pH值优选大约7.0至7.5，更优选大约7.1至大约7.4。

此外，中和试剂可进一步包含血清白蛋白，如牛血清白蛋白。血清白蛋白，尤其是高浓度的血清白蛋白，能提供表面活性剂的竞争性结合并抑制表面活性剂在细胞上的作用。因此，血清白蛋白有助于保持细胞成分的完整，所述细胞成分尤其是胞内抗原位点，如与各自抗体结合的糖化血红蛋白(HbA1c)的或者胎儿血红蛋白(HbF)的抗原位点。血清白蛋白浓度优选大约0.4至大约1.2mM。并且，中和试剂可进一步包含抗菌剂。在一个典型的实施方式中，使用叠氮化钠。叠氮化钠是强抗菌剂，该强抗菌剂尤其适合中和试剂，因为它有中性pH值并具有高浓度的牛血清白蛋白。实施例1描述了中和试剂的典型组合物。

优选实施例1所示的中和试剂与渗透试剂的使用比例为大约0.3至0.8。在添加中性试剂后，形成的中和混合物进一步被温育一段时间，以便有效地抑制渗透试剂的反应。该温育时间优选大约5分钟至大约30分钟，更优选大约8分钟至大约12分钟。

中和后，被处理的血细胞(也称为被渗透的血细胞)，或形成的细胞类似物是稳定的，且细胞混合物可以被冷冻储存。然而，中性混合物包含盐、缓冲液和牛血清白蛋白，可以干扰随后将要进行的试验。因此，从细胞类似物中除去中和混合物的介质，并且用洗涤溶液洗涤细胞类似物。

优选使用温和的离心来改变介质。正如实施例2中所显示的，包含渗透试剂和中和试剂的中和混合物被分层加在在离心管中的洗涤液体积上。在离心后，上清液被除去。然后，保藏溶液(也称为悬浮介质)被加入到堆积的细胞中，以便悬浮细胞类似物，形成参考对照。也可使用其他改变介质的合适方法，如过滤或透析。

已经发现高速离心对类似物具有破坏效果。如果使用太高速的离心力，会导致类似物粘在一起。并且，高速离心可能导致细胞丧失其部分细胞成分。为防止离心的有害效果，对洗涤液层上的中和混合物，使用低速离心。洗涤液包含一种以上的盐，且具有中性pH值，包含高浓度的蔗糖。盐浓度优选略微高于生理盐浓度，以便抑制细胞类似物的聚集。

应当理解，保藏溶液的组合物，即参考对照类似物的悬浮介质，能够基于随后即将进行的试验而被确定。换句话说，悬浮介质的组合物应与即将进行的试验相适配。实施例1描述了适合此处所述的细胞血红蛋白和血红蛋白变体测定的示例性保藏溶液组合物。在本实施例中，保藏溶液是包含盐分和高浓度蔗糖并具有中性pH值的水溶液。

已经发现，红细胞类似物的细胞血红蛋白能够通过在流式细胞分析仪上测定的类似物的测向角散射信号而被确定，正如实施例中所进一步描述的那样。本发明的红细胞类似物的性质与全血中未处理的红细胞、被球形化的红细胞或稳定的红细胞的性质完全不同，因为这些细胞的细胞血红蛋白不能根据测向角散射信号测定来确定。虽然确切的原理尚没有完全被理解，但人们确信红细胞类似物中细胞血红蛋白和它们的测向角散射信号的直接相关性可归因于渗透试剂处理后渗透细胞内的聚集血红蛋白的特性。该差异能够进一步被该事实证实：使用本发明方法获取的红细胞类似物不能被溶解试剂所溶解从而释放血红蛋白；而稳定的红细胞，即使在某一固定条件下被处理，也能被溶解试剂所溶解从而释放血红蛋白，用于在标准的临床化学分析仪器上通过色谱分析法或免疫比浊测定法进行测定。

此外，本发明的红细胞类似物的细胞膜具有高渗透性，允许大分子探针例如抗体进入并与胞内蛋白质结合。已经发现，当本发明的红细胞类似物通过阻抗量测进行测定时，例如通过血液分析仪上的直流电(DC)阻抗量测时，来自这些类似物的阻抗信号实质上要比那些未经处理的红细胞或固定的红细胞所产生的阻抗信号小。DC阻抗测量已被通用于在血液分析仪上测定血细胞大小。该测定方法是基于由血细胞引起的电阻增加，电阻增加能抵制一定量的被测定的电导溶剂。正如可被证实的那样，由于本发明的红细胞类似物胞膜被高度渗透，所以当类似物悬浮于导电溶剂时，导电溶剂能够自由地出入该类似物，因此，由这些类似物所产生的阻抗信号减少。然而，当通过前向角散射测定时，该方法在测定细胞尺寸时也是通用方法，这些被渗透的红细胞基本上显示出与球形化的红细胞相同的尺寸。由于这个原因，红细胞类似物与固定红细胞完全不同。后者对抗体不具有渗透性，且具有与未被处理的红细胞基本相同的阻抗信号。

如后文所描述的，制备用于本发明参考对照的细胞类似物所使用的渗透试剂和中和试剂与用于通过在流式细胞仪上处理血样而使用的试剂相同。形成的细胞类似物被洗涤并再次在保藏溶剂中悬浮，无需通过用细胞类似物制备中通用的固定剂固定。然而，正如随后通过实施例所描述的，在缺少固定剂处理时，这些细胞类似物在暴露于冷冻和融化的环境下是稳定的，且维持了用于免疫测定的抗原位点的特异性。

为了长时间的稳定性，参考对照优选在制备后保持冷冻。典型地，在制备后，参考对照被分配至对照小瓶中。对照小瓶随后被冷冻并保持在不高于-10℃的温度，优选-10℃到-80℃。参考对照在制备后优选在少于24小时内、更优选在少于2小时内、最优选在1小时内冷冻。在发货到顾客期间，参考对照被保持在干冰中或其他合适的材料中冷冻。在使用前，小瓶中的参考对照在室温下解冻。在解冻后，参考对照在使用前轻柔地混合以便形成均匀的类似物悬浮物。

正如可被证实的那样，为本发明的目的，保藏溶液或悬浮介质适合于在冷冻和解冻的条件下保藏。在一个实施方式中，保藏溶液是包含盐和糖的水溶液。盐浓度为大约0.05M到大约2M，优选大约0.1M到大约0.5M。糖是多糖比如二糖，或单糖。实施例1所示的示例性的实施方式中，蔗糖被使用。糖浓度从大约0.1M到大约2M，优选大约0.5M到大约1.5M。已经发现，糖比如蔗糖的相对高浓度阻止了细胞类似物在冷冻类似物悬浮解冻后、和在试验使用过程中在对照小瓶中的下降。此外，正如上文所描述的，悬浮介质也应当与将要进行的试验相适配。例如，由于磷酸盐倾向干扰流式细胞仪上进行的试验，应考虑在参考对照将被使用的试验基础上确定是否在保藏溶液中使用磷酸盐。

已经惊讶地发现，本发明的参考对照中的细胞类似物在没有使用保护剂的情况下对冷冻和解冻处理也是有耐受性的，并且在类似物悬浮物冷冻和解冻后，保留了细胞抗原位点和细胞类似物对于大分子探针的渗透性。在不结合任何理论的情况下，相信该独一无二的特性可能可归因于被聚集的胞内蛋白质上抗原位点的保留。正如下文所描述的，在使用参考对照的方法中，本发明参考对照中的细胞类似物维持了它们对抗体的特异性。当被加入血样中时，本发明参考对照的细胞类似物经历着与血样在试验中经历的相同的抗体抗原反应，且基本上模拟了仪器中样品的血细胞。

在进一步的实施方式中，本发明提供了包含被荧光标记的细胞类似物的参考对照。用如此标记产生的细胞类似物在此被称为被标记类似物，包含被标记类似物的参考对照被称为(被)标记的参考对照。当参考对照被加入血样中作为试验的内部对照时，参考对照中被标记的类似物能被识别，且能容易地通过荧光测定与样品的血细胞区别开来。

为了制备被标记的参考对照，上述的本发明方法进一步包括标记用于制备细胞类似物的血细胞。在一个实施方式中，荧光染料、羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯被用于标记血细胞中的细胞蛋白质。其他各种荧光标记也用于标记细胞。

众所周知，羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)是亲脂性分子和可被动地扩散入细胞的非荧光性化合物。在细胞内，酯酶去除了乙酰基，剩余的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)明显具有荧光。CFSE与蛋白质共价结合，且能很好地保留在细胞内。CFSE具有488nm的激发波长和510-550nm的发射波长，适合在具有488nm的激发波长和525nm检测器的流式细胞仪上使用。

实施例2描述了用上文描述的本发明方法使用全血来制备标记红细胞类似物的实施例。如其所示，在制备被标记的细胞类似物时，血细胞首先与血浆分离，在将血细胞暴露于荧光染料前，用等渗稀释液例如磷酸盐缓冲盐水或其他合适的稀释剂进行洗涤。为了使用CFDA-SE标记血细胞，被洗涤的血细胞在包含CFDA-SE的等渗溶液中被温育一段充分的时间，以便使染料穿透细胞膜并且允许CFSE标记胞内蛋白质。温育时间可以是大约1小时到大约5小时左右，优选大约2小时到大约4小时。温育后，被标记的血细胞在暴露于渗透试剂前用等渗稀释液洗涤，以便去除介质中多余的染料。随后的制备步骤，即，与渗透试剂反应、用中和试剂抑制、洗涤、冷冻及解冻，与在上文所描述的制备无标记的参考对照过程中的步骤相同。

在暴露于渗透试剂前，被标记的血细胞优选在实施例2中所描述的自体血清或其他血清中再次悬浮以形成重新配制的血液。血清的存在防止在随后的制备步骤中血细胞丢失血红蛋白。优选重新配制的血液与渗透试剂混合，试剂与血液的比例大约为100∶1以上。任选地，为测定细胞血红蛋白，被标记的红细胞在用渗透试剂处理前可以暴露于球形化试剂，以便使得被标记的红细胞球形化。

在下文描述的测定成熟红细胞和网状细胞中的细胞血红蛋白和血红蛋白变体的方法中，通过使用核酸染料的荧光测定使得网状细胞与成熟红细胞区分开来。用荧光标记的细胞类似物需要与用核酸染料染色的网状细胞区分开来。正如实施例3中所描述的，被CFSE标记的细胞类似物和血液样本中经核酸染料染色的网状细胞都可在525nm(FL1)处被检测到，但是，CFSE的FL1信号比用于染色网状细胞中RNA的吖啶橙的FL1信号要强的多。当参考对照被用于作为试验内部对照时，该强度的不同使得参考对照中被标记的类似物与血样中成熟红细胞和网状细胞区分开来。

已知荧光标记与蛋白质的结合可能影响蛋白质的抗原位点或干扰抗体结合。因此，重要的是参考对照中被标记的类似物基本保留它们的结合特异性和对用于试验的抗体的亲和力。

已经发现，在荧光标记后，上文描述的细胞类似物的特性得以保留。更具体地说，被标记的细胞类似物的细胞血红蛋白能够使用上文描述的和下述实施例中所进一步描述的侧向角散射信号进行测定。蛋白质的抗原位点特异性和膜的渗透性得以保留。此外，被标记的类似物对冷冻与解冻处理的耐受性也得以保留。本发明的参考对照包含被标记的类似物或未被标记的类似物，可以在上文描述的冷冻环境下保藏至少一年，同时保留细胞类似物的细胞成分的特性。

实施例2描述了由正常的人类全血制备被标记的参考对照。实施例4进一步描述了由糖尿病患者的全血制备被标记的参考对照，以及解冻后在使用侧向角散射信号测定细胞血红蛋白和使用荧光测定HbA1c中被标记的参考对照的稳定性，这些在下文中有进一步的描述。

细胞血红蛋白，具体的血红蛋白变体含量如HbA1c以及参考对照中特定的血红蛋白变体百分比可以通过在流式细胞分析仪上使用侧向角散射和荧光测定来确定，这些方法在下文会进一步描述。术语“流式细胞分析仪”指本领域已知的流式细胞仪和装有光散射和/或荧光检测装置的血液分析仪。参考对照的这些参数的参考值可通过在相同的流式细胞分析仪上和在相同的操作条件下测定血样和参考对照进行赋值，这些血样具有根据现有参考方法而获得的已知的这些参数值。多种参考方法在本领域是已知的，例如，血样的平均细胞血红蛋白含量(MCH)能够从血液分析仪中获得，HbAc1百分比能够通过使用亲和色谱法、免疫比浊法或者离子交换色谱法获得。实施例7描述了用于本发明参考对照的赋值参考值的具体方法。

在另一个方面，本发明提供了在流式细胞分析仪上将上文描述的参考对照用于细胞中细胞成分的逐一细胞分析的方法。参考对照能或者被用作独立对照、或者用作内部对照。术语“独立对照”指不与样品混合，单独通过流式细胞分析仪进行分析的参考对照。独立对照一般与一批样品一起分析，作为用于组内分析或组间分析目的的参考物。术语“内部对照”指被加入样品中与样品一起在流式细胞分析仪上分析的参考对照。

本发明参考对照用于逐一细胞分析的方法通过下文中测定细胞血红蛋白和血红蛋白变体的细胞百分比的实施例进行描述。然而，应当理解，使用本发明方法制备的参考对照也可被用于测定其他细胞成分。

本文中，术语“细胞血红蛋白”指单个红细胞中血红蛋白总量，该血红蛋白包含了细胞中存在的所有血红蛋白变体。术语“网状细胞的血红蛋白”指单个网状细胞中的血红蛋白总量，该血红蛋白包含了网状细胞中存在的所有血红蛋白变体。细胞血红蛋白通常也被称为逐一细胞(cell-by-cell)的血红蛋白。术语“血红蛋白变体”指所有的血红蛋白变体，例如，胎血红蛋白、糖化血红蛋白如HbA1c、以及血红蛋白的异常形式如那些在镰状细胞疾病和地中海贫血中发现的异常形式。术语“细胞血红蛋白变体”指在单个红细胞中血红蛋白变体含量。术语“血红蛋白变体的细胞百分比”指单个红细胞中血红蛋白变体比上血红蛋白总量的百分比。例如，在本文描述的HbA1c的测定中，用HbA1c的细胞百分比或细胞的HbA1c百分比表示。因此，使用本发明方法获得的样品中血红蛋白变体百分比是血样中所有被测定的红细胞中该血红蛋白变体的细胞百分比的平均值。

为了在流式细胞分析仪上将本发明参考对照用于血样的细胞血红蛋白和细胞血红蛋白变体的测定，提供了包含由被渗透的红细胞制备的红细胞类似物的参考对照。红细胞类似物包含其内被聚集的胞内蛋白和被保留的所关注的血红蛋白变体的抗原位点，且具有可渗透抗体的细胞膜。当该参考对照被用于内部对照或独立对照时，将参考对照和血样暴露于相同的试剂和相同的试验步骤(见实施例3)，然后在流式细胞分析仪上通过侧向角散射和荧光测定方法进行分析。血样中红细胞和参考对照中红细胞类似物的血红蛋白通过使用侧向角散射信号确定。血样中红细胞和参考对照中红细胞类似物的血红蛋白变体通过使用荧光信号确定。

通过使用侧向角散射和荧光测定来测定血样的细胞血红蛋白和细胞血红蛋白变体的方法已在U.S.2007/0020612 A1中有详细描述，在此将其全部内容并入此文以供参考。

更具体地说，通过使用该方法，将血样与渗透试剂混合形成第一样品混合物。第一样品混合物被温育了一段充分的时间，以使胞内蛋白聚集，且使得抗体可渗透入细胞膜。随后，中和试剂被加入第一样品混合物中，以抑制渗透试剂进一步与红细胞反应，从而形成了第二样品混合物。接着，在流式细胞分析仪上进行第二样品混合物的侧向角散射测定。血样的细胞血红蛋白通过使用获得的侧向角散射信号被确定。

当测定血红蛋白变体时，中和试剂可进一步包含对所关注血红蛋白变体具有特异性的荧光标记的抗体，如抗HbA1c或抗Hbf抗体。由于细胞膜能被渗透试剂渗透，大的抗体分子能穿过细胞膜与红细胞内血红蛋白变体的抗原位点结合。第二样品混合物被温育一段时间，以允许抗体结合。接着，第二样品混合物的荧光测定与侧向角散射测定同时进行，血红蛋白变体的细胞百分比可以通过使用荧光信号和侧向角散射信号来确定。

此外，当血样网状细胞中的细胞血红蛋白和血红蛋白变体将被测定时，如上文所描述，该方法可进一步包括：在将血样暴露于渗透试剂前，用核酸染料染色血样。可以选择的是，核酸染料可以被包含在球形化试剂中，这能增强核酸染料穿透进入细胞膜的速度。

在半自动测定方法中，上文描述的第二样品混合物在流式细胞分析仪上以一个批次接一个批次的方式被测定。被制备的样品混合物在测定前可能等候很长时间，如几小时。因此，在本发明的方法中，固定试剂可以选择性地被加入第二样品混合物中以固定细胞。

固定试剂包含固定剂、渗透压调节剂和缓冲液。固定剂优选醛类，包括但不限于甲醛、多聚甲醛或戊二醛。渗透压调节剂可以是一种以上碱金属盐，优选碱金属卤化物，如氯化钠或氯化钾。固定剂优选渗透压为大约1100到大约1400mOsm/kg水的高渗透性试剂。缓冲液可以是能提供中性pH值的有机或无机缓冲液。固定试剂的pH值优选大约6.9到大约7.3，能够维持中和试剂所获得的中性pH值。此外，固定试剂优选包含螯合剂如硫酸葡聚糖、EGTA和硼酸。已经发现，与一般使用包含甲醛和磷酸盐缓冲剂的固定试剂相比，固定试剂中的硫酸葡聚糖、EGTA和硼酸的组合能有效地抑制在最终样品混合物中的细胞聚集。实施例1显示了固定试剂的示例性组合物。

实施例3描述了使用被标记的参考对照作为内部对照来测定血样的细胞血红蛋白和血红蛋白变体的方法，被标记的参考对照通过使用实施例2的方法由正常的全血制备。如实施例3中所描述，一定体积的全血样品首先与包含吖啶橙的球形化试剂混合，以便染色网状细胞RNA。然后，一定体积的被染色的样品混合物与实施例1中的渗透试剂混合，形成第一样品混合物。温育后，被标记的参考对照被加入第一样品混合物中。随后，加入实施例1中的包含荧光抗HbA1c抗体的中和试剂，形成第二样品混合物。第二样品混合物被温育，以允许抗体穿透被渗透的细胞膜且与HbA1c抗原结合。其后，加入实施例1中的固定试剂，形成最终样品混合物。

在Beckman Coulter

FC500MCL血细胞计数器上，通过前向角散射和侧向角散射测定、以及在525nm(FL1)与675nm(FL4)处的荧光测定，分析最终样品混合物。图1A到1C分别显示了得到的前向角散射(FS)对侧向角散射(SS)、FS对FL1、和FL1对FL4的散点图。

本文中，术语“侧向角散射信号”，在流式细胞术中已知是指来自入射光90°左右或直角的光散射信号，该光散射信号由穿过流动细胞孔径的粒子或血细胞产生。前向角散射信号是指量出的来自入射光小于10°的光散射信号。术语“侧向角散射信号测定”是指光检测器的侧向角散射信号测定。大部分市场上可买到的流式细胞分析仪都装备有能够测定前向角散射信号和侧向角散射信号的检测系统。

图1A中，区域A包含血样中的红细胞和参考对照中的被标记的类似物，如图1B和1C所显示，在该散点图上选出的(gated)红细胞和类似物通过使用荧光被用于进一步的差异分析。区域A外的种群是白血球和血小板。

图1B中，区域B包含血样中的成熟红细胞；区域C包含血样中用吖啶橙染色的网状细胞；区域D包含参考对照中用CFSE标记的类似物。如图所示，血样中的成熟红细胞和网状细胞及参考对照中被标记的类似物在FL1轴上被区分开来。

图1C中，区域F包含血样中的成熟红细胞；区域G包含血样中的网状细胞；区域E包含被标记的参考对照中的类似物。

可以证实的是，525nm(FL1)处的荧光测定法可测定产生于吖啶橙染色的RNA和用CFSE标记的胞内蛋白质的荧光信号。如上文所描述的，吖啶橙被用于区分网状细胞和成熟红细胞，CFSE用于标记参考对照中的细胞类似物。虽然两种信号在相同的波长处都能被检测到，但用CFSE标记的细胞类似物具有比网状细胞强得多的信号。因此，参考对照中的类似物在散点图的FL1轴上不会与网状细胞重叠，且能够与网状细胞区分。

血样的平均细胞血红蛋白由血样中单个红细胞的侧向角散射值的平均值获得。血样的HbA1c含量由675nm(FL4)处的荧光信号在减去荧光背景值后的平均值获得。血样的HbA1c百分比由血样的HbA1c含量除以血样的平均细胞血红蛋白而计算。由于成熟红细胞和网状细胞相互区分开来，可以获得血样中这两种红细胞亚种群的平均细胞血红蛋白和HbA1c百分比。

类似地，由于被标记的参考对照中的红细胞类似物被与血样中的成熟红细胞和网状细胞区别开来，通过使用上文描述的相同计算方法，使用红细胞类似物的侧向角散射信号和荧光信号，可以获得参考对照的平均细胞血红蛋白和HbA1c百分比。

可以证实的是，当具有红细胞平均血红蛋白含量(MCH，血红蛋白总量)和HbA1c百分比已知值(根据现有参考方法测定)的血样和参考对照采用本发明的方法被一起测定时，这些已知值和血样的侧向角散射信号平均值及荧光信号平均值能被用于将这些参数的参考值赋值给本发明的参考对照，正如实施例7中所描述的那样。

当具有赋值参考值的参考对照被用作待检测血样中的内部对照时，血样的细胞平均血红蛋白含量和HbA1c百分比可通过使用参考对照而获得。实施例7与实施例8描述了示例性的方法。应当注意，当参考对照被用于作为独立对照时，相同的机制也适用。此外，在实施例7和实施例8中，通过使用本发明参考对照获得的血样的细胞平均血红蛋白含量和HbA1c百分比的方法已被详细描述，以便与参考实验室的标准方法所产生的结果相比较，每一个参数是一个值，也就是说，由每一个测试样品的溶血产物所获得的血红蛋白总量和HbA1c百分比。然而，除了细胞平均血红蛋白含量和HbA1c百分比外，更重要的是，本发明的方法提供了单个红细胞的细胞血红蛋白和细胞HbA1c比率。

已经发现，就胞内蛋白含量和胞内抗体而言，解冻后的本发明参考对照的稳定性与新鲜血液的稳定性相同。实施例4描述了这样的实施例。如其显示，被标记的参考对照通过使用来自糖尿病患者的全血采用上文所述的制备方法来制备。在稳定性试验中，被标记的参考对照被加入正常血样中作为内部对照，接着血样通过采用实施例3中描述的试验步骤进行测定。

在一小瓶冷冻类似物悬浮物解冻后，试验分别在解冻后立刻、1.5小时、2.5小时和20小时进行。在试验期间，在将被标记的参考对照加入血样前，血样样品和被标记的参考对照都被室温保存。血样中红细胞与被标记的参考对照中红细胞类似物的侧向角散射信号和FL4信号的分析分别进行。更具体地说，血样中的成熟红细胞和网状细胞与参考对照中的红细胞类似物首先如图1B中描述的那样通过FS对FL1的散点图进行区分。区分后，获得每一种群的侧向角散射信号。成熟红细胞、网状细胞和红细胞类似物的FL4信号由图1C中描述的FL1对FL4的散点图获得。

图2A和2B分别显示了被标记的参考对照解冻后平均侧向角散射信号和平均FL4信号对时间的图。如图所示，血样中的红细胞和被标记的参考对照中的红细胞类似物的平均侧向角散射信号在20小时内保持稳定，表明了解冻后红细胞类似物的稳定的血红蛋白含量。由于血红蛋白构成了99％的红细胞干重，该结果表明在被标记的细胞类似物解冻后没有发生细胞成分的损失。

另一方面，在解冻后第一个2小时内观察到FL4信号的少量减少，这表明了血样的红细胞和参考对照的红细胞类似物中HbA1c抗原数量的少量减少。然而，在最初减少后，红细胞类似物的FL4信号在20小时内保持稳定。如图所示，红细胞类似物的FL4信号比血样中的红细胞稍微稳定一些。

虽然实施例4显示了在测定细胞血红蛋白和血红蛋白变体中本发明参考对照的稳定性，但是包含冷冻和解冻细胞类似物的本发明参考对照可以被用于其它细胞成分的流式细胞分析。参考对照能被用于匀一化在试验中(组内分析)来自不同样品的数据以及在空间或时间分别进行的试验中(组间分析)的数据。

实施例5中描述了在模拟情况下使用本发明参考对照来校正组间分析误差的有效性。由糖尿病患者进行制备的被标记的参考对照被用作内部对照。血样通过使用实施例3中描述的试验步骤进行制备，通过FC500 MCL血细胞计数器在FL4检测器的光电倍增管(PMT)的不同电压下进行分析。在每一PMT设定下获得成熟红细胞和红细胞类似物的侧向角散射信号和FL4信号。在每一PMT设定下，血样中红细胞的HbA1c百分比通过FL4平均值除以红细胞的侧向角散射平均值而获得。类似地，被标记的参考对照中红细胞类似物的HbA1c百分比通过每一PMT设定下的FL4平均值除以类似物的侧向角散射平均值而获得。

图3显示了在不同PMT设定下血样的成熟红细胞和参考对照的红细胞类似物的HbA1c百分比。如图所示，PMT电压的增加提高了血样(曲线A)和对照(曲线B)的HbA1c百分比。然而，在每一PMT设定下，在血样的HbA1c百分比除以参考对照的HbA1c百分比并且归一化后，在不同PMT设定下获得的被校正的血样的HbA1c百分比(曲线C)是恒定的和可再现的。

实施例中使用的PMT电压变化模拟了由仪器引起的荧光信号变化。由于参考对照经历了与血样所经历的相同的变化，该变化对测定的表观值的影响可通过使用参考对照而被消除。该实施例证明，本发明的参考对照能被用于匀一化数据并校正由外在因素比如仪器、温度或试验试剂所引起的组间分析误差。

实施例6描述了使用本发明参考对照在模拟情况下校正组间分析差异的有效性。一系列测试样品由全血样品制备，每一测试样品具有不同的红细胞浓度。根据实施例3描述的试验步骤，使用由糖尿病患者进行制备的被标记的参考对照作为内部对照，处理并分析该测试样品。

图4显示了测试样品的红细胞和参考对照的红细胞类似物的HbA1c百分比对于测试样品的红细胞浓度的关系。如图所示，测试样品(曲线A)和参考对照(曲线B)的HbA1c百分比随着测试样品的红细胞浓度的增加而减少。然而，在将测试样品的HbA1c百分比除以参考对照的HbA1c百分比并归一化后，获取的被校正的不同红细胞浓度的测试样品的HbA1c百分比(曲线C)基本上是相同的，该百分比是独立于血细胞浓度变化的。

可以理解的是，当参考对照的细胞类似物被用作内部对照时，该细胞类似物暴露于与血样所经历的相同的环境。因此，该变化对测定的表观值的影响可通过使用参考对照被消除。该实施例进一步证明本发明的参考对照可以用于校正由血样的内在因素引起的组内分析误差。

实施例7和实施例8进一步描述了本发明参考对照对组内分析和组间分析差异的校正作用。在实施例7中，提供了一种详细的方法，通过使用具有已知HbA1c百分比(根据参考实验室报道的三种现有的参考方法测定)的第一系列的20个血样，将HbA1c百分比的参考值赋值给被标记的参考对照。在将参考值赋值给参考对照后，另两个系列的血样的HbA1c百分比通过使用被标记的参考对照作为内部对照予以确定。为比较目的，另两个系列的血样的HbA1c百分比也通过使用第一个系列的血样作为参考进行计算，而没有使用来自本发明参考对照的信息。

如表3和表4所示，通过使用本发明参考对照获得的三个系列血样的HbA1c平均百分比相比那些没有通过使用参考对照获得的百分比的相关性要好得多。此外，有内部对照的三个系列的结果的标准偏差是0.015，该标准偏差与没有内部对照的0.079的标准偏差有了实质性的提高。

在实施例8的组内分析误差校正效果的评估中，结果显示，通过使用本发明方法、用被标记的参考对照作为内部对照所获得的血样的HbA1c百分比与由现有参考方法获得的结果之间的相关性要比那些不使用内部对照而获得的HbA1c百分比的相关性要明显好得多。因此，使用本发明参考对照提高了组内分析一致性。

本发明的参考对照有几个优点。首先，参考对照的细胞类似物具有能渗透大分子探针例如通常用于免疫分析的荧光标记抗体的渗透性细胞膜，并且能被用于逐一细胞分析，所述分析通过使用胞内标记物标记胞内成分以便模拟被测试的样品中胞内标记物的结合过程。第二，参考对照中细胞类似物的细胞血红蛋白能通过使用简单的侧向角散射测定进行测定。这提供了如下一个较强优势：可在侧向角散射信号和荧光信号的一个单一步骤测定中，测定每个细胞的血红蛋白总量和细胞的血红蛋白变体。两种测定方法都可以在通过市场买到的大部分流式细胞分析仪上进行。第三，参考对照的细胞类似物被标有荧光标记。因此，参考对照能被用作内部对照。细胞类似物能很容易地识别并且与被测定的样品中血细胞相区分。第四，参考对照对冻融处理有耐受性，不会导致被测定的细胞类似物的细胞成分的降解，且在冷冻并解冻后维持了细胞膜的可渗透性。同样地，本发明的参考对照与已知现有技术的稳定化细胞相比能被储存的时间要长得多，这意味着产品稳定性要长得多。正如上文描述的，本发明的参考对照能在上述冷冻的情况下储存至少一年，同时能保留细胞类似物中细胞成分的特性。第五，正如上文进一步描述的，在制备参考对照的过程中，未使用传统的保护剂如甘油或二甲亚砜。因此，这避免了这些化学品对将要进行的试验的干扰，尤其是当参考对照被加入样品用作内部对照时。鉴于上述优点，本发明的参考对照对于流式细胞术中参考对照的实用性和稳定性方面提供了重大的改善。

下述实施例用于说明本发明，并没有限制权利要求中所限定的本发明的范围。应当理解，根据进行的公开可以使用不同的其他成分和比例。实施例1制备用于在流式细胞分析仪上进行细胞血红蛋白测定的细胞类似物所使用的试剂球形化试剂成分

根据下述组合物制备含水的球形化试剂：

应当注意，除非另有说明，本文描述的所有试剂皆通过0.22μm孔径的无菌的尼龙过滤器过滤。渗透试剂组合物

根据下述成分制备下述渗透试剂：

试剂具有0.99mS/cm的电导率和268mOsm/Kg水的渗透压度。Proclin 300从加利福利亚南旧金山Zymed实验室中获得。中和试剂组合物

根据下述组合物制备含水中和试剂：

洗涤溶液组合物

根据下述组合物制备洗涤溶液：

保藏溶液组合物

根据下述组合物制备保藏溶液：固定试剂成分

根据下述组合物制备含水的固定试剂：

荧光性抗HbA1c抗体

根据厂商说明书，通过荧光染料分子Alexa Fluor

647与单克隆抗HbA1c抗体以每一抗体分子5个染料分子的分子比率共价结合，制备荧光性的抗HbA1c抗体。Alexa Fluor 647由加利福利亚卡尔斯巴德的Invitrogen公司制备。染料在647nm处有最大吸收。实施例2制备被标记的参考对照

全血从捐赠者处收集，用0.7mM乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂。全血在4℃温度下储存不超过3天。

自体血清从部分全血中制备。全血在300g下离心5分钟，上清液通过在13000g下第二次离心5分钟除去粒子。

0.1ml的全血通过在300g下离心，用1ml的磷酸盐缓冲剂盐水(PBS)洗涤3次。在洗涤后，混合了0.01ml羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)的1ml PBS被加入到团粒中，不定期地混合的细胞悬浮物在室温下温育3个小时，以便允许羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞蛋白质。温育后，细胞悬浮物在300g下离心，并用1ml的PBS再洗涤一次。团粒加至0.05ml的自体血清中，形成重新配制的被标记的血液。使用的PBS的pH值为7.4，含有150mM氯化钠和10mM的磷酸钠。羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯具有10mg/ml浓度的二甲亚砜，在使用前-20℃储存。

重新配制的被标记的血液与0.4ml实施例1中的球形化试剂混合，并在室温下温育2分钟。温育后，加入16ml实施例1中的渗透试剂、混合并在室温下温育另外的3分钟，以便渗透细胞膜并引起胞内蛋白聚集。接着，加入8ml实施例1中的中和试剂，以防止渗透试剂的进一步反应。形成的具有24.45ml总体积的中和混合物在离心管内在20ml的实施例1中的洗涤溶液上分层，并在300g下离心10分钟。除去上清液后，团粒被置于5ml实施例1的保藏溶液中，以形成类似悬浮物，也就是被标记的参考对照。类似悬浮物以0.5ml的体积分配至1ml小瓶中、封闭、在-50℃的温度下冷冻不到1小时。使用前，冷冻参考对照小瓶在室温下解冻，在被加入待检测的血样或作为单独对照使用前，轻轻地混合，以形成均匀的类似悬浮物。实施例3被标记的参考对照用作内部对照来测定血样中细胞血红蛋白和糖化血红蛋白(HbA1c)百分比的测试

使用收集在含有0.7mM EDTA作为抗凝剂的试管中的全血样品。全血样品在4℃温度下保藏不超过3天。使用来自糖尿病患者的全血制备的被标记的参考对照和实施例2的制备方法被用于该测试。

一等分4μl的全血样品与200μl实施例1中的球形化试剂相混合，其进一步包含8.3μM的吖啶橙并形成染色样品混合物。温育1分钟后，将3μl的染色样品混合物与60μl实施例1中的渗透试剂相混合，形成了第一样品混合物。温育1.5分钟后，5μl的被标记的参考对照被加入第一样品混合物中并进行混合。温育1分钟后，加入100μl的实施例1中的中和试剂并混合，形成了第二样品混合物。中和试剂含有5mg/l的实施例1中的荧光抗HbA1c抗体。在温育另外10分钟后，加入80μl实施例1中的固定试剂，形成了最终的样品混合物。

通过前向角散射和侧向角散射测定、以及在525nm(FL1)和在675nm(FL4)处的荧光测定，在FC500MCL细胞计数器上分析最终的样品混合物。图1A至1C分别显示得到的前向角散射(FS)对侧向角散射(SS)、FS对FL1、和FL1对FL4的散点图。

在图1A中，区域A包含血样中的红细胞和被标记的参考对照中的红细胞类似物，它们在这个散点图上被选出，通过使用荧光做进一步的差异分析，如图1B和图1C所示。区域A外的群体是白细胞和血小板。在图1B中，区域B包含血样中的成熟红细胞；区域C包含被吖啶橙染色的血样中的网织红细胞；并且区域D包含被CFSE标记的参考对照中的红细胞类似物。在图1C中，区域F包含血样中的成熟红细胞；区域G包含血样中的网织红细胞；并且区域E包含被标记的参考对照中的红细胞类似物。

通过FC500MCL细胞计数器测定的单个红细胞的侧向角散射数值(SS)的平均值可以得到样品的平均红细胞血红蛋白量(与MCH相关)。通过在675nm(FL4)处的单个红细胞荧光信号的平均值，在减去荧光背景值后，可以获得血样的HbA1c含量。在不含HbA1c抗体并存在非特异性等型对照单克隆抗体(IgG1)(该抗体被偶联至Alexa Fluor647)的情况下，通过使用如上所述的试验步骤分析血样而获得所述荧光背景值。由血样中所有被测定的红细胞的FL4/SS的平均值可以获得血样的HbA1c百分比，该平均值是红细胞的细胞HbA1c百分比的平均值。实施例4参考对照在解冻之后的稳定性

通过使用来自于糖尿病病人的全血和实施例2中描述的制备方法，制备被标记的参考对照。被标记的参考对照被加入正常全血样品中，作为内部对照，并且使用实施例3中描述的测试工艺来分析血样。

在一小瓶冷冻的类似物悬浮液解冻后立即、在解冻后1.5小时、2.5小时和20小时分别进行测试。在这些试验之间的时间间隔中、在被标记的参考对照添加于血样之前，血样和被标记的参考对照两者均被放置于室温下。在这个实验期间，细胞计数器的设置未改变。

血样中的红细胞和参考对照中的类似物的侧向角散射和FL4信号的分析是分开进行的。更具体地说，血样中的成熟红细胞和网织红细胞以及参考对照中的红细胞类似物首先是如图1B所示在FS对FL1散点图上被区分。在区分后，获得每一个群体的侧向角散射信号。通过如图1C所示的FL1对FL4散点图，得到成熟红细胞、网织红细胞以及类似物的FL4信号。

图2A和2B分别显示了在被标记的参考对照解冻后，平均侧向角散射信号和平均FL4信号相对于时间的图。用A标明的曲线是从血样红细胞中获得，用B标明的曲线是从被标记的参考对照的红细胞类似物中获得。在图2A和2B中，计时起点是解冻完成时候的时间。

如图所示，样品中的红细胞和被标记的参考对照中的红细胞类似物的平均侧向角散射信号在20小时内都是稳定的，表明在解冻之后的稳定的血红蛋白含量。另一方面，观察到在解冻之后的第一个两小时内FL 4信号的稍微的降低，表明血样中的红细胞和参考对照中的类似物两者中的HbA1c抗原含量稍微降低。然而，在最初的减少之后，红细胞类似物的FL 4信号在20小时内都是稳定的。如图所示，类似物的FL 4信号比血样的红细胞的FL 4信号稍微更加稳定。实施例5参考对照在通过FL4检测器电压的变化模拟组间分析误差中的应用

正常全血样品被用于这个实验，从糖尿病病人样本制成的被标记的参考对照作为内部对照。

根据使用实施例3中描述的试验步骤制备血样，并且在FC500MCL细胞计数器上在FL4检测器的光电倍增管(PMT)的不同电压下分析血样。在每一次PMT设定处，使用先前描述的方法，获得成熟红细胞和红细胞类似物的侧向角散射和FL4信号。在每个PMT设定处，通过FL4平均值除以红细胞侧向角散射平均值，可以得到血样中红细胞的HbA1c百分比。类似地，在每个PMT设定处，通过FL4平均值除以类似物侧向角散射平均值，可以得到被标记的参考对照的类似物的HbA1c百分比。

图3显示了在不同PMT设定下血样的成熟红细胞和对照的红细胞类似物的HbA1c百分比。如图所示，PMT电压的增加提高了血样(曲线A)和对照(曲线B)的HbA1c百分比。然而，在每个PMT设定下，血样的HbA1c百分比除以参考对照的HbA1c百分比后，乘以因子6以便归一化数据，在不同的PMT设定下获得的被校正的血样(曲线C)的HbA1c百分比是恒定的和可再现的。实施例6参考对照在通过改变样品中红细胞浓度来模拟组内分析误差中的应用

按如下所述方法制备具有不同红细胞浓度的测试样品。将用EDTA作为抗凝血剂的全血样品(参见实施例2)在300g下离心。除去血清，然后将堆积的细胞再悬浮在体积大约是被堆积细胞体积三分之一的血清中。100μl再悬浮的细胞被分配至九个试管中，向每个试管中添加不同量的血清，从0至160μl。通过计算细胞计数器中的细胞，确定这些测试样品的实际红细胞浓度。

根据实施例3中描述的试验步骤，使用由糖尿病病人的全血制备的被标记的参考对照作为内部对照，来处理和分析测试样品。

图4显示了测试样品中红细胞和参考对照中红细胞类似物的HbA1c百分比相对于测试样品中红细胞浓度的图。如图所示，测试样品(曲线A)和参考对照(曲线B)的HbA1c百分比随着测试样品中红细胞浓度的增加而降低。然而，在测试样品的HbA1c百分比除以参考对照的HbA1c百分比后，乘以因子6以便归一化数据，在不同的红细胞浓度下获得的被校正的测试样品的HbA1c百分比(曲线C)是基本上相等的。实施例7使用参考对照，在HbA1c百分比的测定中校正组间分析误差

在使用被标记的参考对照作为内部对照的HbA1c百分比测定中，三个系列的20个血样被用于评估组间分析误差。通过参考实验室，使用三种不同的HbA1c测定标准方法，更具体地说使用Primus

Ultra 2(Primus Diagnostics，密苏里州)的亲和层析法、Roche

Unimate(罗氏诊断公司，印地安那州)的免疫比浊法和Tosoh

G7变型(日本东曹达公司，加利福尼亚)的离子交换色谱法，来测定每个血样的HbA1c百分比。参考实验室的HbA1c百分比是根据NGSP标准化(David Sachs用于HbA1c分析的ADA/EASD/IDF工作组；临床化学2005；51：681-683)。在第一个系列和第二个系列之间是4星期的时间间隔，在第二个系列和第三个系列之间是2星期的时间间隔。

与参考实验室进行的HbA1c测定相平行地，根据实施例3中描述的测试工艺，使用本发明的方法，且使用由糖尿病病人的全血制备的被标记的参考对照作为内部对照，来分析每个系列的20个血样。在所有三个系列的血样中，实验条件和细胞计数器设置保持相同。

由在FC500MCL细胞计数器上收集的原始数据，计算出使用本发明方法得到的HbA1c百分比，如下所述：1.从抗Hb_A1c-Alexa Fluor 647抗体的FL4信号中减去吖啶橙和/或CFSE产生的FL1信号的13.3％部分，以便补偿FL1溢出至FL4的信号。这是FL1-FL4补偿，普遍用于流式细胞仪上的多色荧光测定中。2.从得到的FL4数值中减去如实施例3中所描述的获得的荧光背景值。3.在步骤1和步骤2后获得的被校正的红细胞的FL4值(代表红细胞的细胞HbA1c含量)，除以侧向角散射(SS)数值(反映红细胞的细胞血红蛋白)，以便获得每个红细胞的FL4/SS。来自血样中所有被测定的红细胞的FL4/SS平均值是样品的细胞HbA1c百分比平均值，与由参考实验室得到的相同血样的HbA1c百分比相关。4.为了归一化FL4/SS数值，并使它们处在HbA1c百分比的范围内，可以使用来自于这三个参考方法的HbA1c百分比数值的平均值(参见表1A)。当被标记的参考对照的参考值被赋值时，该工作就算完成了。对于待分析的血样，能够使用被标记的参考对照的参考值来使得FL4/SS数值归一化(参见表1B)。图5A显示了被归一化的FL4/SS数值与从参考实验室获得的相同血样的HbA1c百分比数值之间的相关性。需注意的是，在表1A和1B中，血样或者参考对照的FL4/SS值是所有被测定的细胞或者红细胞类似物的FL4/SS数值的平均值。5.如图5A所示，在高端处FL4/SS数值和参考实验室的结果是稍微非线性相关，这被认为是由于细胞内被偶联的抗体分子间的位阻造成的，并且取决于细胞中的抗原密度。为了校正高端处的这个稍微的非线性相关，被归一化的FL4/SS数值经受下列转换：被转换的FL4/SS数值＝e^{0.157x被归一化的FL4/SS数值+1}这个公式在FL4/SS数值范围为大约3至15时是有效的。对于反向转换，使用下列公式：被归一化的FL4/SS数值＝(LN(被转化的FL4/SS数值)-1)/0.157

应理解，上述的公式是适合NGSP标准化的HbA1c百分比数据。上述转换是凭经验开发的，为来自于参考实验室的HbA1c数值提供了更好的线性相关(参见图5A和5B)。需注意的是，流式细胞分析数据的一些数学转换可为参考实验室数据提供线性相关性。优选地，可使用上面显示的简单的指数公式，因为其易于转换或者反向转换数据，如此处所述。

用于上述计算的符号被总结在表1A和表1B中。表1A.使用具有已知HbA1c百分比数值的血样，HbA1c百分比参考值被赋值给被标记的参考对照

参数	符号
		被校正的血样FL4/SS数值	a
被校正的被标记的参考对照的FL4/SS数值	b
		来自于参考实验室的血样的HbA1c百分比	c
被归一化的被标记的参考对照的FL4/SS数值	d＝b*c^反向转换
		被标记的参考对照的被赋值的HbA1c百分比参考值	e＝d^转换

表1B.使用内部对照的参考值确定血样的HbA1c百分比

参数	符号
		被校正的血样FL4/SS数值	a
被校正的被标记的参考对照的FL4/SS数值	b
		被标记的参考对照的HbA1c百分比参考值	e
被归一化的血样的FL4/SS数值	f＝a*e^反向转换/b
		血样的HbA1c百分比	g＝f^转换

通过使用来自于参考实验室的第一系列血样的HbA1c百分比数值，根据表1A，被标记的参考对照的HbA1c百分比参考值被赋值，如下所述：20个样品的被校正的FS/SS平均值，(a)＝6.19；20个样品中被标记的参考对照的被校正的FS/SS平均值，(b)＝7.63；20个样品的参考实验室HbA1c百分比数值的平均值，(C)＝7.13；20个样品的被反向转换的参考实验室HbA1c百分比数值的平均值，c^反向转换＝6.01；20个样品中被标记的参考对照的被归一化的经校正的FS/SS平均值，(d)＝7.63*6.01/6.19＝7.41；被标记的参考对照的被赋值的HbA1c百分比参考值，(e)＝d^转换＝8.70。

使用被标记的参考对照的被赋值的HbA1c百分比参考值(e)，根据表1B计算三个系列中的每个血样的HbA1c百分比(g)，并且结果显示在表2中。正如先前所定义的，血样的HbA1c百分比(g)是细胞HbA1c百分比平均值。如上所述，第一个系列血样被用于将参考值赋值给参考对照，因此，第一个系列的HbA1c百分比在评估中被计算为对照组。

表2.三个系列样品的样品HbA1c百分比的计算

为了证明被标记的参考对照的实用性，在不使用被标记的参考对照的情况下进行HbA1c百分比的相似确定。在第一个系列中，通过使用它们的平均值(a)和20个反向转换的参考实验室数值的平均值(c^反向转换)，根据公式(f)＝(c^反向转换的平均值)/(a的平均值)，使20个经校正的FS/SS数值归一化；通过(f)的转换计算(g)。将第一个系列的归一化因子用于第二个和第三个系列中，获得下列结果，并且与使用了被标记的参考对照的三个系列的结果进行比较(表3)。

此外，将第一个系列作为参考，并且在有和没有使用被标记的参考对照作为内部对照的情况下，计算第二个和第三个系列的数据，所获得的HbA1c百分比数值的平均值比上参考实验室的数值的比率被获得，并且显示在表4中。表3.三个系列血样的HbA1c百分比平均值

系列	没有内部对照的平均值	有内部对照的平均值	参考实验室数值
				1	7.09	7.14	7.13
2	7.05	7.91	8.05
				3	8.10	7.89	7.85

表4.

系列	没有内部对照的比率	有内部对照的比率
			1	1.0	1.0
2	0.88	0.98
			3	1.03	1.01

此外，没有内部对照时三个系列的结果的标准偏差是0.079，而有内部对照时三个系列的结果的标准偏差是0.015。实施例8使用参考对照在HbA1c百分比的测定中校正组内分析误差

为了分析组内分析误差，进一步分析从实施例7中三个系列血样获得的数据被。

使用本发明方法得到的HbA1c百分比，在使用和不使用被标记的参考对照作为内部对照的情况下，对参考实验室报告的HbA1c百分比进行绘图，如图6A至图6F所示。图6A和图6B显示了第一个系列血样的相关曲线。图6C和图6D、以及图6E和图6F分别显示了第二个系列和第三个系列的相关曲线。在这些图之中，图6A、6C和6E显示了在没有使用内部对照的情况下，使用本方法所得到的HbA1c百分比的相关曲线。图6B、6D和6F显示了在使用内部对照的情况下，使用本方法所得到的HbA1c百分比的相关曲线。

画出每个试验通过原点的最好的拟合直线。相关曲线的相关系数(r²)和斜率(y)显示在图5中。截距(x)是零。表5.

系列	r²	r²	y	y
						没有内部对照	有内部对照	没有内部对照	有内部对照
1	0.9469	0.9609	0.9872	0.9972
					2	0.8075	0.9661	0.8589	0.9796
3	0.8662	0.9275	1.0270	1.0026

结果显示，使用本方法，使用被标记的参考对照作为内部对照所获得的血样HbA1c百分比与来自于现有的参考方法的结果之间的相关性相比于没有使用内部对照所获得的结果要好得多。因此，使用该内部对照提高了组内分析一致性。

虽然本发明被详细描述，并且通过附图被显示在附图中，但这些描述不应当被理解为是对本发明范围的限制，而应理解为它的优选实施方式的示范。很明显，在上面说明书所描述的、和附后的权利要求、以及它们的法律上的等同体中所定义的本发明的精神和范围内，可以进行不同的修饰和改变。

Claims

1.一种用于在流式细胞分析仪上进行逐一细胞分析的参考对照，其包含由被渗透的血细胞制成的细胞类似物和悬浮介质，所述血细胞内含有聚集的胞内蛋白质和一个以上被保留的该胞内蛋白质的抗原位点，具有可渗透抗体的细胞膜，所述参考对照被冷冻。

2.如权利要求1所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物在解冻后仍保持所述一个以上被保留的所述蛋白质的抗原位点。

3.如权利要求1所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物由具有正常或者异常水平的所关注抗原的个体的血细胞制成。

4.如权利要求3所述的参考对照，其特征在于，所述个体是哺乳动物、鸟或者爬行动物个体。

5.如权利要求1所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物是由被渗透的红细胞制成的红细胞类似物，所述被渗透的红细胞含有一个以上血红蛋白变体的被保留抗原位点。

6.如权利要求1所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物进一步包含与所述被渗透的血细胞中一种以上细胞成分相结合的细胞标记物。

7.如权利要求6所述的参考对照，其特征在于，所述细胞标记物是荧光染料。

8.如权利要求7所述的参考对照，其特征在于，所述荧光染料是羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)。

9.如权利要求8所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物是由被渗透的红细胞制成的红细胞类似物，所述被渗透的红细胞含有一个以上血红蛋白变体的被保留抗原位点。

10.如权利要求9所述的参考对照，其特征在于，所述细胞类似物和所述悬浮介质被冷冻，在解冻后，所述细胞类似物仍保持所述一个以上血红蛋白变体的被保留抗原位点。

11.一种制备参考对照的方法，其包括：

(a)将渗透试剂与血细胞相混合，温育所形成的渗透混合物足够长的一段时间，足以使胞内蛋白质在保持其抗原位点的同时在所述血细胞内发生聚集，并足以渗透细胞膜，并使所述细胞膜可渗透抗体；

(c)向所述渗透混合物中添加中和试剂来抑制所述渗透剂的进一步反应；

(d)用洗涤液洗涤被渗透的血细胞，以便除去所述渗透试剂和中和试剂；以及

(e)在保藏溶液中悬浮所述被渗透的血细胞，以便形成类似物悬浮液。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，进一步包括冷冻所述类似物悬浮液。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血细胞是红细胞，所述方法进一步包括：在将所述渗透试剂与所述红细胞混合前，将球形化试剂与所述红细胞相混合，以使所述红细胞呈球形。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血细胞是白细胞。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血细胞收集自具有异常水平的所关注抗原的个体的血液。

16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，进一步包括：在将所述渗透试剂与所述血细胞混合前，将所述血细胞与膜可渗透荧光染料一起温育足以使所述荧光染料结合至一种以上细胞成分的时间。

17.如权利要求16所述的参考对照，其特征在于，所述荧光染料是羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，所述一种以上细胞成分是细胞蛋白质。

18.一种使用参考对照用于在流式细胞分析仪上测定血样中细胞血红蛋白的方法，其包括：

(a)提供含有红细胞类似物的参考对照，所述红细胞类似物由内含有聚集的胞内蛋白质的经处理红细胞制成，所述参考对照具有细胞血红蛋白参考值；

(b)在所述流式细胞分析仪上逐一细胞地测定所述参考对照中的所述红细胞类似物的侧向角散射信号；以及

(c)使用测得的侧向角散射信号和所述参考对照的所述参考值来确定待测定样品中单个红细胞的细胞血红蛋白。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

将所述参考对照与渗透试剂混合；

随后添加含有对血红蛋白变体特异的经荧光标记的抗体的中和试剂，并允许所述抗体结合至所述红细胞类似物内的所述血红蛋白变体；

逐一细胞地测定所述参考对照中的所述红细胞类似物的荧光信号，连同测定所述侧向角散射信号；以及

使用测得的荧光信号和测得的侧向角散射信号、以及所述参考对照中的所述血红蛋白变体的参考百分比值，来确定待测定样品中单个红细胞的所述血红蛋白变体。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白变体包括糖化血红蛋白、胎儿血红蛋白或者异常形式的血红蛋白。

21.一种使用参考对照用于在流式细胞分析仪上测定血样中细胞血红蛋白的方法，其包括：

(a)将一定体积的血液与渗透试剂相混合，以便形成第一样品混合物；

(b)将含红细胞类似物并具有细胞血红蛋白参考值的参考对照添加至所述第一样品混合物中，所述红细胞类似物由经处理的红细胞制成，所述经处理的红细胞内含有聚集的胞内蛋白质和被保留的血红蛋白变体的抗原位点、并且具有可渗透抗体的细胞膜，所述红细胞类似物包含与细胞蛋白质结合的荧光染料；

(c)随后添加中和试剂，以便形成第二样品混合物；

(d)在所述流式细胞分析仪上，逐一细胞地测定所述血液中所述红细胞和所述参考对照中所述红细胞类似物的侧向角散射信号和第一波长处的荧光信号；

(e)使用在所述第一波长处测得的荧光信号，将所述血液中的所述红细胞从所述参考对照中的所述红细胞类似物中区分开来；以及

(f)使用测得的所述红细胞和所述红细胞类似物的侧向角散射信号、以及所述参考对照的所述细胞血红蛋白参考值，来确定所述红细胞的细胞血红蛋白。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，进一步包括：

在步骤(a)中所述血液与所述渗透试剂混合之前，将所述血液与核酸染料相混合，以便染色RNA；

在步骤(e)中，使用在所述第一波长处的所述荧光信号，将网织红细胞从所述血液中的成熟红细胞中以及从所述红细胞类似物中区分开来；以及

在步骤(f)中，使用所述侧向角散射信号和所述参考对照的所述细胞血红蛋白参考值，确定所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的细胞血红蛋白。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述中和试剂进一步包含对所述血红蛋白变体特异的经荧光标记的抗体，所述方法进一步包括：

在步骤(c)中，温育所述第二样品混合物，以允许所述被标记的抗体结合至所述血液的所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的所述血红蛋白变体、以及所述参考对照的所述红细胞类似物中的所述血红蛋白变体；

在步骤(d)中，逐一细胞地测定所述血液的所述网织红细胞和所述成熟红细胞在第二波长处的的荧光信号、以及所述参考对照的所述红细胞类似物在第二波长处的荧光信号，连同测定所述侧向角散射信号和在第一波长处的所述荧光信号；以及

在步骤(f)中，使用在所述第二波长处的荧光信号和所述侧向角散射信号、以及所述参考对照的所述血红蛋白变体百分比的参考值，分别确定所述网织红细胞和所述成熟红细胞中的所述血红蛋白变体的细胞百分比。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白变体包括糖化血红蛋白、胎儿血红蛋白或者异常形式的血红蛋白。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光染料是羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。

26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸染料是吖啶橙。

27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光标记抗体是单克隆抗-Hb_A1c-A1exa Fluor 647抗体。