KR100258394B1 - 전혈 속의 망상 적혈구를 동정하고 특성화하는 방법 및 이에 사용하는 시약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액 샘플중 망상 적혈구를 염색 하기 위한 유기 양이온성 염료 및 약 6 내지 약 9의 pH를 유지하기 위한 완충액을 포함하는 시약 조성물을 사용하여 망상 적혈구 및 성숙한 적혈구 세포를 특성화하고 판별하는 방법에 관한 것이다. 염료는 적색 여기성 형광 염료인 옥사진 750 또는 청색 여기성 형광 염료인 아크리딘 오렌지 또는 이의 유도체일 수 있다. 쯔비터 이온성 계면활성제가 망상 적혈구 및 적혈구의 등용적 측정적 구형화를 수행하기 위해 시약 조성물중에 포함되고, 시약 조성물 및 전혈 샘플 혼합물을 유동 혈구 계산기의 감지 영역을 통해 통과시키는 경우, 각각의 세포에 의해 적어도 하나의 각도 간격을 통해 산란되고 형광화된 광이 측정되고, 적혈구는 망상 적혈구로 부터 판별되며, 각각의 망상 적혈구 또는 적혈구의 용적, 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량 및 망상 적혈구 및/또는 적혈구의 평균 세포 용적, 평균 소체 헤모글로빈 농도 및 평균 세포 헤모글로빈은 측정된 나란한 세포 용적 및 헤모글로빈 농도로 부터 계산된다.

Description

전혈 속의 망상 적혈구를 동정하고 특성화하는 방법 및 이에 사용하는 시약 조성물
제1a도 내지 제1e도는 본 발명의 원리를 실행하기 위한 산란/형광 유동 혈구 계산기의 조명 광학장치, 탐지 광학장치 및 탐지 시그날 프로세싱 시스템(detection signal processing system)을 각각 나타내는 도면이다.
제2a(1)도 및 제2b(1)도는 광 산란 대 형광의 사이토그램이고, 제2a(2)도 및 제2b(2)도는 실시예 1에 따라 각각 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드(AOEOH)와 옥사진 750으로 염색된 망상 적혈구를 함유하는 전혈 샘플에 대한 적색광 소각 산란 대 적색광 광각 산란의 사이토그램이고, 제2c도는 망상 적혈구와 적혈구의 헤모글로빈 농도(HC) 대 용적(V)의 사이토그램으로, "+"는 망상 적혈구를, " ■"는 적혈구를 나타낸다.
제3a도 및 제3b도는 실시예 2에 따라 NCCLS법을 참조로 각각 AOEOH와 옥사진 750 시약을 이용하여 전혈 샘플 속에서 탐지되는 망상 적혈구의 백분율을 비교한 도면이다.
제4a도 및 제4b도는 실시예 3에 따라 TECHNICON H*1 Jr.방법을 참조로 AOEOH 함유 시약으로 염색된 망상 적혈구에 대한 평균 적혈구 용적(MCV) 데이타와 평균 소체 헤모글로빈 농도(MCHC) 데이타의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
제5a도 및 제5b도는 실시예 4에 따라 TECHNICON H*1 Jr.법을 참조로 옥사진 750 함유 시약으로 염색된 망상 적혈구에 대한 MCV 데이타와 MCHC 데이타의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
제6a도 및 제6b도는 실시예 5로부터 수득한 데이타를 도시하는 사이토그램이다.
본 발명은 전혈 샘플 속의 세포를 동정하고 특성화하는 데 사용하는 시약 조성물 및 이의 용도에 관한 것이고, 더욱 특히 광 산란 및 형광 유동 혈구 계산법으로 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 동정하는 동시에 각각 다량의 망상 적혈구와 적혈구의 용적 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량을 측정하는 데 사용하는 시약 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
모든 고등 동물에서, 혈액은 다양한 종류의 현탁된 소체(corpuscle)들(적혈구, 백혈구 및 혈소판)이 존재하는 수성 체액부(혈장)로 구성된다. 혈장은 대략 90%의 물, 9%의 단백질, 0.9%의 염 및 기타 미량의 물질(예: 당, 요소, 요산 등)로이루어진 조성물이다.
말초혈(즉, 골수밖의 혈액)의 세포 또는 소체는 두 가지 주요 그룹, 즉 적혈구(이의 최우선 임무는 산소를 운반하는 것이다)와 백혈구(이의 최우선 기능은 면역계와 관련되어 체내에 대한 외래 물질을 파괴하는 데 관여한다)로 나누어진다. 당해 두 가지 주요 그룹 이외에, 혈액은 또한 지혈시 중요한 소위 혈소판을 함유한다.
적혈구 성숙의 최종 단계는 이들이 골수로부터 방출된 후 말초혈에서 순환하고 있는 동안에 일어난다. 이러한 미숙한 적혈구 또는 "망상 적혈구"는 핵을 상실하고 따라서, 분열능 또는 리보핵산(RNA) 합성능을 상실한다. 이러한 기능은 소멸됨에도 불구하고, 망상 적혈구는 여전히 대사적으로 활성이며 단백질을 합성할 수있고 헴(heme)의 합성을 위해 철을 흡수할 수 있고, 에너지-풍부 상태를 유지하기위해 요구되는 필수적인 대사적 반응을 수행할 수 있다. 이들 세포는 대개 이들을양이온성 염료 용액에 노출시켜 양이온성 염료와 망상 적혈구 속의 음이온성 RNA가 반응하여 망상 적혈구 속의 섬세하게 염색되거나 조악하게 염색된 "망상물(reticulum)" 속으로 침전되어 성숙한 적혈구와 가장 쉽게 구별되고, 이러한 특성으로 망상 적혈구로 명명되었다.
망상 적혈구는 정상적으로 전체 적혈구 집단의 약 0.5 내지 2%를 차지하지만, 이러한 함량은 비정상적인 조건하에서 극적으로 변할 수 있다. 예를 들어, 망상 적혈구의 계수(count)는 혈액 질환(dyscrasias)을 연구하는 데 있어서 진단 보조제로서, 출혈(hemorrhage)에 따른 적혈구 재생의 지표로서, 또한 특정 악성 질환의 화학 요법에서 초기 독성을 탐지하는 데 있어서 다년간 사용되어 왔다.
핵산(RNA 및 DNA)은 실질적으로 어떠한 양이온성 염료로도 염색될 수 있는 다가 음이온이다. 망상 적혈구 속의 RNA는 단지 몇개의 양이온성 염료[브릴리언트크레실 블루(Brilliant Cresyl Blue, BCG), 뉴 메틸렌 블루(New Methylene Blue, NMB), 오라민 O(Auramine O, AuO), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange, AO), 티아졸오렌지(Thiazole Orange, TO) 및 피로닌 Y(Pyronine Y, PY)]만으로 염색될 수 있다. 당해 염료 중에서, 단지 일부 염료만이 세포로 급속히 침투되어 염색시킬 수 있다. 이러한 염료는 NMB 및 AO를 포함한다. 망상 적혈구의 염색 속도와 염색도는 염료의 세포의 농도, 망상 적혈구 막을 통한 염료의 침투속도, 및 양이온성 염료와 망상 적혈구 RNA사이의 특이결합상수의 세기에 따라 다르다. 후자의 두 가지 특성은 상이하며 각 염료에 대해 쉽게 예측할 수 없으므로, 시행 착오를 통해야만 유용한 망상 적혈구 염색물을 찾을 수 있다. 모든 양이온성 물질이 온전한(intact) 적혈구(및 망상 적혈구) 막을 침투할 수 있는 것은 아니며 필수적으로 양이온을 동반하는 음이온의 성질이 양이온성 물질이 급속히 또는 느리게 침투하거나 또는 전혀 침투하지 않거나 하는 여부에 영향을 미칠 수 있다. 소수성 분자가 일반적으로 친수성 분자보다 빨리 적혈구 막으로 침투하며 작은 분자가 일반적으로 큰 분사보다 빨리 막을 침투한다. 망상 적혈구를 염색할 수 있는 양이온성 염료와 혼합된 염 또는 완충액의 일부만이 신속하게 염색되도록 한다. 즉, "잘못된" 완충액과 함께 "옳은" 염료를 사용하면 망상 적혈구의 염색을 "끝이 없이" 행할 수 있다. 또 다시, 망상 적혈구를 염색하는 혼합물의 유용한 제형물을 발견하기 위해 시행착오가 필요하다. 따라서 안내자로서 사용될 수 있는 다양한 "법칙"에도 불구하고, 어떤 조건하에서 어떤 특수한 양이온성 염료가 신속하게 침투하여 망상 적혈구를 염색할 수 있는지를 사전에 예측하는 것은 아직까지 불가능하다.
유동 혈구 계산법의 기본 개념은 필수적으로 한번에 하나씩 특수 감지 영역을 통해 세포들을 통과시키는 것이다. 전형적으로, 유체역학을 이용하여, 산란광, 흡광 또는 형광성 광을 측정하기 위한 집속된 광원 및 탐지 시스템으로 구성된 감지 영역을 통해 단일 세포를 통과시킨다. 광을 차단하는 입자의 효과를 여러 방법으로 탐지할 수 있다. 일반적으로, 입자는 입자가 현탁되어 있는 매질의 굴절률과는 다른 굴절률을 갖는다. 그러므로, 입자는 굴절률 차이, 입자의 크기, 입자 형태, 및 굴절률 및 구조에서의 내부 변수, 및 조명광의 파장에 따라 강도를 변화시키면서 조명 광을 일정 범위의 각도로 산란시킬 것이다[동일한 구에 대해서, 미에산란 이론(Mie Scattering Theory)은 산란광의 분포 및 조도에 대한 완전한 설명을제공해 준다]. 또한, 입자는 특정 입사광을 흡수할 수 있다. 후자의 경우, 흡수된 광의 일부는 전형적으로 이의 파장보다 더 긴 파장에서 형광으로서 재방출될 수 있다.
위의 효과와 기타 효과는 산란광, 비산란광 및 형광 광의 상이한 각도 간격을 측정하도록 배열된 광 탐지기로 측정할 수 있다.
입자가 세포만큼 작으면, 전형적으로 직경 15㎛ 이하로 작으면, 고속(전형적으로 초당 간격이 넓은 세포 100 내지 1000개) 통과에 의해 영향받는 조명 빔 속의 광자 수는 특히 초당 현탁 스트림의 조명된 부분에 닿는 광자 수에 비해 [그리고 흡광 탐지기(및 심지어 형광 탐지기)의 백그리운드 소명에 비해] 매우 작다. 그러므로, 입자들간의 작은 특정 차이의 탐지 감도의 한계는 결정적으로 광자 유동(이는 적어도 광원의 고유 "광도"에 좌우된다) 및 입자들간의 기타 크고 작은 차이에 의해 발생되는 광자 유동의 동요가 얼마나 큰가에 좌우된다.
흡광, 산란 및 형광 유동 혈구 계산법에서 간섭 노이즈(noise)의 주요 공급원은 각 종류의 시그날에 대해 매우 상이할 수 있다. 제1 접근법으로, 염색되거나염색되지 않은 세포로부터의 형광 시그날의 크기는 시그날을 발생시키는 세포의 모양 또는 배향에 의해서는 거의 영향받지 않는 반면, 산란 및 흡광 시그날은 세포의모양과 배향에 매우 크게 영향을 받는다. 극단적인 예로서, 양쪽이 오목한 사람적혈구의 모양은 이들이 발생시키는 흡광 및 산란 시그날에 중요한 영향을 미치며, 전형적으로 염색된 망상 적혈구의 작은 흡광 시그날보다 그 효과가 크다. 이것이,본원과 동시에 출원되고 본 발명의 양수인에게 양도된 "전혈 속의 망상 적혈구를 동정하고 특성화하는 데 사용하는 시약 조성물 및 이의 용도"란 명칭의 미합중국 특허원에 기술된 계류중인 발명 이전에, 흡광 유동 혈구 계산법이 망상 적할구 계산 또는 일반적으로 세포내 저농도의 흡광 분자를 측정하기 위해 유용하지 않은 주된 이유이다. 한편, 세포 속의 약한 형광 물질 또는 세포 주위의 매질 속에 있는,예를 들어, 결합되어 있지 않은 형광 물질은 흡광 또는 산란 시그날에 거의 영향을미치지 않는다.
그러나, 형광 유동 혈구 계산법에서, 광원이 충분히 강하고 표류광(stray light)과 시스템 형광이 최소화된 경우, 염색되지 않은 세포로부터 염색된 세포를선택적으로 구별하기 위한 감지능의 한계는 염색되지 않은 세포내 성분으로부터의 외관상 "백그라운드 형광"의 상대적 크기 및/또는 염색된 세포 및 염색되지 않은 세포 주위의 샘플 스트림 속의 매질의 형광 수준에 의해 결정된다. 망상 적혈구가염색되면, 세포 주위의 샘플 스트림 속의 용액에는 항상 어느 정도의 염료 농도 평형이 이루어진다. 망상질 RNA에 대한 결합 정도가 일정한 경우, 망상질-결합 염료에 대한 외부 염료의 비는 RNA에 대한 염료의 특이 결합 상수가 증가함에 따라 감소된다. 그러므로, 결합상수가 클수록, 필요한 외부 염료 농도는 낮고, "백그라운드" 시그날은 낮고, 노이즈에 대한 시그날은 높다. 또한, 결합되지 않은 염료의 형광 효율이 망상질-결합 염료의 형광 효율보다 낮은 경우, 노이즈에 대한 시그날이 개선된다. 사실상, AuO, TO 및 티오플라빈 T를 이용하는 방법은 결합 형광 효율과 비결합 형광 효율의 차이에 의존적이다. 그러나, 이후에 기술되는 바람직한 방법은 달성되는 노이즈에 대한 높은 시그날을 달성하기 위한 큰 특이 결합 상수에 의존하고 어떤 경우에서는 긴 파장(적색)에서의 염색되지 않은 세포의 보다 낮은 비특이 형광에 의존한다.
전혈의 항응고 샘플 속의 망상 적혈구의 함량을 계산하는 데 사용할 수 있는수개의 반자동화 방법이 이용가능하다. 기존의 각각의 방법에서, 유기 양이온성 염료, 예를 들어, AO, AuO 또는 TO를 함유하는 희석제를 사용히여 망상 적혈구 속의 RNA를 염색할수 있다. 염료는 세포막을 통과하여 RNA에 결합하고 대개는 각각의 망상 적혈구 속에 "망상질"로 침전된다. 염색된 RNA로부티의 시그날의 양은 대략적으로 RNA 함량에 비례한다. 적당한 염색 후, 적당한 여기 광원(전형적으로 488nm에서 방사되는 아르곤 이온 레이저) 및 방사 탐지 시스템을 갖춘 형광 유동혈구 계산기를 사용하여 유출액 속의 망상 적혈구의 함량을 측정할 수 있다.
형광 염료와 유동 혈구 계산법을 사용하여 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 분별하는 예시적 방법이 특허문헌에 기재되어 있다.
예를 들어, 아담스(Adams) 및 카멘쯔스키(Kamentsky)에게 허여된 미합중국 특허 제3,684,377호에는, 사람 혈액에 대한 pH 인자 및 중량 몰삼투압 농도가 정상생리적 범위내에 있는 AO 수용액을 포함하는 분별 혈액 분석용 염료 조성물이 기재되어 있다. 이 염료 조성물은 적혈구의 산란 시그날을 사용하여 형광 시그날의 존재 또는 부재를 측정함으로써 망상 적혈구를 계산하는 데 사용될 수 있다.
아담스에게 허여된 미합중국 특허 제3,883,247호에는, 농도기 10-6내지 1O-5g/㎖인 AO를 포함하는 염료 조성물을 사용하는, 아담스 및 카멘쯔스키의 방법과 유사한 방법이 기재되어 있다.
나탈레(Natale)에게 허여된 미합중국 특허 제4,336,O29호에는, 약 7.4의 pH 및 등장성 중량 몰삼투압 농도의 염료 AO, 시트레이트 이온 및 파라포름알데하이드의 수용액을 포함하는 시약 조성물이 기재되어 있다. 다양한 성분의 농도는 망상 적혈구 및 혈소판의 염료 흡수를 최대화하도록 선택되고 혈액 샘플 및 시약 조성물이 혼합되는 2 내지 5분 이내에 염료가 흡수되도록 제공된다. 나탈레 시약(Natale reagent)을 이용하여 혈소판과 망상 적혈구를 탐지하는 자동화 방법은 거쉬만(Gershman) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,325,706호에 기재되어 있다.
세이지(Sage) 2세에게 허여된 미합중국 특허 제4,707,451호에 기재되어 있는시약 속에서, 망상 적혈구는 티오플라빈 T 또는 크리사닐린으로 염색된다. 전혈샘플은 등장성 염수 용액 속의 염료(0.2㎎/㎖)의 25㎕ 분취량을 항응고 전혈 10㎕와 혼합하고 약 7분 동안 항온처리함으로써 효과적으로 염색되는 것으로 밝혀졌다.
리(Lee) 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,883,867호에는 RNA 또는 DNA를 염색하기 위한 염료조성물이 기재되어 있다. 염색용 조성물은 바람직한 염료 화합물로서 TO를 포함한다. 망상 적혈구는 30분의 최소 시간내에 염색된다.
유동 혈구 계산법으로 망상 적혈구를 계산하기 위한 시약이 쿠로다(Kuroda)에게 허여된 미합중국 특허 제4,971,917호에 기재되어 있는데, 이 시약은 형광 유동 혈구 계산법으로 분석되는 경우, 성숙한 적혈구가 망상 적혈구로 잘못 계산되는것을 방지하기 위해 염료(예: AuO)에 의한 성숙한 적혈구의 비특이적 염색을 감소시키는 카보네이트 염을 함유한다.
미합중국 특허 제4,981,803호에는,2개의 용액, 즉 염료 AuO가 비수성 용매에 용해되어 있는 염색을 위한 스톡 용액과 최적 염색 조건을 만족시키는 완충 용액을 포함하는 망상 적혈구 계산용 시약이 기재되어 있다.
AuO를 포함하는 형광 유동 혈구 계산법을 위한 또 하나의 망상 적혈구 염색시약이 쿠로다 등에게 허여된 미합중국 특허 제4,985,176호에 기재되어 있다. 이 참조문헌은 어느 경우에서나 시약과 샘플의 항온처리 시간을 30초 내지 20분으로 교시하고 있다.
위에 명시한 바와 같이, 단지 일부 양이온성 염료만이 망상 적혈구를 선택적으로 염색하며, 이들 중에서 일부 염료만이 망상 적혈구를 급속히 침투한다. 본 발명의 양이온성 염료 화합물은 5분 이내에 망상 적혈구를 염색하므로, 혈액 샘플과 시약 조성물을 혼합한 후 즉시 유동 혈구 계산법에 의한 망상 적혈구 분석을 수행할 수 있어서 본 발명은 자동화 과정에 용이하게 사용될 수 있다.
망상 적혈구를 정량하기 위한 4급화된 AO 유도체가 본원에 참고로 인용되어있는 계류중인 판(Fan) 및 피셔(Fischer) 등의 미합중국 특허원 제07/444,255호(1989.1.12)[발명의 명칭: "Compounds and Reagent Compositions and Their Use in the Quantitative Determination of Reticulocytes in Whole Blood"]에 기재되어 있다. 판 등의 시약은 파라포름알데하이드와 칼륨 옥살레이트를 포함하는 완충 용액 1㎖당 AO 유도체를 1O-6g 포함한다. 이러한 시약 조성물은 망상 적혈구를 염색하여 혈액 샘플 속의 망상 적혈구의 정량적 형광 유동 혈구 계산 분석을 가능하게 해준다. 당해 시약 및 위에 언급된 시약 중의 어떤 것도 다음에 논의되는 배향 노이즈 문제를 방지하는 구형화제(sphering agent)를 함유하지 않으며 어떤 것도 기타 진단학적으로 중요한 파라메터, 예를 들어, 세포/세포를 기초로 한 망상 적혈구와 적혈구의 용적 및 헤모글로빈 농도의 동시 측정을 허용하지 않는다. 사피로(Shapiro)와 스티븐스(Stevens)는 옥사진(0xazine) 750을 사용하여 유동 혈구 계산법으로 DNA 함량을 측정하는 방법을 기재하고 있다[참조: Flow Cytometry of DNA Content Using Oxazine 750 or Related Laser Dyes With 633nm Excitation Cytometry, Vo1 7, pp. 107-110(1986)]. 세포는 10㎛ 내지 30㎛의 옥사진 750으로 염색되고 DNA 측정을 위한 에탄올의 첨가로 고정된다. 사피로와 스티븐스는 옥사진 750이 세포 속의 RNA를 염색하는 것 같지 않다고 주장한다. 더우기, 옥사진 750을 사용한 이러한 원안은 망상 적혈구 계산 또는 기타 진단학적으로 중요한 적혈구 파라메터, 예를 들어, 세포/세포를 기초로 한 용적과 헤모글로빈 농도의 동시 측정을 허용하지 않는다.
위에서 인급한 바와 같이, 사람 및 많은 기타 포유동물의 적혈구는 양쪽이 오목한 디스크 모양을 하고 있다. 이러한 비대칭성 적혈구에 의해 산란되는 광의 양은 세포의 배향에 따라 변한다. 따라서, 두 개의 동일한 적혈구는 감지 영역에서의 배향이 동일하지 않다면 이들이 감지 영역을 통과할 때 매우 상이한 산란광 시그날을 생성시킬 것이다. 소량의 염색된 망상질 중 하나에 존재하는 경우를 제외하고는 동일한 두 개의 적혈구는 이들의 상이한 배향 때문에 산란광 탐지기에 대해 일반적으로 큰 시그날 차이를 나타낸다.
킴(Kim) 및 오른스테인(Ornstein)에게 허여된 미합중국 특허 제4,575,490호 및 제4,412,004호에는 유동 혈구 계산기로 적혈구의 용적 측정시 배향 노이즈를 제거하는 방법이 교시되어 있다. 이들의 방법은 염색되지 않은 적혈구의 등용적 구형화(isovolumetric sphering)를 수반하여 세포 사이의 특정 배향 차이를 제거함으로써 더 정밀하고 정확하게 세포 용적을 측정할 수 있다. 각 적혈구는 양쪽이 오목한 모양으로부터 계면 활성 구형화제에 의해 완전한 구형으로 전환된다. "완충" 단백질 및/또는 알데하이드 고정제를 구형화제와 함께 사용하여 적혈구의 용혈을 방지한다. 킴 및 오른스테인에 의해 기술된 음이온성 계면활성제는 망상질을 염색하고 침전시키기 위해 사용된 양이온성 염료와 급속히 반응하여 침전시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 망상적혈구 염색물과 함께 사용될 수 없다.
틱코(Tycko)에게 허여된 미합중국 특허 제4,735,504호에는, 항응고 전혈 샘플 속의 적혈구에 대한 개별적 및 평균 적혈구 용적(MCV), 및 개별적 및 평균 소체 헤모글로빈 농도를 측정하기 위한 완전히 자동화된 방법과 수단을 제공하는 유동혈구 계산기인 TECHNICON H*1 시스템의 적혈구 채널이 기재되어 있다. 이 방법에서, 2㎕ 분취량의 젼혈 샘플 속의 적혈구는 우선 희석된 다음 위에서 기술한 킴과 오른스테인 방법을 사용하여 등용적으로 구형화된다. 20초 동안의 항온처리후, 이 세포는 분석기의 적혈구 채널 속의 조명된 측정 영역을 통해 필수적으로 한번에 하나씩 통과한다. 두 개의 별도의 각도 간격으로 당해 세포에 의해 산란된 광의 크기가 측정된다. 광원 및 탐지각의 선택은 이 특허원에서 중요하다. 광원이 633nm에서 광을 방사하는 헬륨 네온 레이저인 경우, 두 개의 산란광 집광 각도 간격은 2 내지 3도(2°내지 3°) 및 5 내지 15도(5°내지 15°)이다. 각각의 간격으로 산란된 광의 크기가 세포에 대해 알려지면, 그 세포에 대한 용적과 헤모글로빈 농도는 미에 산란 이론에 의해 예상되는 값과 비교하여 결정된다. 각 세포에 대한 용적(V)과 헤모글로빈 농도(HC)는 기억장치에 저장되고 MCV 및 MCHC는 틱코(Tycko)의 특허에서 논의된 바와 같은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 의해 샘플 측정 주기의 완결시 계산된다. V와 HC의 분포 사이토그램 및 V와 HC의 히스도그램은 상기 계산을 사용하여 작성된다.
위의 어떤 방법도 망상 적혈구와 비망상 적혈구를 구별하지 못하고, 위에서기재하고 실행된 방법들은 망상 적혈구와 적혈구의 진단학적으로 중요한 파라메터, 예를 들어, 세포/세포를 기초로 한 용적과 헤모글로빈 농도를 별도로 측정하기 위해서는 사용될 수 없다.
유동 혈구 계산기를 사용한 망상 적혈구 계산을 모니터링하는 데 있어서 또하나의 난점은 망상 적혈구 탐지 시그날, 성숙한 적혈구 시그날 및 시스템 노이즈를 분별하는 데 어려움이 있다는 점이다. 염색된 RNA 스트랜드는 미숙한 망상 적혈구에 많이 존재하며, 유동 혈구 계산기로 탐지하면, 비교적 큰 크기의 시그날을 발생시킨다. 그러나, 보다 성숙한 세포는 덜 염색된 RNA를 함유하여 유동 혈구 계산기 측정 시스템의 노이즈에 의해 차단될 수 있는 보다 작은 시그날을 발생시킨다.
광 산란 및 흡광 또는 형광 유동 혈구 계산법에 의해 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 동정하는 동시에, 망상 적혈구와 적혈구의 용적, 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량을 개별적으로 측정하기 위한 방법 및 시약에 대한 필요성이 대두되었다.
본 발명자들은 망상물을 염색하기 위해 널리 공지된 다양한 기술로 양이온성 염료를 사용하고자 하는 전제를 가지고 출발하였다. 또한, 형광을 이용하여 망상 적혈구를 탐지할 수 있는 유동 혈구 계산법을 개발하는 데 관심을 가지고 있었다. 또한, 등용적 구형화법 및 틱코 방법을 이용함으로써, 형광법에 있어서 선택적으로 망상 적혈구를 염색하는 시약을 사용하여 세포/세포를 기초로 한 망상 적혈구와 성숙한 적혈구의 용적과 헤모글로빈을 동시에 측정할 수 있다고 기대했었다(주: 구형화가 이루어지나, 등용적이 아니고 등장성에 대해 일부 공지 인자 X가 있는 경우,용적에 대한 1/X에 의한 보정 및 단백질(예: 헤모글로빈) 농도에 대한 X에 의한 보정을 사용하는 틱코 방법을 이용하여, 최초의 값이 계산될 수 있다).
틱코의 방법을 이용하기 위해서는, 헤모글로빈이 매우 투명한 영역에서 단색광을 방출하는 광원이 필요한데, 전형적으로 적색 헬륨 네은(HeNe) 레이저, 또는 훨씬 더 긴 파장의 레이저와 같은 광원이 있다. 이는 파장을 흡광도 측정용으로도사용하고자 하는 경우 염료가 적색광을 강하게 흡수하는 청색 염료이어야 함을 의미한다.
동일한 염료가 형광을 위해 사용되는 경우, 이것은 합리적으로 높은 광자 효율 및 스톡 이동(Stoke's Shift) 및 높은 결합 상수를 가짐에 틀림없으므로 스트림형광이 형광 시그날 대 노이즈 비를 비허용적으로 감소시킬 수 없도록 충분히 낮은농도로 사용될 수 있다. 옥사진 750은 흡광/산란 방법을 위한 요구 조건 뿐만 아니라 세포/세포를 기초로 한 망상 적혈구 RNA 농도, 세포수, 성숙한 세포와 망상 적혈구 세포의 용적 및 헤모글로빈 함량을 결정하는 형광/산란 방법을 위한 요구조건도 충족시키는 것으로 밝혀졌다. 이와는 반대로, 형광 효율이 매우 낮은 NMB는 이러한 형광/산란 방법에는 적당하지 않다.
또한, 청색광으로 여기시킬 경우 녹색 내지 적색을 발하는 망상 적혈구를 염색하는 염료(예: AO, AOEOH, TO 또는 AuO)를 이용하고 488nm 또는 441nm 방사 라인을 사용한 아르곤 이온 또는 HeCd 레이저를 첨가하며 적색 레이저와 동축으로 유동세포를 조명하는 방법은 세포/세포를 기초로 한 망상 적혈구 RNA 농도, 세포수, 성숙한 세포와 망상 적혈구 세포의 용적과 헤모글로빈 함량의 동시 탐지를 허용하지만 비용 증가와 복잡성을 초래한다.
본 발명자들은 양이온성 염료와의 혼화성을 위해서, 킴과 오른스테인의 교시에 의해 제시된 적혈구 구형화제로서 비이온성, 양이온성 및 쯔비터이온성 계면활성제를 탐구하였다. 킴과 오른스테인 방법에서와 같이, 본 발명자들은 적혈구 용혈작용을 지연시키기 위한 계면활성제의 농도를 "완충"시키기 위하여 단백질(전형적으로 소 혈청 알부민)을 사용하였다. 다수의 계면활성제[예: 트리톤(Triton)X100 및 라우릴프로필아미도베타인]가 만족스럽게 작용하였다. 그 다음, 본 발명자들은 또한 라우릴프로필아미도베타인 및 기타 쯔비터이온성 계면활성제(예: DAPS 및 TDAPS)가 적혈구 용혈작용을 지연시키기 위한 단백질 완충을 필요로 하지 않으며, 킴과 오른스테인 방법을 위한 모든 종류의 혈액 세포에 대한 이상적인 대체 구형화제임을 발견하였다. 이들은 단백질 완충을 필요로 하지 않기 때문에, 제조하기에 안정하고 보다 간단한 시약이다(킴과 오른스테인의 고정 단계가 더이상 필수적인 것은 아니고, 그 대신에 단백질 함유 시약에서의 세균 성장 문제가 또한 제거된다). 이 발명은 본원과 동시에 출원되고 본 발명의 양수인에게 양도된, "세포구형화에 사용되는 시약 조성물 및 이의 용도"란 명칭의 계류중인 미합중국 특허원의 주제이다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 형광 유동 혈구 계산법으로 혈액 샘플 속의기타 세포로부터 망상 적혈구를 분별하기 위한 개선된 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 형광 유동 혈구 계산법으로 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 계수하기 위한, 위와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 적혈구와 망상 적혈구를 구형화하는 동시에 망상적혈구를 염색시키기 위한, 위와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 형광 및 산란광 유동 혈구 계산법으로 전혈 샘플속의 망상 적혈구와 적혈구의 용적, 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량을 동시에측정하기 위한, 위와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈액 샘플 속의 각각의 적혈구와 망상 적혈구를 구별하고 각각을 계수하는 동시에, 세포/세포를 기초로 한 측정치로부터 결정한 각 세포 유형의 용적, 헤모글로빈 함량, 헤모글로빈 농도, 평균 적혈구 용적, 및 평균소체 헤모글로빈 농도를 측정하기 위한, 위와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 여전히 혈액 샘플 속의 적혈구와 망상 적혈구를 구별하고 각각을 계수하는 동시에, 단일 적색 광원 레이저를 사용하여 세포/세포를기초로 한 측정치로부터 결정한 각 세포 유형의 용적, 헤모글로빈 함량, 헤모글로빈 농도, 평균 적혈구 용적, 및 평균 소체 헤모글로빈 농도를 결정하기 위한, 위와같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따라, 시약 조성물은 망상 적혈구를 염색하기 위한유기 양이온성 염료와 pH 약 6 내지 약 9를 유지하기 위한 완충 용액을 포함한다. 염료는 구조식(1)의 적색 여기성 형광 염료 옥사진 750 또는 AO 및 일반식(II)의AO의 4급화된 유도체인 청색 여기성 형광 염료일 수 있다.
상기 식에서, Y는 음이온이고, R은 독립적으로 메틸 또는 에틸 그룹이고, X는 하이드록시에틸 그룹, 또는 오르토 위치가 수소원자 또는 불소에 의해 치환되고/되거나 파라 위치가 수소원자, 불소 또는 트리플루오로메틸 그룹에 의해치환된 벤질 그룹이다.
바람직하게는, Y는 음이온이고, R은 메틸 그룹이고, X는 하이드록시에틸 그룹 또는 파라 위치가 치환된 벤질 그룹이다. 가장 바람직하게는, Y는 브로마이드 또는 요오다이드이고 X는 하이드록시에틸 그룹이다.
AO의 4급화된 유도체를 생성하는 합성 단계는 판(Fan) 등의 미합중국 특허원제07/444,255호에 기재되어 있다. 옥사진 750은 미국 오하이오주 데이톤에 소재하는 엑사이톤, 인코포레이티드(Exciton, Inc.)가 시판하고 있다. 본 발명의 바람직한 청색 여기성 염료 화합물은 3,6-비스(디메틸아미노)-10-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(2-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-트리플루오로메틸)-벤질아크리디늄 브로마이드 및 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸아크리디늄 요오다이드이다. 가장 바람직한 청색-여기성 염료 화합물은 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드(AOEOH)인데, 그 이유는 하이드록실 그룹의 친수성 때문이다.
본 발명의 시약 조성물은 약3㎍/㎖ 내지 약 12㎍/㎖(청색-여기성 형광 염색용의 4급화된 AO 유도체) 또는 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.2㎍/㎖(적색-여기성 형광 염색용의 옥사진 750)의 양으로 염료 화합물을 함유한다. 바람직하게는, 염료 화합물은 약 6㎍/㎖ 내지 약 9㎍/㎖(AOEOH) 또는 약 0.4㎍/㎖ 내지 약 0.6㎍/㎖(옥사진 750)의 양으로 존재한다.
시약 조성물의 완충 시스템은 시약 조성물의 pH를 약 6 내지 약 9로 유지시키기에 적합한 완충 용액을 함유한다. 당해 용액은 다음 성분들 중의 하나 이상을 표시된 농도로 포함할 수 있는데, KCl 또는 NaCl을 사용하여 최종 중량 몰삼투압 농도를 약 250m Osm 내지 약 330m Osm으로 조정한다.
성분 농도(mM)
KHCO3/NaHCO35-50
MgCl20-88
KCl 4-104
Na3PO40-1.5
CaCl20-0.4
바람직하게는, 당해 용액을 시약 조성물의 pH가 약 7 내지 약 8로 유지되도록 제형화하고, 제시된 농도 범위로 다음 성분들 중의 하나 이상을 포함할 수 있으며, 중량 몰삼투압 농도를 약 280m Osm 내지 약 300m Osm으로 유지시킨다.
성분 농도(mM)
트리스 0-150
K2Ox 0-121
바비탈 0-155
본 시약 조성물이 적혈구 막을 통한 염료 침투를 용이하게 하기 위한 특정음이온과 양이온을 함유해야 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 음이온에는 중탄산염, 클로라이드, 보레이트, 바비탈, 옥살레이트(Ox) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함될 수 있다. 그러나, 모든 음이온이 세포막을 통한 염료 침투를 촉진시키는 데 효과적인 것은 아닌 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 말레이트, 타르타레이트 및 포스페이트 중의 하나 이상의 음이온이 본 시약 조성물에 유일 음이온으로서 포함되는 경우, 가능할 수도 있지만, 망상 적혈구와 적혈구를 거의 구별할 수 없다. 가능한 양이온에는 칼륨, 나트륨, 트리스하이드록시메틸아미노 메탄(트리스), 또는 트리에탄올아민(TEA)이 있다.
산란/형광 유동 혈구 계산법을 이용하여 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 동정하는 데 본 시약 조성물을 사용할 수 있다. 가장 광범위한 용도에 있어서 이 방법 전혈 분취량을 상기 시약 조성물들 중의 하나와 혼합하는 단계를 포함한다. 적당한 항온처리 후, 샘플/시약 혼합물을 유동 혈구 계산기의 특이 감지 영역을 통하여 한 번에 하나의 세포씩 통과시킨다. 유체역학을 이용하여, 단일 세포를 감지영역으로 통과시키는데, 여기서 이들은 조명 파장이 적합한 집속 광원에 의해 조사된다. 산란광 시그날 중의 적어도 하나와 형광 시그날 중의 적어도 하나를 세포/세포를 기초로 하여 세포에 대해 측정한다. 이들 측정치로부터, 망상 적혈구를 적혈구와 구별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 시약 조성물은 또한 적혈구와 망상 적혈구를 등용적으로 구형화시키기 위해 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 쯔비터이온성 구형화제는 바람직하게는 알킬 아미도 베타인 또는 알킬 베타인, 예를 들어 라우르아미도프필베타인(LAB)이다.
혈액 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구를 효과적으로 등용적으로 구형화시키기 위한, 본 시약 조성물 속의 구형화제의 농도는 LAB 약 12㎍/㎖ 내지 약 87.5㎍/㎖이다.
전혈/시약 조성물 혼합물이 유동 혈구 계산기의 감지 영역을 통해 통과되는경우, 두 개의 각도 간격을 통해 산란되고 각각의 세포에 의해 형광된 광이 측정되고, 적혈구는 망상 적혈구와 구별될 수 있으며 각각의 망상 적혈구 또는 적혈구의용적과 헤모글로빈 농도가 측정될 수 있다. 망상 적혈구와 적혈구의 수, 망상 적혈구 또는 적혈구의 헤모글로빈 함량, 평균 세포 용적, 평균 소체 헤모글로빈 농도 및 평균 세포 헤모글로빈은 측정된 세포/세포 용적과 헤모글로빈 농도로부터 계산된다.
위에서 기술한 완충액 시스템의 존재하에서, RNA 염색에 필요한 시약 조성물중의 옥사진 750 또는 AOEOH의 농도는 낮은데, 즉 옥사진 750의 농도는 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.2㎍/㎖이고 AOEOH의 농도는 약 3.0㎍/㎖ 내지 약 12㎍/㎖이고, 완충액에 의해 증진된 침투력으로 인해 5분내에 망상 적혈구 속의 RNA를 염료로 염색한다. 이러한 저농도의 염료는 성숙한 적혈구의 비망상 적혈구의 염색과 스트림 형광을 최소화하여 노이즈 백그라운드로부터 양호한 시그날을 분리한다. 이러한 급속한 염색으로 인해 시약 조성물은 자동화된 방법에 매우 적합하다.
따라서, 본 발명은 이후에 기술되는 조성물 및 방법을 포함하고, 본 발명의범위는 특허청구 범위에 지시되어 있다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적과 중요한 잇점은 본원에 첨부된 도면 및이에 대한 하기 상세한 설명에 의해 명백해진다.
제1a도 내지 제1e도에는, 본 발명의 원리를 실행함에 있어서 이용될 수 있는유동 혈구 계산장치의 부품들의 양식화된 기능과 구조적 설명이 도시되어 있다. 사실상, 당해 장치는 양수인이 상표명 TECHNICON H*1로 시판하고 있는 시스템의 변형인 특정 시스템을 나타내고 있다.
당해 장치는 세포 분석을 위한 유동 혈구 계산법의 원리를 구체화한 것이며특정 유형의 소명에 대한 세포의 광 산란 및 형광 반응을 감지하는 능력을 갖는다. 본 발명에 있어서 가장 중요한 부품들만 나타내었다. 따라서, 도면에는 장치의 다양한 부품들을 구동하고 제어하는 데 필요한 모든 기계적 부품 전기적 부품, 즉 모터, 솔레노이드, 펌프, 밸브 및 센서는 도시되어 있지 않다. 이들 부품들은 모두 공지된 통상의 형태를 가지며 이는 의도하는 방식으로 샘플을 처리하기 위한 본발명에 따르는 유동 혈구 계산장치의 여러 가지 부품의 목적하는 조작방식에 관해 이후에 제공되는 정보에 관한 지식을 가진 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 용이하게 인시될 수 있다.
가장 일반적인 면에서 기술하면, 시드-스트림(sheath-stream) 유동 셀 및 지지 수압은 준비된 세포를 측정지점으로 운반한다. 세포는 유동 셀의 정방형 단면 유동 채널의 중앙인 실린더형 용적으로 제한된다. 유동 셀 구조는 하나를 제외하고는 TECHNICON H*1 시스템에서 사용된 것과 동일하다. 유동 셀 본체(flowcell body)는 유동 셀 자체로부터의 백그라운드 형광을 최소화하기 위해 (유리보다는)합성 융합 실리카로 제조된다. 수압 시스템은 매우 단순하며, 단지 두 개의 연동성 펌프와 이들과 결합된 튜브로 구성된다. 시드 펌프와 튜브는 1.6×1O-7m3/초의 속도로 시드를 운반하고, 샘플은 3.5×10-10m3/초의 속도로 전달되고 유동 셀 속의 유동 채널은 250㎛×250㎛이다. 생성되는 실린더형 샘플 스트림은 직경이 7㎛이고 속도는 2.5m/초이다.
1차적인 목적은 적혈구 분석을 위한 TECHNICON H*1 시스템에 필요한 두 개의적혈구 산란 채널 이외에 최소한, 단색 형광 측정을 지지하는 광학 시스템을 제공하는 것이다. 논의되는 바와 같이, 사용되는 광학 시스템은 세포를 염색하기 위해사용되는 특정 염료, 즉 청색 여기성 염료 또는 적색 여기성 염료에 좌우될 것이다. 산란/형광 유동 혈구 계산기의 광학 시스템은 일반적으로 두 개의 서브시스템, 즉 조명 광학 장치(a)(제1a도 또는 제1d도)와 집속 광학 장치(b)(제1b도 또는 제1e도)로 나누어질 수 있다.
제1a도에 있어서, 청색 여기성 염료용 조명 광학 장치는 일반적으로 참조번호(10)으로 나타내며 두 개의 광원을 포함한다.
헬륨-네온(HeNe) 레이저(12)는 용적과 헤모글로빈 농도 측정을 위한 적혈구 산란 측정에 필요한 633nM 및 2mW에서 광을 방사한다. 488nM 및 20mW에서 광을 방사하는 아르곤 이온 레이저(14)는 플루오로포어(fluorophore) 여기를 위해 요구된다. 3개의 연속 거울(16a), (16b) 및 (16c), 및 이색 빔스플리터(dichroic beamsplitter)(18)는 조명 시스템의 적당한 배열을 위해 필요하다. 레이저 빔은 아르곤 이온 레이저(14)로부터의 청색 광을 투과하고 HeNe 레이저(12)로부터의 적색광을 반사하는 빔스플리터(18)에서 동일 직선상에 있게 된다. 그 다음, 생성된 빔은 한 쌍의 교차된 실린더 렌즈(22)에 의해 직사각형 구경(A-1)(20)에서 타원형으로 형상화된다. A-1 구경에 근접한 실린더 렌즈(22a)의 촛점 길이는 150mm이다. 렌즈의 중심축은 구경의 긴 치수에 평행하다. 제2실린더 렌즈(22b)의 촛점 길이는 300mm이다. 높이가 89㎛이고 폭이 653㎛인 직사각형 구경은 회절-제한된 무색(achromtic) 렌즈(26)를 이용하여 유동 셀(24)로 영상화되어 측정 용적을 규정한다. 전체 배율은 약 0.25이다. 구경은 긴 치수에서는 덜 충전되고 짧은 치수에서는 과잉 충전된다. 여기서 대상물은 세포에서 세포로의 세기 변화에 기인한 오차를 최소화하기 위해 광도를 최대화하고 짧은 치수의 상에 고른 광도 분포를 유지시켜야 한다. 측정 용적은 필수적으로 모양이 타원형이고 1/e2지점에서 2O㎛(높이)×65㎛(폭)이다. 타원형의 단축은 수평면에 대해 직각인 유동 방향과 평행하다.
측정 용적을 통해 통과하는 세포는 입사 방사선을 산란시킨다. 또한, 염색된 세포는 입사 방사선을 흡수한다. 또한, 염색된 세포는 흡수되는 주파수보다 낮은 주파수에서 에너지를 방출하면서 형광시킨다. 이러한 광학 시그날은 제1b도에 도시된 포착 광학 장치에서 포착되고 탐지된다.
측정 용적을 횡단하는 세포에 의한 산란되고 형광된 광은 집광 렌즈(28)에 의해 조준된 다음 4개의 채널로 분리된다. 집광 렌즈의 구경은 0.34nm이다. 빔스플리터(30)에서, 파장이 500nm 미만인 광이 반사된다. 이러한 광은 488nm의 좁은 밴드 간섭 필터(32)를 사용하여 다시 여과된다. 환상의 암 영역 스톱(34)이 사용되어 단지 산란된 청색광을 5°내지 15°의 각 간격으로 전사한다. 그 다음, 산란된 광은 전자 시그날이 생성되는 실리콘 포토다이오드(38)에 검광 렌즈(36)에 의해 집속된다.
잔류하는 광은 빔스플리터(40)에서 두 개의 빔으로 동일하게 분할된다. 에너지의 1/2은 적색 산란 채널로 반사되고 나머지 1/2은 적색 형광 채널로 투과된다. (이러한 빔스플리터(40)는 형광 채널에서의 시그날 대 노이즈 비를 개선시키기 위해 적합한 이색 빔스플리터로 대체될 수 있다). 적색 산란 채널쪽으로 반사된 광은 633nm의 좁은 밴드 간섭 필터(42)를 통해 여과된 다음 50/50(50% 반사, 50% 투과) 빔스플리터(44)에 의해 두개의 빔으로 분할된다. 암 스톱(46 및 48)은 세포의 V와 HC를 결정하기 위해 필요한 두 개의 각도 간격으로 집광하기 위해 두 개의 적색 산란 채널에 사용된다. 각각의 채널에서 산란된 광은 전자 시그날이 생성되는 검광 렌즈(54 및 56) 각각에 의해 두 개의 실리콘 포토다이오드(50 및 52) 각각에 집속된다. ND 필터(neutral density filter)(58, 59 및 60)은 예비 증폭기 회로의 변형 없이 단순히 시그날의 동력학적 범위를 조정하기 위해 각각의 산란 채널, 즉 청색 및 적색 산란 채널에 사용된다.
빔스플리터(40)에 의해 투과된 광은 형광성 에너지만을 통과시키는 (62)에서여과된 다음 검광 렌즈(64)에 의해 직경 1mm의 핀홀을 통해 광전자 증배관 (66)에집속되며, 여기서 입사 에너지의 크기에 비례하는 전자 시그날이 생성된다. 핀홀의 존재는 외부 광에 의해 생성되는 숏(shot) 노이즈를 최소화한다. 검광 렌즈 앞에 위치하는 2mm 폭의 차단 바(67)는 주요 빔을 차단하여 백그라운드 광 노이즈를 추가로 감소시킨다. 당해 채널에는 633 노치 필터(Notch Filter)(X2)(68a), 숏트(Schott) OG515 컬러 글래스(Color Glass)(68b), 숏트 OG530 컬러 글래스(68c) 및 숏트 RG645 컬러 글래스(68d)로 구성된 네 개의 필터(68)가 삽입되어 있다.
필터 조합의 순 효과는 645nm 이하의 모든 광을 차단하는 것이다. 노치 필터 및 OG 필터(68a), (68b) 및 (68c)가 필요한데, 이는 RG 645 필터(68d)가 633nm 및 488nm에서 산란된 광을 완전히 차단하기에 충분히 효과적이지 않기 때문이다.
예비증폭기 회로의 이득 및 각 산란 채널에서 ND 필터의 광학적 밀도는 테크니콘(Technicon: TCN) 광학 시험 물질(OTM TCH T03-1704)이 검정되는 경우 각 채널의 출구에서의 약 2V의 평균 펄스 시그날 수준을 이루도록 선택된다. OTM은 구형화되고 경질-고정된 적혈구로 구성된다. 이 물질은 본원의 양수인에 의해 시판되며, TECHNICON H*1 시스템에 사용하기에 적합하다. 이는 탐지 후 시그날 프로세싱 하드웨어에서 가변 이득 증폭기(variable gain amplifier)를 사용하여 각 채널에서의 전체 이득을 정밀하게 조정하도록 한다. 형광 채널에서의 전체 이득은 광전자 증배관에 공급되는 고전압의 조정에 의해 조절된다.
탐지 후 시그날 프로세싱 시스템의 작용 블록 다이아그램은 제1c도에 도시되어 있다. 당해 시스템은 예비증폭기(67), 가변 이득 증폭기(68), 펄스 높이 분석기(70), 아날로그의 디지탈로의 변환기(72) 및 데이타 수득 하드웨어(컴퓨터)(74)및 소프트웨어를 포함한다.
가변 이득 증폭기(68)는 네 개 이하의 입력 시그날의 역전 및 증폭 조절을 허용하는 네 개의 회로를 포함한다.
펄스-높이 분석기(70), 아날로그의 디지탈로의 변환기(72) 및 데이타 수득 소프트웨어는 모두 4사이트 시스템(4Cyte system)의 부품으로, 이들은 호워드 사피로, 엠.디., 피.씨.[Howard Shapiro, M.D., P.C., Cambridge, Mass.]가 시판하고 있다. 펄스-높이 분석기는 4사이트 모델 에프이 프런트 엔드(4Cyte Model FE Front End)이다. 이들 부품은 네 개 이하의 입력 시그날에 대해 펄스 높이를 나타내는 고정 펄스를 생성하고, "유효" 펄스 높이를 역치 수준으로 고정시킨다. 4사이트 모델 I 계면 카드를 사용하여 4개 이하의 입력 시그날에 대해 아날로그를 디지탈로 변환시키고 호스트 컴퓨터의 RAM 메모리내에 이들 수치를 저장히기 위한 4사이트 소프트웨어와의 연결에 사용한다. 디지탈 시그날을 리스트식으로 저장한다. 각각의 세포에 대해 다섯 개의 8비트 바이트 정보가 있는데, 하나는 측정된 각각의 4개의 변수에 대한 것이고, 하나는 플래깅(flagging)에 대한 것이다. 이들 실험을 위한 호스트 컴퓨터는 컬러 모니터 및 수학적 보조프로세서(mathco-processor)가 장착된 1BM PC/XT 클론이다. 데이타 환산은 IBM 호환 컴퓨터로 수행할 수 있다.
제1d도를 참고하면, 적색 여기성 염료에 대한 조명 광학 시스템[참고번호(110)으로 표기]은 633nm에서 2mW 빔을 방사하는 헬륨-네온 레이저(112)를 포함한다. 레이저 빔 위치를 소절하는 2개의 반사 거울(114 및 116)에 의해 빔이 포개진다. 이러한 조절로 빔 축은 조명 광학의 물리적 광학축과 일치하게 된다. 그 다음, 빔은 한쌍의 실린더 렌즈(118 및 120)에 의해 192×77㎛ 타원형 빔(1/e2)의 형상이 된다. 촛점 길이가 150nm인 실린더 렌즈(118)에 의해 192㎛ 치수가 형성되고, 이는 A-1 구경(122)의 장축(이는 제1d도에 있어서 해당 면에 평행하다)을 조명한다. 촛점 길이가 60mm인 실런더 렌즈(120)에 의해 77㎛의 치수가 형성되며, A-1 구경의 단축을 조명한다. A-1 구경은 653×89㎛이다. 조명 더블렛(123)은 유동 셀(124) 속에서 37.4×12.6㎛의 타원형 가우시안(Gaussian) 강도 분포를 나타낸다. 타원의 단축은, 예를 들면 화살표(126)의 방향에 수직인 유동 방향과 평행이다.
용적 측정을 통과한 모든 세포는 입사된 방사선을 산란시키고 흡수한다. 산란되고 형광된 광이 포획되어 제1e도에 도식적으로 나타낸 탐지 광학 장지로 측정된다. 산란되어 형광된 광을 큰 수치의 구경(Hi-NA) 렌즈(128)로 모아 조준한다. 집광 렌즈의 구경 수치는 0.34nm이다. 빔은 이색 빔스플리터(130)(파장이 670nm이하인 광을 통과시킴)에 의해 두 부분으로 분할된다. 빔(132)은 여과된 후 광전자 증배관으로 반사되어 형광 측정에 사용되는 반면, 투과된 빔(134)은 50/50(50% 반사, 50% 투과) 빔스플리터(136)에 의해 추가로 분할되어 2개의 산란 채널을 이룬다. 반사된 산란 채널(138)은 5°내지 15°의 암 스톱(140)을 갖고, 투과된 채널(142)은 2°내지 3°의 암 스톱(144)을 갖는다. 그 다음, 이들 암 스톱(140 및 144)을 각각 통과한 광은 렌즈(146 및 148)를 통해, 각각 포토다이오드(150 및 152)에 집속된다. 그 다음, ND 필터(154 및 156)를 사용하여 각각의 포트다이오드에서의 광도를 표준 탐지기와 예비증폭기에 적합한 광도로 감소시킨다.
빔스플리터(130)에 의해 반사된 광은, 렌즈(158)에 의해 좁은 밴드(690nm)필터(159)를 통과하고 직경 1mm의 핀홀을 통해 광전사 증배관(160)에 집속되며, 여기서 입사 에너지 크기에 비례하는 전기 시그날이 생성된다. 검광 렌즈(158) 앞에 위치한 2mm 폭의 차단 바(157)는 주요 빔을 차단하여 백그라운드 광 노이즈를 감소시킨다. 포토다이오드(150 및 152) 및 광전자 증배관(160)에 의해 생성된 시그날은 제1c도에서 도시한 바와 유사한 탐지후 시그날 프로세싱 시스템에서 프로세싱된다. 하지만, 이 경우, (제1c도에서 논의된 네 개의 시그날이 아닌) 세 개의 시그날, 즉 적색 소각 산란 시그날, 적색 광각 산란 시그날 및 적색 형광 시그날만이 프로세싱된다.
다음 실시예는 망상 적혈구 동정을 위한 시약 조성물, 당해 조성물을 사용하여 망상 적혈구를 동정하는 방법 및 형광 유동 혈구 계산법을 사용한 망상 적혈구및 적혈구의 특성화를 설명한다. 가능한한 시판되고 있는 묘순 시약 등급의 물질을 사용한다. 다음 제형 및 공정은 단지 예시적 목적으로 제공되는 것이고, 본 발명의 기술에 따라 기타 성분 비율 및 방법을 사용할 수 있음을 이해해야 한다.
[실시예 1]
쯔비터이온성 계면활성제를 함유하는 시약 조성물을 사용하여 혈액 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구를 판별하기 위한 산란 및 형광 측정.
36-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드(AOEOH)염료를 스톡 용액 속의 1㎎/㎖ N,N-디메틸포름아미드에 저장한다. 실험 시약은 염료 스톡을 가해 6㎍/㎖ 내지 12㎍/㎖의 최종 농도의 염료로 만든다. 라우르아미도 프로필 베타인의 최종 농도는 12㎍/㎖ 내지 87.5㎍/㎖이다. 완충 용액은 지시된 농도의 다음 성분을 함유한다.
염화칼슘 O.4mM
염화칼륨 4.0mM
염화마그네슘 40.0mM
인산나트륨(삼염기성) 0.5mM
중탄산나트륨 20.0mM
본 연구에 사용된 실험 시약의 최종 중량 몰삼투압 농도 및 pH는 각각 272mmol/kg 및 8.1이다.
샘플을, 자동화 TECHNICON H*1 적혈구 샘플 프로세싱 방법을 모사한 방식으로 손으로 혼합한다. 유리 시험관을 실험 시약 5㎖로 충전시킨다. 그 다음, 시약을 와동 혼합기상에서 교반하면서 혈액 샘플 5㎕를 시약에 피펫으로 가한다. 그 다음, 1:1OOO 혈액 희석액을 전술한 유동 혈구 계산 장치의 샘플 라인 및 제1a도 및 제1b도의 광학 시스템에 즉시 공급한다. 약 2분 이내에 샘플은 유동 셀로 통과되고 적혈구와 망상 적혈구 분석을 위한 아르곤-이온 레이저 공급원에 노출된다. 각각의 샘플을 샘플 용적이 허용하는 한 2회 측정한다.
현미경으로 조사하여, 제조된 샘플 속에서 성숙한 적혈구와 망상 적혈구는 구형이고, 청색 광에 의해 여기되는 경우 망상 적혈구가 적색을 발하는 것으로 밝혀졌다.
분석 완료시, 미처리 데이타를 제2a(1)도의 청색 산란 대 적색 형광 사이토그램 형태로 나타내는데, 여기서 종축은 전방 산란 광의 상대 세기를 나타내고, 횡축은 적색 형광의 상대 세기를 나타낸다. 사이토그램의 각각의 점은 세포를 나타낸다. 특정 산란 및 형광 시그날을 기본으로 하여 별개의 세포 집단이 명확히 관찰된다. 성숙한 적혈구 집단은 종축과 수직선 X 사이의 A 영역에 속한다. 이들 세포는 고도의 산란 시그날 및 낮은 세포 형광 시그날을 나타낸다. 망상 적혈구 집단은 X의 우측 영역인 B 영역에 속한다. 이들 세포는 이들의 AOEOH 염색된 RNA로부터의 고도의 형광 시그날로 인해 성숙한 적혈구로부터 판별 가능하다. 혈소판 집단은 Y선 하부 C영역에 위치한다. 망상 적혈구에 비해 혈소판은 비교적 낮은 산란 시그날을 갖는다.
성숙한 적혈구 및 망상 적혈구 사이의 형광 분리를 기초로, 환자 샘플의 망상 적혈구 계수는 망상 적혈구와 성숙한 적혈구를 동정하는 산란광과 형광 범위를제한하는 전자 "원도우"를 제조하여 측정할 수 있다. "윈도우"에 속하는 망상 적혈구와 성숙한 적혈구 수를 측정하여 전제 세포 집단에 존재하는 망상 적혈구와 적혈구의 함랑(%)을 계산한다. 제2a(1)도에서, 망상 적혈구 "원도우"를 B 영역으로 측정하고 성숙한 적혈구 "윈도우"를 A 영역으로 측정한다. 제2a(2)도 및 다음의 모든 산란/산란 사이토그램에 있어서, 비선형 그릿(grid) 중첩은 틱코의 방법에 따른 완전 구에 대한 일정 용적 위치 및 일정 굴절율을 나타낸다.
각각의 샘풀 속의 망상 적혈구의 참조 함량(%)은 NCCLS[National Committee for Clinical Laboratory Standards]에 의해 권장된 수동 현미경 방법으로 측정한다. 이 방법에서, 소용적의 샘플을 뉴 메틸렌 블루를 사용하여 진하게 염색한다. 그 다음, 통상의 무수 웨지(wedge) 도포 표본을 시조하여 샘플 속의 망상 적혈구의함량(%)을 현미경을 사용하여 계수한다. 현미경에는 10OX 오일 침지된 대물 렌즈 및 1OX 접안 렌즈가 장착되어 있다. 각각의 샘플에 대해 최소 1000개 세포를 계수한다. 밀러(Miller) 디스크를 현미경 접안 렌즈에 삽입하여 계수 정밀성을 향상시킨다. 염색 후 두 개 이상의 청색 물질 입자를 함유하는 적혈구를 망상 적혈구로 표지한다.
환자 샘플의 망상 적혈구 계수율은 이러한 유동 혈구 계산범으로 1.7%로 측정된다. 동일한 혈액 샘플을 또한 NCCLS 방법으로 분석한다. 그 결과, 망상 적혈구 계수율은 1.7%였다.
세포를 옥사진 750으로 염색하고 상술한 제1d도 및 제1e도의 형광 유동 혈구계산기 및 광학 시스템으로 측정하는 경우 망상 적혈구와 적혈구 집단간의 고도의차이를 입증하는 또 다른 실험을 수행한다. 옥사진 750 염료를 스톡 용액 1㎖당 1㎎ N,N-디메틸포름아미드에 저장한다. 염료 스톡을 최종 농도가 0.2㎍/㎖ 내지 1.2㎍/㎖로 되도록 상술한 구형화제와 완충 용액에 가함으로써 실험 시약을 제조한다.
상기한 바와 갈은 샘플 제조 프로토콜을 따른다. 제2b(1)도는 옥사진 750 함유 시약으로 염색된 정상적인 사람 혈액 샘플의 형광성 대 소각 산란 사이토그램을 나타낸다. 적혈구와 망상 적혈구 사이의 형광성 분리를 기본으로 하여, 샘플의 망상 적혈구는 2.1%로 계수된다. NCCLS 방법으로 분석하는 경우, 망상 적혈구는 2.1%로 성숙한 계수된다. 제2c도는 제2a도 및 제2b도에서와 유사한 데이타로부터 수득된 적혈구에 중첩된 망상 적혈구를 "+"로 도시하고 있다.
[실시예 2]
본 발명의 시약 조성물 및 방법과 NNCLS 방법간의 상관관계 연구
제1a도 및 제1b도의 상기한 형광 유동 혈구 계산기 및 광학 시스템에서 시약조성물에 사용되는 경우와 NCCLS 수동 방법에 사용되는 경우의 AOEOH의 수행능을 비교하는 연구를 수행한다. 혈액 샘플은 테크니콘 피고용인 39명과 병원 환자 23명으로부터 수득한다. 병원 환자의 샘플은 세 개의 겸상 세포, 1개의 탈라세미아 및 열 개의 신생 혈액 샘플을 포함한다. 62개의 혈액 샘플을 실시예 1에 기술한 시약 조성물로 염색하여 이들의 망상 적혈구 함량을 분석한다. 동일한 혈액 샘플세트 속의 망상 적혈구를 또한 NCCLS 방법을 시용하여 계수한다.
상기 실시예 1에서 기술한 샘플 제조 및 분석 프로토콜을 따른다.
이들 두 가지 방법으로부터 수득한 망상 적혈구 계수율(%)을 제3a도에서 비교한다. 시약 조성물 속의 6㎍/㎖ AOEOH 농도에서, 제1a도 및 제1b도의 상기 형광 유동 혈구 계산기 및 광학 시스템으로 수득한 측정치 및 시약 조성물과 NCCLS참조 방법으로 수득한 측정치와 조성물간에 밀접한 상관관계가 존재하는 것으로 나타났다. 상관계수는 0.95로 측정된다.
제1d도 및 제1e도의 상기한 형광 유동 혈구 계산기 및 광학 시스템에서 사용하는 경우와 NCCLS 방법에서 사용하는 경우의 옥사진 750의 수행능을 비교하는 또 다른 실험을 수행한다. 실시예 1의 샘플 제조와 분석 프로토콜을 따른다. 혈액 샘플을 시약 조성물로 염색하여 이들의 망상 적혈구 함량을 분석한다. 동일한 혈액 샘플 세트 속의 망상 직혈구를 또한 NCCLS 방법을 사용하여 계수한다. 이들 두 가지 방법으로부터 수득한 망상 적혈구 계수율(%)을 제3b도에서 비교하고 있다. 상관계수는 0.93으로 측정된다.
[실시예 3]
본 발명의 AOEOH 함유 시약 조성물과 TECHNICON H*1 Jr. 참조 방법을 사용한 상관관계 연구
실시예 2에서와 동일한 샘플 세트를 또한 적혈구 지수에 대해서 TECHNICON H*1 Jr. 시스템을 사용하여 측정한다. TECHNICON H*1 Jr. 자동 시스템은 개개의 등용적으로 구형화된 적혈구의 세포 용적과 헤모글로빈 농도를 동시에 측정하는 유동계산기이다.
지수 MCV와 MCHC를 TECHNICON H*1 Jr. 분석기 상에서 별도로 측정하여 본 발명의 AOEOH 함유 시약 조성물을 사용하여 수득한 수치와 비교한다. 제4a도 및 제4b도는 전체 적혈구 지수 MCV 및 MCHC 각각에 대한 상관 데이타를 나타낸다. 상관 계수는 각각 0.91 및 0.97로 측정된다.
[실시예 4]
본 발명의 옥사진 750 함유 시약 조성물과 TECHNICON H*1 참조 방법을 사용한 상관관계 연구
적혈구 및 망상 적혈구 지수, MCV 및 MCHC를 별도로 측정하여 본 발명의 옥사진 75○ 시약 조성물을 사용하여 수득한 값과 비교한다. 제5a도 및 제5b도는 각각 전제 적혈구 MCV 및 MCHC에 대한 상관 데이타를 나타낸다.
상관계수는 각각 0.93 및 0.92로 측정된다.
[실시예 5]
AOEOH와 완충액을 함유하는 실시예 2의 시약 조성물을 사용하여 혈액 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구를 판별하기 위한 산란 및 형광 측정(혈액 속의 망상 적혈구의 판별은 불가)
망상 적혈구를 동시에 염색하고 구형화하는 데 모든 완충액을 사용할 수는 없다. 본 실시예는 AOEOH 염색 염료 및 pH 8.0과 중량 몰삼투압 농도 290m Osm의 인산염 완층액을 사용하는 경우에 망상 적혈구와 적혈구 사이의 판별이 불량함을 나타낸다(제6a도). 이에 비해, pH 8.0 및 중량 몰삼투압 농도 290m Osm인 바비탈 완충액(12㎍/㎖ LAB 계면활성제)을 사용하는 경우에 망상 적혈구와 적혈구 사이의우수한 분리가 명확히 관찰된다(제6b도).
위의 기술로부터 명백한 본 발명의 잇점에는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를동정하고 형광 유동 혈구 계산법으로 망상 적혈구와 적혈구의 용적, 헤모글로빈 함량 및 헤모글로빈 농도를 동시에 정량하기 위한 시약 조성물 및 방법이 포함된다.
상기의 측면에서, 본 발명의 일부 목적이 달성되고 기타 유리한 결과를 수득할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 범위로부터 벗어나지 않는 한 구성과 방법을 다양하게 변화시킬 수 있으므로, 위의 설명에 포함되거나 첨부된 도면에 나타난 모든 사항들은 제한이아닌 예시로서 이해되어야 할 것이다. 예를 들어, 분류된 혈액 샘플을 유사한 방법으로 가공할 수 있다.

Claims (31)

  1. 혈액 샘플 분취량을, 동정 대상물인 아계열 세포의 리보핵산을 염색하는 염료 화합물, 약 6 내지 약 9의 pH를 유지하기 위한 완충액 및 구형화제를 포함하는 수성 시약 조성물과 혼합하여 현탁액을 형성시키는 단계(a), 단계(a)의 현탁액을 집속된 광학 조명 영역을 통해 통과시켜 실질적으로 한번에 하나의 세포씩 통과시키는 단계(b), 각각의 세포에 의해 산란되는 광과 형광되는 광을 탐지하는 단계(c) 및 산란된 광과 형광된 광을 기준으로 하여 적어도 이의 일부로 동정 대상물인 아계열 세포를 감별하는 단계(d)를 포함함을 특징으로 하여, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아계열 세포가 망상 적혈구인, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계(b)의 광학 조명이 스펙트럼의 적색 영역의 여기 파장(excitation wavelength)을 갖는, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계(b)의 광학 조명이 스펙트럼의 청색 영역의 여기 파장을 갖는, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 구형화제가 쯔비터이온성 계면활성제인, 혈액 샘플속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 염료 화합물이 구조식(I)의 옥사진(0xazine) 750, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 또는 일반식(II)의 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체인, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
    상기 식에서, Y는 음이온이고, R은 독립적으로 메틸 또는 에틸 그룹이며, X는 하이드록시에틸 그룹, 또는 오르토 위치가 수소원자 또는 불소에 의해 치환되고/되거나 파라 위치가 수소원자, 불소 또는 트리플루오로메틸 그룹에 의해치환된 벤질 그룹이다.
  7. 제6항에 있어서, 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체가 약 2㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖의 양으로 3,6-비스(디메틸아미노)-10-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(2-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-트리플루오로메틸)-벤질아크리디늄 브로마이드 및 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  8. 제5항에 었어서, 계면할성제가 라우르아미도프로필베타인인, 혈액 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하는 방법.
  9. 혈액 샘플 분취량을, 망상 직혈구의 리보핵산을 염색하는 유기 양이온성 염료 화합물, 구형화제 및 완충액을 포함하는 시약 조성물과 혼합하여 현탁액을 형성시키는 단계(a), 단계(a)의 현탁액을 집속된 광학 조명 영역을 통해 통과시켜 실질적으로 한번에 하나의 세포씩 통과시키 단계(b), 각각의 세포에 의해 산란되는 광과 형광되는 광을 탐지하는 단계(c), 산란된 광과 형광된 광을 기준으로 하여 염색된 세포와 염색되지 않은 세포 동정하는 단계(d) 및 산란된 광과 형광된 광을 기준으로 하여 망상 적혈구 또는 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 측정하는 단계(e)를 포함함을 특징으로 하여, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시약 조성물이 옥사진 750 염료를 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.2㎍/㎖ 농도로 함유하는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 시약 조성물의 pH가 약 6 내지 약 9인, 점혈-샘플속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구계산법으로 측정하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 완충액이 약 5mM 내지 약 50mM의 K/NaHCO3, 약 0mM 내지 약 88mM의 MgCl2, 약 4mM 내지 약 104mM의 KCl 및 약 0mM 내지 약 0.4mM의 Na3PO4중의 하나 이상을 포함하고, 시약 조성물의 최종 중량 몰삼투압 농도가 약 270m 0sm 내지 약 310m Osm인, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 완충액이 약 0mM 내지 약 150mM의 트리스, 약 0mM 내지 약 121mM의 K2Ox/EDTA 및 약 0mM 내지 약 155mM의 바비탈 중의 하나 이상을 포함하고, 시약 조성물의 최종 중량 몰삼투압 농도가 약 280m 0sm 내지 약 300m 0sm인 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 계면활성제가 알킬아미도베타인인, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 계면활성제가 라우르아미도프로필베타인인, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 계면활성제가 약 12㎍/㎖ 내지 약 87.5㎍/㎖의 양으로 존재하는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  17. 제9항에 있어서, 시약 조성물이 아크리딘 오렌지 또는 일반식 (II)의 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체를 함유하는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
    상기 식에서, Y는 음이온이고, R은 독립적으로 메틸 또는 에틸 그룹이며, X는 하이드록시에틸 그룹, 또는 오르토 위치가 수소원자 또는 불소에 의해 치환되고/되거나 파라 위치가 수소원자, 불소 또는 트리플루오로메틸 그룹에 의해치환된 벤질 그룹이다.
  18. 제17항에 있어서, 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체가 약 3㎍/㎖ 내지 12㎍/㎖의 양으로 3,6-비스(디메틸아미노)-10-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(2-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3.6-비스(디메틸아미노)-10-(4-트리플루오로메틸)-벤질아크리디늄 브로마이드 및 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도 및 RNA 농도를 유동 혈구 계산법으로 측정하는 방법.
  19. 전혈 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포의 리보핵산을 염색하기 위한 구조식(I)의 옥사진 750, 아크리딘 오렌지 또는 일반식(II)의 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체인 염료 화합물과 pH 약 6 내지 약 9를 유지하기 위한 완충액을 포함함을 특징으로 하는, 전혈 샘플 속의 동정 대상물인 아계열 세포를 유동 혈구 계산법으로 동정하기 위한 시약 조성물.
    상기 식에서, Y는 음이온이고, R은 독립적으로 메틸 또는 에틸 그룹이며, X는 하이드록시에틸 그룹, 또는 오르토 위치가 수소원자 또는 불소에 의해 이치환되고/되거나 파라 위치가 수소원자 불소 또는 트리플루오로메틸 그룹에 의해 이치환된 벤질 그룹이다.
  20. 제19항에 있어서, 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체가 약 3㎍/㎖ 내지 12㎍/㎖의 양으로 3,6-비스(디메틸아미노)-10-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(2-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-트리플루오로메틸)-벤질아크리디늄 브로마이드 및 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시약 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 완충액이 약 5mM 내지 약 50mM의 K/NaHCO3약 0mM 내지 약 88mM의 MgCl2, 약 4mM 내지 약 104mM의 KCl, 약 0mM 내지 약 1.5mM의 Na3PO4및 약 0mM 내지 약 0.4mM의 CaCl2중의 하나 이상을 포함하고, 시약 조성물의 최종중량 몰삼투압 농도가 약 270m 0sm 내지 약 310m 0sm인 시약 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 완충액이 약 0mM 내지 약 150mM의 트리스, 약 0mM 내지 약 121mM의 K2Ox/EDTA 및 약 OmM 내지 약 155mM의 바비탈 중의 하나 이상을 포함하고, 시약 조성물의 최종 중량 몰삼투압 농도가 약 280m 0sm 내지 약 300m 0sm 인 시약 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 옥사진 750 염료를 약 0.4㎍/㎖ 내지 약 1.2㎍/㎖의 농도로 함유하는 시약 조성물.
  24. 망상 적혈구 속의 리보핵산을 염색하기 위한 유효량의 구조식(I)의 옥사진 750 또는 아크리딘 오렌지 또는 일반식(II)의 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체인 염료 화합물, 망상 적혈구와 적혈구의 등용적 구형화를 수행하기 위한 양의 쯔비터 이온성 계면활성제 및 pH 약 6 내지 약 9를 유지하기 위한 완충액을 포함함을 특징으로 하는, 전혈 샘플 속의 망상 적혈구를 유동 혈구 계산법으로 특성화하기 위한 시약 조성물.
    상기 식에서, Y는 음이온이고, R은 독립적으로 메틸 또는 에틸 그룹이며, X는 하이드록시에틸 그룹, 또는 오르토 위치가 수소원자 또는 불소에 의해 치환되고/되거나 파라 위치가 수소원자, 불소 또는 트리플루오로메틸 그룹에 의해치환된 벤질 그룹이다.
  25. 제24항에 있어서, 4급화된 아크리딘 오렌지 유도체가 약 3㎍/㎖ 내지 약 12㎍/㎖의 양으로 3,6-비스(디메틸아미노)-10-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(2-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-플루오로)-벤질아크리디늄 브로마이드, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-(4-트리플루오로메틸)-벤질아크리디늄 브로마이드 및 3,6-비스(디메틸아미노)-10-2-하이드록시에틸 아크리디늄 요오다이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시약 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 완충액이 약 5mM 내지 약 50mM의 K/NaHC03,약 0mM 내지 약 88mM의 MgCl2, 약 4mM 내지 약 104mM의 KCl, 약 OmM 내지 약 1.5mM의 Na3P04및 약 0mM 내지 약 O.4mM의 CaCl2중의 하나 이상을 포함하고, 시약 조성물의 최종 중량 몰삼투압 농도가 약 270m 0sm 내지 약 310m 0sm인 시약 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 완충액이 약 0mM 내지 약 150mM의 트리스, 약 0mM 내지 약 121mM의 K20x/EDTA 및 약 0mM 내지 약 155mM의 바비탈 중의 하나 이상을 포함하고 조성물의 최종 중량 몰삼투압 농도가 약 280m 0sm 내지 약 300m 0sm인 시약 조성물.
  28. 제24항에 있어서, 옥사진 750 염료를 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.2㎍/㎖의 농도로 함유하는 시약 조성물.
  29. 제24항에 있어서, 계면활성제를 약 12㎍/㎖ 내지 약 87.5㎍/㎖ 함유하는 시약 조성물.
  30. 제24항에 있어서, 계면활성제가 알킬아미도베타인인 시약 조성물.
  31. 제24항에 있어서, 계면활성제가 라우르아미도프로필 베타인인 시약 조성물.
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