JPS61502280A

JPS61502280A - 白血球のクラスおよびサブクラスの同定、計数並びに試験方法およびそれに用いる試薬系

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Publication number: JPS61502280A
Application number: JP60502479A
Authority: JP
Inventors: レイフ・ロバート・ケアリー; レデイス・ステフエン・ローレンス; フアインバーグ・ロバート・アーウイン
Original assignee: ク−ルタ−・エレクトロニクス・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-20
Publication date: 1986-10-09
Also published as: ES8609726A1; EP0182874A4; WO1985005640A1; KR860700136A; CA1310904C; EP0182874B1; EP0182874A1; AU4406185A; DE3587636D1; ES543656A0; DE3587636T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】白血球のクラスおよびサブクラスの同定、計数並びに試験方法およびそれに用いる試薬系本発明は免疫血液学的手法に関し、更に詳しくは、特定のサブクラスの白血球表面の選択抗原決定基に対する蛍光応答抗体を以って培養された全血資料からの白血球について、クラス並びにクラス内サブクラスの同定とこれらサブクラス内の細胞の計数とを行なうための方法およびそれに用いる試薬系に関する。

血液白血球のリンパ球集団は、免疫応答において独特な役割を演する多くのサブクラスに細分化されることが知られている。疾患状態においては、種々のサブクラス中に見出されるリンパ球の相対数は変化するようである。従って、種々のサブクラス中の細胞の計数と同定とは、ラボラトリ−・マネージメント（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）１９８４年５月号。

２９−３７頁においてジェームズ・アール・ダウニング（ＪａｍｅｓＲ，Ｄｏｅｉｎｉｎｇ）等が述べているように、疾患の研究と治療とに有用な情報を提供するであろう。

機能上独特なリンパ球およびその他の白血球の数種の特殊なサブクラスは細胞上の抗原決定基に基いて同定し得ることは既知である。

モノクローナル抗体技法は各種リンパ球やその他の白血球のサブクラスに対する高純度の抗体を多量に産生ずるのに利用されてきた。かかる抗体を利用して、個人のリンパ球をアッセイし、各種サブクラス中の細胞の相対数を測定することが可能であることが判明した。また、直接あるいは間接的技法を利用して、抗体に蛍光標識をなし、それによって検体資料を流動細胞計測分析で、および形態学的に、分析可能ならしめることができる。

更に最近では、卓球および顆粒球と反応する数種のものを含んで、補助的モノクローナル抗体が開発されている。

ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）等は、米国特許第４，２８４．４１２号明細書およびイムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第７７巻、第８号、　４９１４−４９１７頁（１９８０年）において、特定のリンパ球サブクラスの自動化した同定および計数のための方法並びに装置を記載している。抗凝血性となした全血資料またはバッフィコート資料を関心のある特異的リンパ球サブクラスに対する抗体を以って培養する。この抗体の結合は、それが蛍光性化学部分と結合している場合（直接法）でも、それがまた、蛍光染料部分が結合した他の高分子と特異的に結合している場合（間接法）であっても、検知可能である。これらの蛍光部分は、投射レーザー光を照射すると蛍光を発する特性を有する。そこで試料を、溶解剤として塩化アンモニウムを用いて溶解する。次いで希釈した試料を流動細胞蛍光定量分析に付す。４種の細胞集団が区別される。しかしながら、３種の集団のみが白血球によることがわかる。これらの集団は（１）リンパ球、（２）単球および（３）顆粒球として同定される。４番目の集団は、血小板と、赤血球の不完全溶解による赤血球破片との集塊すなわち群として同定される。

これらの参考文献に記載された溶解技法は本発明によって改善され、免疫学的に標識した特異的白血球の形態を更に良好に維持し、それらの貯蔵安定性を改善し且つそれらは、細胞蛍光分析、或いはその他の操作例えば染色細胞の、スライド上での顕微鏡検査に対して、より好適となった。

クールター・コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ）。

クールター・エレクトロニクス・インコーボレーテフト（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ＋Ｉｎｃ、）、またはクールター・エレクトロニクス、リミテッド（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｌｔｄ、）の所有する商標、ｒｃｏυＬＴＥＲＪ、ｒｃＯｔｌＬＴＥＲＣＬＯＮＥＪ、ｒｌｓＯＴＯＮＪ　。

「Ｅ、Ａ、ＳＹ、１」「ＭＤＡＤＳ」およびｒＥＰＩｃｓＪを本書中で使用する。

ここに、添付図面を参照しつつ本発明の態様を実施例によって説明する。

第１Ａ図および１８図は流動細胞計測分析によって作った細胞膜抗原ヒストグラムを示す。横座標は、緑色蛍光強度の対数に直接比例する数値を表わす。縦座標は、各チャンネル内で計数された細胞数を比例尺度で示す。

第１Ａ図は、実施例１におけるような、Ｔ４−　ＦＩＴＣをもった試料を示す。

第１Ｂ図は、蛍光抗体を添加しない対照を示す。

第２図は、横座標が直角光散乱強度の対数を表わし縦座標が前方角光散乱強度を表わす等値線図である。長方形は、特異的白血球細胞クラス、即ち、リンパ球、単球、顆粒球を含有するこの二次元分布の特定区域を示す。この等値線図は流動細胞計測器による二次元データから決定した。各等値線は、光散乱強度に関わりなく、木質的に同一細胞数が存在する図上の位置を示す。

本発明は、細胞表面の抗原決定基、およびその標識抗体との反応性の利用に基いて、全血中の白血球のクラスを同定し且つこれらクラス内の選択されたサブクラス中の細胞を計数するだめの改良された試薬系と方法とに関する。本発明は、ハンセン等が説明した一般的綜合手順を若干採用するが、従来の溶解および細胞固定手順に対しては特段の改良をなすものである。

本発明によれば、試薬系は、（Ａ）サポニンを含有する溶解試薬と、（Ｂ）架橋結合剤を含有する固定試薬との水溶液を含んでなる。改良試薬系は、赤血球を溶解する一方、血液白血球のクラスの物理的および形態的性質を維持すると共に特異的白血球のサブクラスに標識をする。試料は流動細胞計測の原理によっても、また顕微鏡的形態によっても分析することができる。

溶解剤としてサポニンを使用すれば、この方法は限られた量の架橋結合固定液による固定を可能とする。これは室温または好ましくは昇温下、例えば４２℃で溶解することによって達成され、赤血球膜を選択的に不安定となし溶解反応を促進する。主としてカリウム塩よりなる浸透圧の低い緩衝剤の使用もまた溶解を扶ける。

グルタルアルデヒドはグリオキサールより強い固定剤で特化Ｈ６１−５０２２８０（３）はあるが、グリオキサールは架橋結合剤としてグルタルアルデヒドよりも好ましい；何となれば、グルタルアルデヒドは可成りの量の蛍光を生ずるにも拘らず、グリオキサールは白血球と反応後に、たとえあっても、最少のバックグラウンド蛍光しか与えないからである。ジアルデヒドは、この目的のためにほんの微弱な架橋結合作用しか有しないモノアルデヒド、例えばホルムアルデヒドよりも好ましい。

ジメチルスルホキサイドまたは尿素の固定液への添加は反応を改善し、かつ固定液の必要量を凍らしてサポニンの白血球に対する作用を遅延させる傾向がある。

加うるに、約４℃への温度降下（水浴の使用による如き）は反応を遅らせる。細胞は弱く固定されて、細胞プレパラート用スライド上に充分に拡げることができる。

本願と同日に出願した同時係属の米国特許出願第６１５，９６６号には、若干類似した溶解法が記載されているが、かかる方法は、細胞表面抗原決定基と、既知の環境下で蛍光を発する細胞に標識する抗体とのその反応性とを利用するための免疫学的技法を含んでいない。

本発明は、細胞表面の抗原決定基およびその標識抗体との反応性の利用に続いて、標識した細胞を同定するために流動細胞計測または顕微鏡的形態学の原理を利用することに基き、全血中の白血球のクラスを同定し且つサブクラス中の細胞を計数するための方法に関する。

「溶解」　（リーシス）またはその種の形の語句および「形態」（モルフォロジー）なる語句を本書中で使用する。

赤血球の溶解とは、赤血球が最早や物理的技法では検出不能の状態となされているか、またはそれらの発する信号が白血球の生ずる信号と干渉しなくなるよう充分に減少したような赤血球の残渣となっていることを意味する。形態とは、細胞の顕微鏡検査方法および人間のまたは人工知能の技法による細胞のクラスおよびサブクラスの決定を意味する。

本発明によれば、全血試料は、希釈したモノクローナル抗体を以って培養され、成るサブクラスの白血球に標識をする。それからクラスとサフリラスとの同定に先立って、赤血球を溶解により除去し、白血球を架橋結合固定液の使用によって安定化する。白血球のクラスとサブクラスとを同定する段階の前に赤血球を溶解することは、２個またはそれ以上の赤血球あるいはその破片が計数変換器を同時に通過して白血球と誤認され得る危険を回避するために好ましいことである。好ましい手順は、赤血球を破壊してそれらのヘモグロビンの部分を溶液中へ放出させるように、細胞ＱｆＢ液へ溶解試薬を添加することによって、白血球の同定に先立ち赤血球を溶解することである。

問題点は、白血球上の抗原抗体複合物に損傷を与えることなく赤血球を溶解し、一方ではそれらの細胞形態を保存し且つ安定な細胞懸濁液を生成することにある。

全血試料は、赤血球を溶解し、また同時に白血球血液細胞を、測定によってそれらとそのサブクラスとを弁別し得る状態に維持する方法でもって処理されなければならない。

溶解試薬は迅速に、好ましくは１分未満内に作用する必要がある。シトグラム（ｃｙ　ｔｏｇｒａｍ）には血小板の集塊すなわち群のクラスターと、白血球のクラスターから分離した赤血球の破片とが生ずる。

本発明の好ましい態様においては、全血試料は蛍光色素で染めた抗体を以って培養し特異的サブクラスの白血球に標識する。赤血球はサポニン含有溶解試薬を以って選択的に溶解され、次いで直接に標識した白血球ば、ジアルデヒド含有固定試薬を用いて固定される。それから白血球細胞懸濁液は、前方角および直角光散乱の組合せによって分析し、少くとも３クラスを示すデータを得る。免疫蛍光陽性の白血球集団はＣ０ＵＬＴＥＲＯＥｐｒｃｓＯ流動細胞計測器を以って計数する。固定液は、架橋結合性すなわち二官能性固定液、好ましくはジアルデヒドである。

次のＣ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥ■抗体によって好結果を得た。

Ｔ４−ＦＩＴＣ，Ｔ８−ＦＩＴＣ，Ｔｌｌ、Ｔｌ１−ＦＩＴＣ，Ｂｌ−ＦＩＴＣ，Ｍｏ２−ＦＩＴＣ。

本発明の目的に有用なその他の抗体は、０ＫＴ１．ＰＡＮ、０ＫＴ４．　ＩＮＤおよび、単球や顆粒球と反応するＯＫＭｌ、Ｍ／Ｇをも含む。

本書中で使用する「蛍光応答抗体」とは、自ら蛍光を発する抗体、若しくは標識されて特定の刺激の下で蛍光を発する抗体を云う。

血液白血球の物理的性質と形態とを維持しつつ、また特異的白血球のサブクラスに免疫学的に標識し乍ら、血液赤血球を溶解する技法が開発された。この技法は遠心分離を含まないことで独特であり、更に、細胞を充分に保護するので、細胞は４°Ｃで１日間貯蔵し依然として流動分析に使用することができる。此の技法を使用して例えばＴリンパ球を、＋１）　Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥＴ４−ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用い、ヘルパーリンパ球と、（２１Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥ　Ｔ８−ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用い、サプレッサーリンパ球とに分裂させることが可能である。

また本発明の技法によって作った細胞は他の細胞調製、例えば遠心細胞現象による調製に対しても好適である。

本発明の技法はサポニン溶解試薬の所要濃度を最小限となし、その結果、限られた量の固定液を以って固定することができる。溶解は室温または好ましくは昇温下、例えば４２℃で達成され、赤血球膜を選択的に不安定となし溶解反応を促進する。主としてカリウム塩よりなる浸透圧の低い緩衝剤の使用もまた、溶解を扶ける。

溶解について同等条件を与えるサポニン使用量は温度の増加Ｇこつれで減少し得ることが確認された。かくして、検体標本中の遠心分離されないサポニンの残存量は、溶解試薬の温度の上昇によって最小限となすことができる。

二官能性または架橋結合性固定剤、例えばグリオキサール、グルタルアルデヒド、カルボジイミド７サクシンアルデヒド、マースキー試薬等は固定試薬中に使用するのに好適である。マースキー試薬はサツカリドの化学処理から誘導したグリオキサールの不純な調剤から主として成っている。グリオキサールは、蛍光を発しないので固定試薬には特に好ましい。これは、この手順において後に抗体結合綿７８六ＦＩＨＧＩ−５０２２８０（４）胞の蛍光を測定する際に利点となる。

本発明は蛍光測定に限定されることなく、ニューヨーク科学学会年報（ＡｎｎｕａＩｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ）１９８３年、第４２０巻、１２７−１３８頁で、ディー・ワイ・メイゾン（Ｄ、Ｙ、Ｍａｓｏｎ）　、ゼソド・アブドラジズ（Ｚ、Ａｂｄｕｌａｚｉｚ）およびビー・ファリーニ（Ｂ、Ｆａｌｉｎｉ）の「限定された免疫蛍光法並びに関連する細胞科学的方法Ｊ　（Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ。

ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されているような吸光測定を行なうこともできる。

本発明の技法は、直流および交流インピーダンスの付加的物理的測定と共に用いることができる。この測定は、前述の光散乱測定と共に、またはそれらの代りに利用することができる。

固定した血液細胞は光散乱手順に先立ち、約２乃至４℃で冷蔵した時は安定である。実験研究によれば試料は溶解後２４時間安定であることが確実であった。例えば、ＣＯ［ＩＬＴＥＲＣＬＯＮＥ抗体Ｔ８−ＦＩＴＣ抗体用８て、陽性細胞のパーセントは試料調製直後で２０．３±１．０．溶解後２０時間で２０．３±０．６．また溶解後２４時間で２０．０±０．３であった。

処理段階の合間に、表面に浮かんでいる流体を遠心除去することは、それによって細胞の破片が可成り減少し、過剰の緩く結合した抗体が除かれるという点で有益である。

しかし乍ら、遠心操作は、存在する細胞の絶対数を取得す招来し得るという不利を有する。遠心分離は半自動化システムの一部となり得るが、完全自動システムには可成りの複雑性を持ち込む。

本発明の試薬系の開発における大きい制約の１つは、流動細胞計測器、例えばＥＰＩＣＳシステムに対する試料調製が、標準血液分析器、例えばＣ０ＵＬＴＥＲ ■Ｓ型シリーズの機器に対する試料調製とは相違して、非同期性であることである。

最終試料調製と測定との間の時間は略々即刻から翌日に迄亘り得る。

もう１つ別の問題点は、適宜な対照の選定である。成る場合、例えば蛍光標識マウス免疫グロブリンＧ（マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を対照として使用する場合には、モノクローナル抗体の強烈な特異性はバックグラウンド蛍光の過大評価を来たす。無標識抗体による前培養および／または同時培養は、非特異的結合場所をブロックし、多（の場合このために、対照の必要性を無くすことができる。

本発明によって調製した抗体含有試料は、ロマノウスキー染料（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ　５ｔａｉｎ）を使用して調製することができる。また蛍光の研究の場合には、細胞を２種の染料、例えばジクロロフルオレセインと４，６−ジアミツー２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と、で染色することが可能である。その他慣用の染料はマイスロマイシン（Ｍｉ　ｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）およびアクリジンオレンジを含む。

以下の実施例は本発明に従った方法と手順との若干例を説明するものである。

実施例１細胞調製：溶解並びに固定試薬を室温、約２４℃で調製した。

１、燐酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）　１００μｌを１６　×１００の試験管に入れ、続いて全血１００μβを加えた。それから試験管内容物を廻しながら穏かにかき混ぜた。

２、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥモノクローナルＴｌｌ抗体５マイクログラムを同じ試験管に添加し穏かにかき混ぜた。それから試験管を、時折り振温し乍ら室温即ち約２４℃に２０分間保持した。

３８　これが間接蛍光法であったので、試料を遠心操作により４ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。それから試料を８５マイクログラムの蛍光標識ヤギ抗マウス（ａｎ　ｔｉｍｏｕｓｅ）抗体で処理し、２０分間培養して、前のように４　ｍ　ｌのＰＢＳで洗浄した。

４、３ｇのＮａＣｌと１ｇのＮａＨＣＯｘとに水を加えて１リツトルとしてなる溶液１ｍ７！に細胞を懸濁した。

５、　それから、２４ｇのサポニン、４．０ｇのＮａＣｊｌ！、１ｇのソルビン酸に水を加えて１リツトルとしてなる溶解試薬１００μβを、間接標識したＴリンパ球を含む血液を容れた試験管に添加し、連続的に８秒間攪拌した。

６．８秒間溶解の終了時点で、１０００μｌの固定試薬を溶解試料に添加した。

この固定試薬は、６．０ｇのＮａＣ１と２２ｇのグルタルアルデヒドとに水を加えて１リツトルとしてなるものである。

７、　モノクローナル抗体で間接標識をなし、溶解し、次いで固定した試料は、グルタルアルデヒドが誘発する自己蛍光の発生の為に、１５分以内に流動細胞計測器で分析しなければならない。試料の濾過、好ましくは３７ミクロンのメツシュを通すことが望ましい。

試料分析；試料は、Ｃ０ｔｌＬＴＥＩＩ　ＥＰＩＣ３Ｖ単一レーザ、流動細胞計測器システムで分析した。このシステムの構成はここに説明するように設定されている。レーザは４８８ｎｒｒｌの放射を５００ｍ　ｗ発生する。好ましいフィルタ構成は緑色蛍光に対する遮蔽フィルタとして作用する５１５干渉と、４８８ｎｍの二色性ミラーと、直角光散乱に対するＭＤＩフィルタと、前方角光散乱に対するＮＤＪフィルタとである。データはコンピュータシステム例えば、Ｃ０ＬＩＬＴＥＲＭＤＡＤＳ　”またはＥ。八。ＳＹ、１■。

で解析した。測定した３つのパラメータは、蛍光度対数と低角光散乱および直角光散乱対数とであった。またこの分析手法は以下の各実施例に対しても利用した。

実施例２細胞調製：溶解並びに固定試薬を３７℃で調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなし得る。

１゜　１．０ｇのＮａＮ３．１．３６　ｇのＫＨ２ＰＯ４，、１，３１ｇのＫｚＨＰＯａおよび３．７３ｇのＫＣｌに水を加えて１リツトル容としてなる標識用希釈剤１００μβ部を１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００μβ を加えた。それから試験管内容物を廻して穏かにかき混ぜた。

２、　非特異的、無標識マウス抗体１０“マイクログラムを添加してモノクローナル抗体の非特異的結合をブロックした。

３、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥモノクローナル抗体Ｔ４−ＦＩＴＣの１マイクログラムを同じ試験管に添加し穏かにかき混ぜた。それから試験管を時折り振盪し乍ら３７℃に保持した水浴中に５分間置いた。

４、次いで４ｇのサポニン、　１．７５ｇのＮａＣ（１、１，３６８のＫＨ２ＰＯ４＝　１゜３１ｇのＫＨ２Ｏ４および２．２４ｇのＫＣｌ１に水を加えて１リツトル容としてなる溶解試薬１００μβを、血液と抗体とを収容した試験管に添加して、水浴中で１分間連続的に攪拌した。

５．１分間溶解の終了時点で、５００μｌの固定試薬を、溶解試料に添加し、穏かにかき混ぜ、更に５分間、時折りかき混ぜ乍ら３７℃の水浴中に保持した。この固定試薬は、１１．７　ｇのＮａＣｌ　、　０．４３　ｇのグルコン酸カルシウム、２１ｇのグリオキサール、　２２０ｇのジメチルスルホキサイドおよび２５ｇのカルボワックス１４５０（Ｃａｒｂｏｗａｘ　１４５０）に、水を加えて１リツトル容としてなるものである。

恰度この時点までに全血はモノクローナル抗体で標識し、溶解し、次いで固定されていた。ここで、ＥＰＩＣ３流動細胞計測器を以って分析する用意ができた。

好ましくは３７ミクロンメツシュを通しての、試料の濾過が望ましい。試料は試料分析に先立って少なくとも５分間、必要ならば氷上約２℃で安定化する。分析は実施例Ｉの終りで述べた通りに行なった。

実施例１のＣ０ＩＪＬＴＥＲＣＬＯＮＥ　モ／クローナルＴ４−ＦＩＴＣに代えて次のＣ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥモノクローナル抗体、即ち−Ｔ８−ＦＩＴＣ；Ｔ１１−ＦＩＴＣ；Ｂｌ−ＦＩＴＣ；Ｍｏ２−ＦＩＴＣの何れかＪつを使用する以外は上記手順に従い、同様な結果を得た。それぞれの場合において、標識された白血球サブクラスは使用した抗体に対し特異性ある白血球であった。

実施例３細胞調製：溶解並びに固定試薬を２４°Ｃで調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなし得る。

１、ｌ５ＯＴＯＮ■Ｐｌｕｓ希釈剤１リフドル中、ＮａＮ３１−０ｇよりなる標識用希釈剤１００μβを１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００μ βを加えた。それから試験管内容物を廻して穏かにかき混ぜた。

２、Ｃ０ＩＪＬＴＥＲＣ１、ＯＮＥモノクローナルＴ４−ＦＴＴＣの１マイクログラム量を同じ試験管に添加し、穏かにかき混ぜ、更に時折り振盪し乍ら、室温（２４℃）で５分間試験前立てに載置した。

３、　次いで、０．５ｇのサポニン、３．７２ｇのＫＣＡ　、　１．３６　ｇのＫ）ＩＺＰＯ，および１．３１　ｇのＫＪＰＯａに水を加えて１リツトル容としてなる溶解試薬１０００μｌを、血液と抗体とを収容した試験管に添加して、３０秒秒間外に渦状に攪拌し、更に毎分穏かにかき混ぜ乍ら、室温（２４℃）で５分間試験前立てに載置した。

４．５分間溶解の終了時点で、１２．６ｇのＮａＣｊｌ！　、　２２０　ｇのジメチルスルホキサイド、２００ｍＪのマースキー試薬および６００ｍｊｌ！のｌ５ＯＴＯＮ　Ｐｌｕｓ希釈剤からなる固定試薬１０００μ間時折りかき混ぜ乍ら、室温（約２４℃）に保持した。マースキー試薬は、米国ニューシャーシー州、サマヴイルのマースキーズ・ナショナル・ダイアグノスチクス（Ｍｉｒｓｋｙ’ 　５Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から商業的に入手し得る。

恰度この時点までに全血はモノクローナル抗体で標識し、溶解し、次いで固定されていた。ＥＰＩＣ５流動細胞計測器を以って分析する用意ができた。好ましくは３７ミクロンメツシュを通しての、試料の濾過が望ましい。

試料は、試料分析に先立って少なくとも五分間、必要ならば氷上で安定化し、実施例１の終りで述べた通りに分析した。

実施例４細胞潤製：溶解並びに固定試薬を４２℃で調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなし得る。

１、ｌ５ＯＴＯＮ　Ｐｌｕｓ希釈剤１リットル中、ＮａＮ：＋　１．０ｇよりなる標識用希釈剤１００μｌを１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００μｌを加えた。それから試験管内容物を廻して穏かにかき混ぜた。

２、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥ　％／　）ｙ　ｏ−ナル抗体Ｔ４−ＦＩＴＣ（７）　４　フィクログラムを同じ試験管に添加し、穏かにかき混ぜ、更に５分間時折り振盪し乍ら、４２℃に維持した水浴中に置いた。

３、　２４ｇのサポニン、４．０ｇのＮａＣ（１、１，０ｇのソルビン酸に水を加えてｌ　Ｕノトルとしてなる溶解試薬を調製した。

次いでこの熔解試薬１０ミリリツトルを、蒸留水中１．３１　ｇのＫＨ２Ｏ４および１゜３６ｇのＫＨ２ＰＯ４よりなる溶解希釈剤１リツトルで希釈した。この混合物１０００μｌを、血液と抗体とを収容した試験管に添加して、試験管を１分間水浴中で連続的に攪拌した。

４．３０秒溶解の終了時点で、１２．６ｇのＮａＣ！！、　２００ｍ　Ｉ！のマースキー試薬、２２０ｇのジメチルスルホキサイドおよび６００ｍ１のｌ５ＯＴＯＮ　Ｐｌｕｓ希釈剤に水を加えて１リツトル容としてなる固定試薬１０００ｕＮを、溶解した試料に添加し、穏かにかき混ぜ、更に５分間時折りかき混ぜ乍ら、４２℃の水浴中に保持した。

恰度この時点までに全血はモノクローナル抗体で標識し、溶解し、次いで固定されていた。ＥＰＩＣＳ流動細胞計測器で分析する用意ができた。好ましくは３７ミクロンメツシュを通しての、試料の濾過が望ましい。

試料は、試料分析に先立、って少なくとも５分間必要ならば氷上で安定化し、実施例１の終りで述べた通りに分析した。

実施例５細胞調製：溶解並びに固定試薬を３７℃で調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなし得る。

１、　１．０ｇのＮａＮ：＋、　１．３６ｇのＸ）ＩｚＰＯｔ、　１．３１ｇのＭ、）ｌＰＯ４および３．７３ｇのＫＣＩに水を加えて１リツトル容としてなる標識用希釈剤１００μβ部を１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００１１７！を加えた。それから試験管内容物を廻し乍ら穏かにかきｌ昆ぜた。

２゜　非特異的、゛無標識マウス抗体１０マイクログラムを添加してモノクローナル抗体の非特異的結合をブロックした。

３、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥモノクローナル抗体Ｔ８〜ＦＴＴＣの１マイクログラムを同じ試験管に添加し穏かにかき混ぜた。それから試験管を時折り振盪し乍ら３７℃に保持した水浴中に５分間置いた。

４、　次いで、４ｇのサポニン、　１．７５ｇのＮａＣｊ！、１．３６　ｇのＸ）１２ＰＯい１．３１　ｇのＭｚＨＰＯａおよび２．２４　ｇのＫＣＰに水を加えて１す７）ル容としてなる溶解試薬１００μβを、血液と抗体とを収容した試験管に添加して、水浴中で１分間連続的に攪拌した。

５６１分間溶解の終了時点で、５００μｌの固定試薬を溶解試料に添加し、穏かにかき混ぜ、更に５分間、時折りかき混ぜ乍ら３７℃の水浴中に保持した。この固定試薬は、１１．７ｇのＮａＣｌ　、　０．４３　ｇのグルコン酸カルシウム、２１ｇのグリオキサール、２２０ｇのジメチルスルホキサイドおよび２５ｇのカルボワックス１４５０に水を加えて１リツトル容としてなるものである。

恰度のこの時点までに、全血は、モノクローナル抗体で標識し、溶解し、次いで固定されていた。ここで、ア・−ル・シー・ライフ（Ｒ，Ｃ，Ｌｅｉｆ）等がクリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　（１９７７年）第２３巻、１４９２−８頁で、またアール・エイ・トーツス（Ｒ，Ａ、Ｔｈｏｍａｓ）等がジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ、Ｈ４ｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　（１９７７年）第２５巻、第７７号、８２７−８３５頁で、Ａ？ｌＡＣＩＩＴとして提寡した原理を使用して、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＶＡを備えたＥＰＩＣ５流動細胞計測器で分析する用意ができた。Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＶＡ”なる名称は、「細胞量付属品Ｊ　（Ｃｅｌｌ　ｖｏｌｕｍｅａｃｃｅｓｓｏｒｙ）を表わし、また粒子検出について周知のクールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の原理を利用した電子的細胞分析装置を使用し且つ流動細胞計測器中に一体化したことを願る単純な言葉で意味するものである。かかる多重パラメータ機器は商業宣伝されている。好ましくは３７ミクロンメツシュを通しての試料の濾過は必須である。

試料は、試料分析に先立って少なくとも５分間、必要ならば氷上で、安定化する。測定したパラメータは、前方角光散乱と直角光散乱とフルオレセイン免疫蛍光と電子的細胞量とであった。

実施例６細胞調製：溶解並びに固定試薬を４２℃で調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなした。

１、ｌ５ＴＯＮ　Ｐｌｕｓ希釈剤１リットル中、ＮａＮ３１ｇよりなる標識用希釈剤１００μｌを１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００μｌを加えた。それから内容物を廻して穏かにかき混ぜた。

２、Ｃ０１ｌＬＴＥＲＣＬＯＮＢモノクローナル抗体Ｔ４−ＦＩＴＣの４マイクログラムを同じ試験管に添加した。試験管を穏かにかき混ぜ、次いで時折り振盪し乍ら、４２℃に維持し′二本浴中に５分間置いた。

３、　次いで０．４ｇのサポニン、０．０５ｇのソルビン酸、１．３６ｇのＫＨ２ＰＯ４，１，３１ｇのに、ＨＰＯ４，３，７２ｇのＫ（Ｊに水を加えて１リツトルとしてなる溶解剤１００μｌを、血液と抗体とを収容した試験管に添加して、水浴中で３０秒間連続的に攪拌した。

４．３０秒溶解の終了時点で、１２．６ｇのＮａＣＩＩ、２２０ｇのジメチルスルホキサイド、２００ｍＡのマースキー試薬および６００ｍｆのｌ５ＯＴＯＮ　Ｐｌｕｓ希釈剤よりなる固定試薬１０００μｌを、溶解した試料に添加し、穏かにかき混ぜ、更に５分間時折りかき混ぜ乍ら４２℃の水浴中に保持した。

恰度この時点までに、全血はモノクローナル抗体で標識し、溶解し、次いで固定されていた。ＥＰＩＣ３流動細胞計測器で分析する用意ができた。好ましくは３７ミクロンメツシュを通しての、試料の濾過が望ましい。試料は、試料分析に先立って少なくとも５分間、必要ならば、氷上で安定化し、実施例１で述べた通りに分析した。

実施例７細胞調製：溶解並びに固定試薬を３７℃で調製した。試薬はこの手順の間を通じて水浴中で冠栓したままとなし得る。

１、　１．０ｇのＮａＮ３．１．３．６ｇのＫＨｚＰＯイ１．３１　ｇのに２ＨＰＯ４および３．７３ｇのＫ（Ｊに水を加えてｌリットル容としてなる標識用希釈剤１００μｌを１６　Ｘ　１００の試験管に入れ、続いて全血１００μβを加えた。それから試験管内容物を廻し乍ら穏かにかき混ぜた。次いでこのものに、１０ｍ１の無水エタノール中、０．０２５ｇの４，９−ジアミへ２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）よりなる染色溶液１０μｌを添加した。

２゜　非特異的無標識マウス抗体ＪＯマイクログラムを添加してモノクローナル抗体の非特異的結合をブロックした。

試験管を穏かにかき混ぜ、それから５分間時折り振盪し乍ら、３７℃に維持した水浴中６ご置いた。

３、Ｃ０ＵＬＴＥＲＣＬＯＮＥモノクローナル抗体Ｔ８−ＦＩＴＣの１マイクログラムを同じ試験管に添加した。試験管を穏かにかき混ぜ、次いで５分間時折り振盪し７乍ら、３７℃に維持した水浴中に置いた。

４３　染料溶液と血液と抗体とを収容した試験管に、１００μβの溶解試薬を添加した。この試薬は、４ｇのサポニン。

１．７５ｇのＮａＣｊ！　、１．３６ｇのＸ）１２ＰＯ，、）、、３１ｇのに、ＨＰＯ，，２，２４ｇのＫＣＡに水を加えて１リツトル容としてなるものである。

試薬を添加した後、試験管を水浴中で１分間連続的に攪拌した。

５．１分間溶解の終了時点で、１１．７　ｇのＮａＣ７！、０．４３　ｇのグルコ〕／酸カルシウム、２１ｇのグリオキサール、２２０ｇのジメチルスルホキサイド、２５ｇのカルボワックスＪ４５０に水を加えて１リツトルとしてなる固定試薬５００μ２を、溶解試料に添加し、穏かにかき混ぜ、更Ｇこ５分間時折りかき混ぜ乍ら３７°Ｃの水浴中に保持した。

恰度この時点までに、全血はモノクローナル抗体Ｔ８−ＦＩＴＣとＤＡＰＩとで標識し、溶解し、次いで固定されていた。それは遠心細胞現象により調製する用意ができた。試料は、試料分析に先立って少なくとも５分間、必要ならば氷上で安定化する。

？、’＋ｆｉＨＵ６１−５０２２８０　（７）６゜　分子量約７００，０００のポリｄ、リジン、、　５０ｍｇよりなるポリ　ｄ、リジン）容量を使用し、スライドをこの７容液中に浸漬し、次いで６０°Ｃに維持したスライド乾燥器上で乾燥することにより、標準顕微鏡スライドを作製した。

７、一対のライフ・セントリフニーガル・サイトロジー（Ｌｅｉｆ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ）バケット（米国特許第４　、２５０　、３８０号）を組立てて、溶解血液試料を１５０Ｏｒｐｍで５分間旋転させた。表面に浮かんだ流体を除去し試料を標識用希釈剤で３回洗浄した。

８、　表面に浮かんだ流体を除去して、スライド上の標識用希釈剤中の細胞をカバーグラスで蔽った。これでスライドは、Ｉ）ＡＰＩに対する水銀アーク紫外線励起およびＦＩＴＣに対する可視光励起を以って顕微鏡試験を行なう用意ができた。

前述の実施例から判るように、相対的容積は血液試料については５０から１００ μβまで、溶解試薬は１００から１０００μｌまで、固定試薬は５００から１０００μｌまで変えることができる。溶解試薬濃度の０．２４から４　ｇ／Ｌおよび固定試薬濃度のＱ、６６　ｇ／ｌ−から４０　ｇ／Ｌば、それらの容量に対し逆の関係となり、すべての先に加えた試薬の容積が増加するにつれて増大させなければならない。また、サポニンの量、０．２４から４．０ｇルは、温度２４℃ から６０℃までと、溶解期間３８秒から５分までとの両方と逆関係にある。また、固定液の量は、試料が形態分析のために長期間貯蔵されるか直ちに使用ささるかに関係する。長期間貯蔵のためには、最大限の固定が必須であるが、殆ど即刻の使用に対しては、往々にして最小限の固定が好ましい。

蔓に述べた解説的態様は、本発明の原則についての実施例を構成するものであるが、当該技術に通常の熟練度を有する者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、数多くの変更を生み出し得るであろうことが明らかである。

第１Ｂ図録色質光戊文士数特大昭６１〜５０２２８０　（８）１′″″″６″″□２ＰＣτノＵＳ８５１００９５４

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞表面の抗原決定基およびその標識抗体との反応性の利用に基いて、全血中の白血球のクラスを、また好ましくは選択されたサブクラスをも同定する方法において、サポニンを含有する溶解試薬を以って所定時間，特定温度条件下に赤血球を溶解し；続いて架橋結合固定試薬を以って所定時間，特定温度条件下に白血球を処理し；それによって白血球の物理的性質を、また好ましくは形態的性質をも維持せしめて白血球同定を可能となすことを特徴とする改良方法。
２．前記標識抗体のそれぞれが蛍光色素と結合した抗体である請求の範囲第１項記載の改良方法。
３．物理的測定の組合せを使用して白血球のクラスを単離し且つ各クラスの蛍光分布を測定する請求の範囲第２項記載の改良方法。
４．前記物理的測定の少なくとも１つが、光散乱、電子的インピーダンス、前方角光散乱と直角光散乱との組合せまたは電子的インピーダンスと直角光散乱との組合せである請求の範囲第３項記載の改良方法。
５．白血球を形態によりクラス別けし、且つ蛍光強度によりサプクラス別けする請求の範囲第３項記載の改良方法。
６．前記固定試薬がグルタルアルデヒドを含有する請求の範囲第１項乃至第５項の何れか１つに記載の改良方法。
７．前記固定試薬が活性成分として非蛍光性ジアルデヒドを含有する請求の範囲第１項乃至第５項の何れか１つに記載の改良方法。
８．前記溶解試薬がサポニンを約０．２４ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌの濃度で含有し；または溶解される試料中においては約０．２ｇ／Ｌ乃至約１．１４ｇ／Ｌ含有する請求の範囲第１項乃至第７項の何れか１つに記載の改良方法。
９．前記溶解温度が約２４℃乃至４２℃である請求の範囲第１項乃至第８項の何れか１つに記載の改良方法。
１０．前記溶解時間が８秒乃至約５分である請求の範囲第１項乃至第９項の何れか１つに記載の改良方法。
１１．赤血球を溶解するに充分であるが白血球を実質的に無傷で残す量のサポニンを含有する溶解試薬と；白血球の物理的性質を、また好ましくは形態的性質をも維持せしめて白血球同定を可能となすような量の架橋結合剤を含有する固定試薬とよりなることを特徴とする特異的抗体を以って標識された白血球のクラスを、また好ましくはサブクラスをも同定するために全血試料に使用する試薬系。
１２．前記固定試薬がグルタルアルデヒドを含有する請求の範囲第１１項記載の試薬系。
１３．前記固定試薬が活性成分として非蛍光性ジアルデヒドを含有する請求の範囲第１１項記載の試薬系。
１４．白血球を染色する少なくとも１種の染料を含む請求の範囲第１１項乃至第１３項の何れか１つに記載の試薬系。
１５．前記溶解試薬がサポニンを約０．２４ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌの濃度で；または溶解される試料中においては約０．２ｇ／Ｌ乃至約１．１４ｇ／Ｌ含有する請求の範囲第１１項乃至第１４項の何れか１つに記載の試薬系。
１６．抗体が白血球を標識するために蛍光色素に結合するものである請求の範囲第１１項項乃至第１５項の何れか１つに記載の試薬系。